Временная Отслеживание клеточного цикла прогрессии Использование проточной цитометрии без необходимости синхронизации

Summary

Этот протокол описывает использование бромдезоксиуридин (BrdU) поглощения, чтобы разрешить временную отслеживание клеток, которые были в S фазе на определенный момент времени. Добавление красителей ДНК и маркировки антител способствует детальный анализ судьбы S фазовых клеток в более поздние времена.

Abstract

Этот протокол описывает метод, позволяющий отслеживать клетки на протяжении всего клеточного цикла без необходимости синхронизации клеток. Достижение синхронизации ячеек может быть затруднено для многих клеточных систем. Стандартная практика заключается в том, чтобы блокировать прогрессию клеточного цикла на определенной стадии, а затем высвобождать накопленные клетки, создавая волну клеток, проходящих через цикл в унисон. Тем не менее, некоторые типы клеток считают этот блок токсичным, что приводит к аномальному круговороту клеток или даже массовой гибели. Поглощение бромоксиуридина (BrdU) может быть использовано для отслеживания стадии клеточного цикла отдельных клеток. Клетки включают этот синтетический аналог тимидина, синтезируя новую ДНК во время S-фазы. Предоставляя BrdU в течение короткого периода времени, можно отметить пул клеток, которые находились в S-фазе, пока присутствовал BrdU. Затем эти клетки могут быть прослежены на протяжении оставшейся части клеточного цикла и в следующем раунде репликации, что позволяет определить продолжительность фаз клеточного цикла без необходимости индуцировать потенциально токсичную блокировку клеточного цикла. Также можно определить и соотнести экспрессию как внутренних, так и внешних белков на последующих этапах клеточного цикла. Они могут быть использованы для дальнейшего уточнения определения стадии клеточного цикла или оценки влияния на другие клеточные функции, такие как активация контрольных точек или гибель клеток.

Introduction

Оценка возможностей клеточного цикла и изменений, которые происходят в клетках в течение клеточного цикла является фундаментальным для понимания многих аспектов биологии, в частности биологии рака. Многие агенты в развитии для лечения злокачественных опухолей оказывают глубокое воздействие на прогрессирование клеточного цикла или индуцируют гибель клеток с помощью клеточного цикла зависимых механизмов-. С целью изучения динамики клеточного цикла или клеток в определенной фазе клеточного цикла, обычно для синхронизации клеток. Однако методы синхронизации может иметь пагубные последствия для клеток изучаются, потенциально сомнительных полученные результаты. ¹

Protocol

Протокол, описанный здесь, использует острый лимфобластный лейкоз линию клеток NALM6 но может быть применено к другим типам клеток.

1. Решения и реагенты

1. Полный RPMI
   1. Добавить 56 мл фетальной телячьей сыворотки (FCS) и 5,5 мл 200 мМ L-глутамина в 500 мл бутылку среде RPMI-1640.
2. BrdU со Решение
   1. Подготовьте 32,5 мМ BrdU (10 мг / мл) в Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором (DPBS).
3. BrdU Полный RPMI
   1. Добавить 6,2 мкл исходного раствора BrdU в 10 мл полной среды RPMI.
4. ДНКазы решение
   1. Подготовьте 1 мг / мл ДНКазы в DPBS.

Results

Эта методика может быть использована для получения различной информации. Через несколько приложений изложены здесь.

Оценка длительности клеточного цикла

Чтобы определить время, необходимое для клеток транзит через клеточного цикла, клетки собирают в различные моменты времени после импульса BrdU. Интервалы между оценками может быть приспособлено к конкретным клеткам анализируемых. Кроветворных клеточные линии были оценены каждый час в течение 24 ч в отсутствие как.......

Discussion

Способность к анализу клеточного цикла имеет важное значение для понимания биологии рака и механизма действия обоих препаратов и генов, которые влияют на пролиферацию и рост клеток. В то время как есть множество анализов, которые, как сообщается измерения пролиферации клеток, большинство только обеспечить меру, указывает количество клеток присутствуют. Они включают в себя анализы, которые измеряют количество клеток по прямой визуализации и подсчета, метаболической активности или АТФ концентрации. Основным преимуществом .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Набор APC BrdU Flow Kit	BD Biosciences	552598	содержит антитела BrdU, 7-AAD и буфер BD Cytofix/Cytoperm (далее – фиксирующий буфер)
BD Cytoperm Perm Perm Perm Buffer Plus	BD Biosciences	561651	– буфер перманентизации
BD Perm/Wash Buffer	BD Biosciences	554723	– промывочный буфер
DNаза	Sigma	D-4513
BD Falcon 12 x 75  мм FACS пробирки	BD Biosciences	352008
BD Pharmingen Stain Buffer	BD Biosciences	554656
BD LSR FORTESSA проточный цитометр	BD Biosciences	FORTESSA
Pipetman	Gilson	P2, P20, P100, P1000
RPMI 1,640 без L-Gln 500 мл	Lonza	12-167F
DPBS	Lonza	17-512F
Фетальная бычья сыворотка	FisherBiotec	FBS-7100113
L-глютамин	Sigma	G7513-100ML
5-бромо-2′-дезоксиуридин	Sigma	B5002-1G
Falcon TC 150  см<суп>2 вентилируемые колбы	BD Biosciences	355001
пипетки 25  ml	Greiner	760180
Пипетки Aersol 200  &микро; l	Interpath	24700
Пипетки Aersol 1  ml	Interpath	24800
Центрифуга	Spintron	GT-175R
CO2 инкубатор	Binder	C 150
AF488 антигистон H3 Phospho (Ser10) Антитело	Cell Signalling	9708S
Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb	Cell Signalling	2197S
Phospho-Chk1 (Ser345) ( 133D3) Сигнализация кроличьих mAb	клеток	2348S
NALM6	ДСМЗ	АСС-128