Сайленсинг генов с помощью миРНК представляет собой удобную экспериментальную стратегию для анализа BRCA2-зависимых биологических функций с немедленными последствиями для лучшего понимания биологии рака. Представлен метод эффективного подавления BRCA2, а также экспериментальная процедура обнаружения и количественной оценки изменений экспрессии белка BRCA2 методом иммуноблоттинга в клеточных линиях человека.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Подавление в BRCA2 белка-супрессора опухоли и ее детектирования обычными биохимических анализов представляют собой большую техническую проблему из-за большого размера человеческого белка BRCA2 (приблизительно 390 кДа). Мы сообщаем модификации стандартных киРНК трансфекции и иммуноблоттинга протоколов, чтобы заставить замолчать человека BRCA2 и выявления эндогенной BRCA2 белок, соответственно, в клеточных линиях человека эпителиальных. Основные шаги включают в себя высокую миРНК соотношение реагентов трансфекции и два последующих раундов миРНК трансфекции в пределах того же эксперимента. Используя эти и другие модификации стандартного протокола мы последовательно достичь более 70% молчание гена BRCA2 человека, о чем судили с помощью иммуноблоттинга анализ с анти-антителами BRCA2. Кроме того, денатурации клеточных лизатов при 55 ° С вместо обычных 70-100 ° С и других технических оптимизации процедуры иммуноблоттинга позволяют обнаружение интактного белка BRCA2 даже WHан очень низких количеств исходного материала доступны, или когда уровни экспрессии белка BRCA2 очень низки. Эффективное глушение BRCA2 в клетках человека предлагает ценную стратегию, чтобы разрушить функцию BRCA2 в клетках с интактным BRCA2, в том числе опухолевых клеток, для изучения новых молекулярных путей и клеточные функции, которые могут быть затронуты патогенных мутаций BRCA2 в опухоли. Адаптация этого протокола для эффективного молчания и анализа других «больших» белков, таких как BRCA2 должны быть легко достижимы.
Введение
BRCA2 (рак молочной железы ген восприимчивости-2) ген кодирует белок-супрессор опухоли, который играет решающую роль в восстановлении ДНК двухцепочечной разрывы путем регулирования функцию рекомбиназы фермента Rad51 1. BRCA2 также вовлечен в модулирование транскрипции и в контроле клеточного цикла 2. Зародышевой линии мутации в гене BRCA2 вызывают аутосомно-доминантный восприимчивость к рака груди и яичников у женщин и рака простаты у мужчин, а также предрасположенность к другим типам рака 3,4. Тем не менее, несмотря на повышенный риск развития рака в BRCA2 мутации, которые подавляют или уменьшить функцию BRCA2 может оказать раковые клетки более уязвимыми для химиотерапевтических агентов, которые вызывают повреждение ДНК 5-7. Отдельные виды рака обладают низкой скорости BRCA2 мутации (<3%), хотя более низкие уровни белка BRCA2 были обнаружены в некоторых видах рака, предполагая, что BRCA2 белокмогут быть потеряны во время онкогенеза в спорадических рака через не-мутационный-зависимых механизмов 7,8. Таким образом, важно, чтобы полностью понять функции BRCA2 в контексте биологии рака, а также в других биологических параметрах.
Мощный инструмент, используемый для идентификации новых функций гена в клетках млекопитающих является, чтобы заглушить ее экспрессию. В качестве примера, глушителей BRCA2 выражение в различных нормальных эпителиальных клеток недавно привели к идентификации нового функцией BRCA2 как регулятора сопротивления anoikis, важный шаг в процессе приобретения раковых клеток инвазивного и метастатического способности 9. Молчание генов может быть достигнуто путем введения в клетки либо мала вмешательства (SI) РНК или короткое шпильки (SH) молекулы РНК, нацеленные на конкретный ген. Высокая активность миРНК и простота в использовании делают его преимущественное инструмент для глушителей эксперименты, направленные на получение новых идей в критических биологических процессовго по идентификации новых терапевтических мишеней. Тем не менее, эффективность нокдаун экспрессии генов может быть легко достижимо для всех генов и может быть сильно варьирует в зависимости от типа клеток. Потому что снижение внутриклеточного уровня белка является наиболее актуальны фенотип под следствием, он имеет решающее значение для количественной оценки гена молчание иммуноблоттингом анализ генного продукта. С этой связи, белок BRCA2 представляет собой еще одну проблему: быть большой белок (примерно 390 кДа), технические трудности существуют для обычного биохимического анализа, в том числе иммуноблоттинга.
Мы сообщаем здесь протокол, оптимизированный для эффективного глушителей BRCA2 в клеточных линиях человека эпителиальных и для быстрого и успешного обнаружения BRCA2 белка нокдаун иммуноблоттингом анализ.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Готовят растворы миРНК
- Ресуспендируют 5 нмоль зашифрованным (Ctrl) и 5 нмоль BRCA2 миРНК высушенных гранул в 100 мкл РНКазы воды (конечная концентрация миРНК: 50 мкм). Это запас миРНК и должны храниться при -20 ° C в 10 мкл аликвоты.
- Возьмем аликвоту 10 мкл из запаса миРНК и добавить 40 мкл РНКазы свободной воды, чтобы получить рабочий раствор 10 мкМ миРНК. Это разбавление необходимо хранить при температуре -20 ° С до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: рабочий раствор миРНК не должны подвергаться замораживанию / размораживания более чем в 3 раза.
2. Посев человека эпителиальных клеточных линиях
- Удалить ростовой среды из эпителиальных клеточных линий человека растущих в клеточных монослоев в тканевых культуральных планшетах в увлажненном инкубаторе при 37 ° С, 5% СО 2.
- Промыть клетки в тарелке с раз RT PBS (10 мл PBS для 100 мм пластины).
- Для отделения клеток от пластины,добавляют 2 мл 0,25% трипсина / 0,53 мМ раствора ЭДТА и инкубировать 3-5 мин в зависимости от типа клеток.
- Перед сбором отдельные клетки, нейтрализации трипсина добавлением 2 мл полной среды для роста, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки.
- Передача клеток в 15 мл пробирку.
- Центрифуга клеток при 320-330 мкг в течение 3 мин при 4 ° С в роторе Бакет.
- Ресуспендируют клеточный пеллет в 5 мл антибиотиков среде без.
- Граф клеток под микроскопом в камере Бюркера или с помощью автоматизированной системы подсчета в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Семенной клеток в 6-луночных планшетах, что около 80% сплошности, после 24 часов (0,5-1 x10 6 клеток в 2 мл среды для каждой лунки). Оптимальное количество клеток, чтобы быть посеяны может изменяться в зависимости от конкретных клеточных линий и скорости роста.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте антибиотики в среде в данный момент, потому что антибиотики негативно влиять на эффективность transfeие. Очень важно, что клетки при низких проходов культуры (<10) для достижения высокой эффективности трансфекции миРНК BRCA2.
3. трансфекции клеток с миРНК
- Двадцать четыре часа после посева клеток, переходите с первого раунда трансфекции.
- Развести 6 мкл липидного основе 10 siРНК, специфичную реагента для трансфекции в 130 мкл восстановленного среде сыворотки.
- Развести 3 мкл 10 мкМ миРНК (30 пмоль) в 130 мкл восстановленного среде сыворотки.
- Смешайте разбавленный миРНК разбавленным трансфекции реагента и инкубировать в течение 5-10 мин при комнатной температуре.
- Во время инкубации, удалить носитель из клеток и добавить 2 мл свежей среды, предварительно нагретой при 37 ° С (без антибиотиков).
- Добавить 250 мкл миРНК-реагента для трансфекции комплексов к клеткам (эта сумма для одной лунке 6-луночного планшета с).
- Инкубируйте клетки в увлажненном инкубаторе при 3776; С с 5% СО 2.
- После 24 часов, приступить втором туре трансфекции, повторяя шаги 3.1.1-3.1.5 со следующей модификацией для шага 3.1.2: разбавить 5 мкл 10 мкМ миРНК (50 пмоль) в 130 мкл восстановленного среды в сыворотке крови.
- Инкубируйте клетки в течение 1-2 дней при 37 ° С перед анализом.
Примечание: Два раунда трансфекции и использование соотношении реагентов высокой миРНК / трансфекции во втором туре необходимы, чтобы получить высокую эффективность BRCA2 молчания.
- Инкубируйте клетки в течение 1-2 дней при 37 ° С перед анализом.
4. Lyse клетки для анализа иммуноблоттинга
- Приготовьте свежий лизирующего буфера с PBS (рН 7,4), содержащего 1% неионных, неденатурирующем моющего октилфеноксиполиэтоксиэтанол, 5 мМ пирофосфата натри, 1 мМ ортованадат натрия, 10 мМ фторид натрия, 2 мМ фенилметилсульфонилфторида, 10 мкг / мл лейпептина, 10 мкг / мл апротинина. Держите его на льду.
- Удалить среду из клеток и Wпепел их один раз холодным PBS (2 мл / лунку) в пластине. Для предотвращения уноса PBS, полностью удалить его из пластины.
- Добавить 200 мкл буфера для лизиса в каждую лунку.
Примечание: Если клетки должны быть использованы и для других анализов, Trypsinize клетки, как описано в шаге 2.1-2.6 и ресуспендирования клеток в соответствующем буфере / среде в соответствии с применением, которые будут использоваться. - Осторожно повернуть пластину, чтобы равномерно распределить лизирующего буфера и инкубируют в течение 15 мин при 4 ° С на ротатора.
- Собирают клеточный лизат в микроцентрифужных трубки на льду с помощью мобильного скребок.
- Центрифуга при 17900 х г в течение 25 мин при 4 ° С и собирают супернатант в новую пробирку.
- Измерьте концентрацию белка, используя имеющийся в продаже анализа белка в соответствии с инструкциями изготовителя.
5. BRCA2 анализ иммуноблотинг
- Подготовьте работает буфер разбавления 50 мл 20x Трис-ацетат SDS работает бuffer (50 мМ Трицин, 50 мМ Трис-основание, 0,1% SDS, рН 8,24) с 950 мл дистиллированной воды.
- Подготовка образца следующим образом: добавить 15 мкг общего клеточного лизата, 5 мкл 4х буфера для образцов, содержащих сульфат лития додецил при рН 8,4, 2 мкл 10Х образца восстановителем (0,5 М DTT) и буфера для лизиса до конечного объема 20 мкл.
Примечание: Этот протокол позволяет обнаруживать BRCA2 в нормальных клеточных линиях также при использовании меньшего количества суммарных белков (до 5 мкг). - Денатурации образцов при 55 ° С в течение 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы использовать 55 ° C. Так BRCA2 белок термочувствительный 11, выше денатурации температура приводит к последовательной потере неповрежденной полной длины (390 кДа) BRCA2 белка. - Установите камеру электрофоретическую в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Загрузите образцы и 10 мкл с высокой молекулярной массой предварительно окрашенных белкового стандарта на precasted геля (Трис-ацетат 3-8%) и работать на 120 В для ABиз 2 ч 12. Остановите электрофоретическую пробег, прежде чем 55 кДа синий маркер оставляет precasted гель.
- Подготовка буфера передачи 50 мл 20x буфера передачи, 100 мл 100% метанола и 850 мл воды.
- Активация PVDF мембрану (размер пор 0,45 мкм) путем замачивания в 100% метаноле в течение 5 мин, промыть дистиллированной водой и уравновешивают в буфере передачи, по меньшей мере в течение 5 мин. Замачивание губки передачи аппарата в буфере передачи при 4 ° С до использования.
- При электрофоретического запустить закончилась, собрать бутерброд в стеке передачи в следующем порядке (снизу вверх): три губки, насыщенные в передаче буфера, один сорт 3 мм лист бумаги насыщен передачи буфера, геля, активированного PVDF мембрану, один 3ММ оценка лист бумаги насыщен передачи буфера, три губки насыщен передачи буфера 13,14. Поместите стопку в устройство и передача белков при 350 мА в течение 4 ч при 4 ° С или при 180 мА в течение ночи при 4 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ: Существо BRCA2 очень большой белок, важно, чтобы продлить время передачи от 1 часа (как было предложено производителем и большинство протоколов передачи) до 4 часов или на ночь, чтобы обеспечить полную передачу белков высокой молекулярной массой. Кроме того, из-за длительного времени передачи, важно, чтобы выполнить блоттинга в холодной комнате при 4 ° С, чтобы свести к минимуму перегрев и облегчить сэндвич разборки. Полусухие системы передачи не хорошо для передачи больших белков. - После передачи, мыть мембрану с TBS, блокируют его в течение 1 часа при комнатной температуре в TBS-Tween 0,25% (TBS-T), содержащей 5% обезжиренное сухое молоко и зонд в течение ночи при 4 ° С с 30 мкл анти-BRCA2 поликлональное антитело кролика ( 200 мкг / мл), разводили в 9 мл ТБС-Т + 5% обезжиренное сухое молоко [1: 300 (объем / объем) разбавления].
- Промыть мембраны три раза (10 мин каждый) с TBS-T, затем инкубируют фильтр в течение 1 часа с 1 мкл конъюгированного с пероксидазой хрена анти-кроличьего вторичного антитела разбавленных в 10 мл TBS-T + 5% обезжиренное сухое молоко. После этого промойте мембрану три раза (10 минут каждый) с TBS-T.
- Выполните иммунологического по ECL выявить BRCA2 белок с помощью усиленной хемилюминесценции (ECL) Вестерн-блоттинга обнаружения реагента, следуя инструкциям изготовителя. Представьте immunochemiluminescent полосы на высокой разрешающей ECL фильмов.
- Выполнение иммунологического с антителом для гена домашнего хозяйства, как β-тубулина (55 кДа), в тот же фильтр в качестве контроля загрузки с помощью моноклонального антитела к β-тубулина разбавленный в соотношении 1: 1000 (10 мкл анти-тубулина антителами в 10 мл ТБС-Т + 5% обезжиренное сухое молоко) в течение 1 ч при комнатной температуре. Промыть и инкубируют вторичное антитело, как описано в BRCA2 (5.10-5.11), для использования конъюгированного с пероксидазой хрена анти-мыши вместо анти-кроличьего вторичного антитела, за исключением.
- Приобретите цифровое изображение фильмов впечатлен immunochemiluminescent полос и анализа интенсивности полосы программного обеспечения для анализа изображений выделенный (например,., ImageJ).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Прежде чем приступить к биологической / биохимической анализе для изучения влияния BRCA2 молчания на клеточных функций, первым шагом является подтверждение специфичности молчания, используя зашифрованный миРНК (ненацеливании миРНК) бок о бок с BRCA2 миРНК (рис 1A ). Важно выполнить второй раунд миРНК трансфекции с высокой степенью миРНК / трансфекции, чтобы получить высокую эффективность BRCA2 молчания. Действительно, выполняя только один раунд миРНК трансфекции или с использованием ме...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Потому что зародышевые мутации гена BRCA2 приводят к увеличению риска некоторых видов рака, в том числе женского и мужского рака молочной железы, рака яичников, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, меланомы и 3,4, ряд исследований были предприняты, чтобы понять биологическую функцию белка BRCA2. Большинство из этих исследований являются генетическими основе, главным образом, из-за технических трудностей в анализе гигантский белок BRCA2, как. Метод, описанный здесь для глушителей и а...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами FIRB-Merit RBNE08YFN3_005 и RBNE08HWLZ_012, а также Министерством экономики и финансов Италии для CNR для проекта "FaReBio di Qualità".
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| BRCA2 siRNA | Dharmacon | L-003462-00 | SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA |
| Ctrl siRNA | Dharmacon | D-001810-10-05 | ON-TARGETplus Реагент для нецелевого пула |
| липофектамина RNAiMAX | Life Technologies | 13778075Реагент | трансфекции |
| OPTI-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | Среда для процедуры трансфекции |
| NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 мм Гель сборный | Life Technologies | EA0378 | Гель для электрофореза белка |
| NuPAGE LDS Образец буфера | Life Technologies | NP0007 | Реагент для электрофореза белка |
| NuPAGE Sample Redagent (10x) | Life Technologies | NP0004 | Реагент для электрофореза белка |
| NuPAGE Antioxidant | Life Technologies | NP0005 | Реагент для электрофореза белка |
| HiMark Предварительно окрашенный белок стандарт | Life Technologies | LC5699 | Предварительно окрашенный маркер для геля электрофорез |
| XCell SureLoc Mini-Cell System | Life Technologies | EI0002 | Оборудование для электрофореза/переноса белков |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Life Technologies | LA0041 | Реагент для вестерн-блоттинга |
| PVDF мембрана | Millipore | IPVH00010 | Реагент для вестерн-блоттинга |
| NuPAGE Transfer Buffer | Life Technologies | NP0006-1 | Реагент для вестерн-блоттинга |
| BRCA2 H-300 кроличье поликлональное антитело | Santa Cruz Biotechnology | sc-8326 | 1:300 разведение |
| Бета-тубулин моноклональное антитело | Sigma Aldrich | T4026-100UL | 1:1,000 разведение |
| обезжиренного сухого молока | Sigma Aldrich | 70166 | Реагент для вестерн-блоттинга |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | Реагент для вестерн-блоттинга |
| SuperSignal West Pico/Femto Хемилюминесцентный субстрат | Pierce Thermo Scientific | 34080/34096 | Хемилюминесцентная система |
| PNT1A клетки | SIGMA Aldrich (для ECACC) | 95012614 | PNT1A человек, нормальный эпителий предстательной железы увековечен с помощью клеток SV40 |
| Nthy | SIGMA Aldrich (для ECACC) | 90011609 | Nthy-ori 3-1 Клеточная линия человека, клетки фолликулярного эпителия щитовидной железы |
| Пролиферация клеток Kit I (MTT) | Roche | 11465007001 | Набор для анализа пролиферации клеток |
Ссылки
- Thorslund, T., West, S. C. BRCA2: a universal recombinase regulator. Oncogene. 26, 7720-7730 (2007).
- Yoshida, K., Miki, Y. Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage. Cancer Sci. 95, 866-871 (2004).
- Martin, A. M., et al. Germline mutations in BRCA1 and BRCA2 in breast-ovarian families from a breast cancer risk evaluation clinic. J Clin Oncol. 19, 2247-2253 (2001).
- Castro, E., Eeles, R. The role of BRCA1 and BRCA2 in prostate cancer. Asian J Androl. 14, 409-414 (2012).
- Vencken, P. M., et al. Chemosensitivity and outcome of BRCA1- and BRCA2-associated ovarian cancer patients after first-line chemotherapy compared with sporadic ovarian cancer patients. Ann Oncol. 22, 1346-1352 (2011).
- Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434, 917-921 (2005).
- Arbini, A. A., et al. Mitochondrial DNA depletion sensitizes cancer cells to PARP inhibitors by translational and post-translational repression of BRCA2. Oncogenesis. 2, e82(2013).
- Yang, F., Guo, X., Yang, G., Rosen, D. G., Liu, J. AURKA and BRCA2 expression highly correlate with prognosis of endometrioid ovarian carcinoma. Mod Pathol. 24, 836-845 (2011).
- Guaragnella, N., Marra, E., Galli, A., Moro, L., Giannattasio, S. Silencing of BRCA2 decreases anoikis and its heterologous expression sensitizes yeast cells to acetic acid-induced programmed cell death. Apoptosis. 19, 1330-1341 (2014).
- Mahato, R. I., Rolland, A., Tomlinson, E. Cationic lipid-based gene delivery systems: pharmaceutical perspectives. Pharm Res. 14, 853-859 (1997).
- Su, L. K., et al. Characterization of BRCA2: temperature sensitivity of detection and cell-cycle regulated expression. Oncogene. 17, 2377-2381 (1998).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 4350-4354 (1979).
- Burnette, W. N. ' 'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).
- Hunter, F. W., et al. Dual targeting of hypoxia and homologous recombination repair dysfunction in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. , (2014).
- Drew, Y., et al. Therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor AG014699 in human cancers with mutated or methylated BRCA1 or BRCA2. J Natl Cancer Inst. 103, 334-346 (2011).
- Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434, 913-917 (2005).
- Ihnen, M., et al. Therapeutic potential of the poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib for the treatment of sporadic human ovarian cancer. Mol Cancer Ther. 12, 1002-1015 (2013).
- Jeong, J. H., Jo, A., Park, P., Lee, H., Lee, H. O. Brca2 Deficiency Leads to T Cell Loss and Immune Dysfunction. Mol Cells. , (2015).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
