Методическая статья

Подавление

9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52849

⸱

12 августа 2015 г.

 ,  , 
1Institute of Biomembranes and Bioenergetics, National Research Council

В этой статье

Краткое содержание

Сайленсинг генов с помощью миРНК представляет собой удобную экспериментальную стратегию для анализа BRCA2-зависимых биологических функций с немедленными последствиями для лучшего понимания биологии рака. Представлен метод эффективного подавления BRCA2, а также экспериментальная процедура обнаружения и количественной оценки изменений экспрессии белка BRCA2 методом иммуноблоттинга в клеточных линиях человека.

Аннотация

Подавление в BRCA2 белка-супрессора опухоли и ее детектирования обычными биохимических анализов представляют собой большую техническую проблему из-за большого размера человеческого белка BRCA2 (приблизительно 390 кДа). Мы сообщаем модификации стандартных киРНК трансфекции и иммуноблоттинга протоколов, чтобы заставить замолчать человека BRCA2 и выявления эндогенной BRCA2 белок, соответственно, в клеточных линиях человека эпителиальных. Основные шаги включают в себя высокую миРНК соотношение реагентов трансфекции и два последующих раундов миРНК трансфекции в пределах того же эксперимента. Используя эти и другие модификации стандартного протокола мы последовательно достичь более 70% молчание гена BRCA2 человека, о чем судили с помощью иммуноблоттинга анализ с анти-антителами BRCA2. Кроме того, денатурации клеточных лизатов при 55 ° С вместо обычных 70-100 ° С и других технических оптимизации процедуры иммуноблоттинга позволяют обнаружение интактного белка BRCA2 даже WHан очень низких количеств исходного материала доступны, или когда уровни экспрессии белка BRCA2 очень низки. Эффективное глушение BRCA2 в клетках человека предлагает ценную стратегию, чтобы разрушить функцию BRCA2 в клетках с интактным BRCA2, в том числе опухолевых клеток, для изучения новых молекулярных путей и клеточные функции, которые могут быть затронуты патогенных мутаций BRCA2 в опухоли. Адаптация этого протокола для эффективного молчания и анализа других «больших» белков, таких как BRCA2 должны быть легко достижимы.

Введение

BRCA2 (рак молочной железы ген восприимчивости-2) ген кодирует белок-супрессор опухоли, который играет решающую роль в восстановлении ДНК двухцепочечной разрывы путем регулирования функцию рекомбиназы фермента Rad51 1. BRCA2 также вовлечен в модулирование транскрипции и в контроле клеточного цикла 2. Зародышевой линии мутации в гене BRCA2 вызывают аутосомно-доминантный восприимчивость к рака груди и яичников у женщин и рака простаты у мужчин, а также предрасположенность к другим типам рака 3,4. Тем не менее, несмотря на повышенный риск развития рака в BRCA2 мутации, которые подавляют или уменьшить функцию BRCA2 может оказать раковые клетки более уязвимыми для химиотерапевтических агентов, которые вызывают повреждение ДНК 5-7. Отдельные виды рака обладают низкой скорости BRCA2 мутации (<3%), хотя более низкие уровни белка BRCA2 были обнаружены в некоторых видах рака, предполагая, что BRCA2 белокмогут быть потеряны во время онкогенеза в спорадических рака через не-мутационный-зависимых механизмов 7,8. Таким образом, важно, чтобы полностью понять функции BRCA2 в контексте биологии рака, а также в других биологических параметрах.

Мощный инструмент, используемый для идентификации новых функций гена в клетках млекопитающих является, чтобы заглушить ее экспрессию. В качестве примера, глушителей BRCA2 выражение в различных нормальных эпителиальных клеток недавно привели к идентификации нового функцией BRCA2 как регулятора сопротивления anoikis, важный шаг в процессе приобретения раковых клеток инвазивного и метастатического способности 9. Молчание генов может быть достигнуто путем введения в клетки либо мала вмешательства (SI) РНК или короткое шпильки (SH) молекулы РНК, нацеленные на конкретный ген. Высокая активность миРНК и простота в использовании делают его преимущественное инструмент для глушителей эксперименты, направленные на получение новых идей в критических биологических процессовго по идентификации новых терапевтических мишеней. Тем не менее, эффективность нокдаун экспрессии генов может быть легко достижимо для всех генов и может быть сильно варьирует в зависимости от типа клеток. Потому что снижение внутриклеточного уровня белка является наиболее актуальны фенотип под следствием, он имеет решающее значение для количественной оценки гена молчание иммуноблоттингом анализ генного продукта. С этой связи, белок BRCA2 представляет собой еще одну проблему: быть большой белок (примерно 390 кДа), технические трудности существуют для обычного биохимического анализа, в том числе иммуноблоттинга.

Мы сообщаем здесь протокол, оптимизированный для эффективного глушителей BRCA2 в клеточных линиях человека эпителиальных и для быстрого и успешного обнаружения BRCA2 белка нокдаун иммуноблоттингом анализ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Готовят растворы миРНК

  1. Ресуспендируют 5 нмоль зашифрованным (Ctrl) и 5 нмоль BRCA2 миРНК высушенных гранул в 100 мкл РНКазы воды (конечная концентрация миРНК: 50 мкм). Это запас миРНК и должны храниться при -20 ° C в 10 мкл аликвоты.
  2. Возьмем аликвоту 10 мкл из запаса миРНК и добавить 40 мкл РНКазы свободной воды, чтобы получить рабочий раствор 10 мкМ миРНК. Это разбавление необходимо хранить при температуре -20 ° С до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: рабочий раствор миРНК не должны подвергаться замораживанию / размораживания более чем в 3 раза.

2. Посев человека эпителиальных клеточных линиях

  1. Удалить ростовой среды из эпителиальных клеточных линий человека растущих в клеточных монослоев в тканевых культуральных планшетах в увлажненном инкубаторе при 37 ° С, 5% СО 2.
  2. Промыть клетки в тарелке с раз RT PBS (10 мл PBS для 100 мм пластины).
  3. Для отделения клеток от пластины,добавляют 2 мл 0,25% трипсина / 0,53 мМ раствора ЭДТА и инкубировать 3-5 мин в зависимости от типа клеток.
  4. Перед сбором отдельные клетки, нейтрализации трипсина добавлением 2 мл полной среды для роста, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки.
  5. Передача клеток в 15 мл пробирку.
  6. Центрифуга клеток при 320-330 мкг в течение 3 мин при 4 ° С в роторе Бакет.
  7. Ресуспендируют клеточный пеллет в 5 мл антибиотиков среде без.
  8. Граф клеток под микроскопом в камере Бюркера или с помощью автоматизированной системы подсчета в соответствии с инструкциями изготовителя.
  9. Семенной клеток в 6-луночных планшетах, что около 80% сплошности, после 24 часов (0,5-1 x10 6 клеток в 2 мл среды для каждой лунки). Оптимальное количество клеток, чтобы быть посеяны может изменяться в зависимости от конкретных клеточных линий и скорости роста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте антибиотики в среде в данный момент, потому что антибиотики негативно влиять на эффективность transfeие. Очень важно, что клетки при низких проходов культуры (<10) для достижения высокой эффективности трансфекции миРНК BRCA2.

3. трансфекции клеток с миРНК

  1. Двадцать четыре часа после посева клеток, переходите с первого раунда трансфекции.
    1. Развести 6 мкл липидного основе 10 siРНК, специфичную реагента для трансфекции в 130 мкл восстановленного среде сыворотки.
    2. Развести 3 мкл 10 мкМ миРНК (30 пмоль) в 130 мкл восстановленного среде сыворотки.
    3. Смешайте разбавленный миРНК разбавленным трансфекции реагента и инкубировать в течение 5-10 мин при комнатной температуре.
    4. Во время инкубации, удалить носитель из клеток и добавить 2 мл свежей среды, предварительно нагретой при 37 ° С (без антибиотиков).
    5. Добавить 250 мкл миРНК-реагента для трансфекции комплексов к клеткам (эта сумма для одной лунке 6-луночного планшета с).
    6. Инкубируйте клетки в увлажненном инкубаторе при 3776; С с 5% СО 2.
  2. После 24 часов, приступить втором туре трансфекции, повторяя шаги 3.1.1-3.1.5 со следующей модификацией для шага 3.1.2: разбавить 5 мкл 10 мкМ миРНК (50 пмоль) в 130 мкл восстановленного среды в сыворотке крови.
    1. Инкубируйте клетки в течение 1-2 дней при 37 ° С перед анализом.
      Примечание: Два раунда трансфекции и использование соотношении реагентов высокой миРНК / трансфекции во втором туре необходимы, чтобы получить высокую эффективность BRCA2 молчания.

4. Lyse клетки для анализа иммуноблоттинга

  1. Приготовьте свежий лизирующего буфера с PBS (рН 7,4), содержащего 1% неионных, неденатурирующем моющего октилфеноксиполиэтоксиэтанол, 5 мМ пирофосфата натри, 1 мМ ортованадат натрия, 10 мМ фторид натрия, 2 мМ фенилметилсульфонилфторида, 10 мкг / мл лейпептина, 10 мкг / мл апротинина. Держите его на льду.
  2. Удалить среду из клеток и Wпепел их один раз холодным PBS (2 мл / лунку) в пластине. Для предотвращения уноса PBS, полностью удалить его из пластины.
  3. Добавить 200 мкл буфера для лизиса в каждую лунку.
    Примечание: Если клетки должны быть использованы и для других анализов, Trypsinize клетки, как описано в шаге 2.1-2.6 и ресуспендирования клеток в соответствующем буфере / среде в соответствии с применением, которые будут использоваться.
  4. Осторожно повернуть пластину, чтобы равномерно распределить лизирующего буфера и инкубируют в течение 15 мин при 4 ° С на ротатора.
  5. Собирают клеточный лизат в микроцентрифужных трубки на льду с помощью мобильного скребок.
  6. Центрифуга при 17900 х г в течение 25 мин при 4 ° С и собирают супернатант в новую пробирку.
  7. Измерьте концентрацию белка, используя имеющийся в продаже анализа белка в соответствии с инструкциями изготовителя.

5. BRCA2 анализ иммуноблотинг

  1. Подготовьте работает буфер разбавления 50 мл 20x Трис-ацетат SDS работает бuffer (50 мМ Трицин, 50 мМ Трис-основание, 0,1% SDS, рН 8,24) с 950 мл дистиллированной воды.
  2. Подготовка образца следующим образом: добавить 15 мкг общего клеточного лизата, 5 мкл 4х буфера для образцов, содержащих сульфат лития додецил при рН 8,4, 2 мкл 10Х образца восстановителем (0,5 М DTT) и буфера для лизиса до конечного объема 20 мкл.
    Примечание: Этот протокол позволяет обнаруживать BRCA2 в нормальных клеточных линиях также при использовании меньшего количества суммарных белков (до 5 мкг).
  3. Денатурации образцов при 55 ° С в течение 10 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы использовать 55 ° C. Так BRCA2 белок термочувствительный 11, выше денатурации температура приводит к последовательной потере неповрежденной полной длины (390 кДа) BRCA2 белка.
  4. Установите камеру электрофоретическую в соответствии с инструкциями изготовителя.
  5. Загрузите образцы и 10 мкл с высокой молекулярной массой предварительно окрашенных белкового стандарта на precasted геля (Трис-ацетат 3-8%) и работать на 120 В для ABиз 2 ч 12. Остановите электрофоретическую пробег, прежде чем 55 кДа синий маркер оставляет precasted гель.
  6. Подготовка буфера передачи 50 мл 20x буфера передачи, 100 мл 100% метанола и 850 мл воды.
  7. Активация PVDF мембрану (размер пор 0,45 мкм) путем замачивания в 100% метаноле в течение 5 мин, промыть дистиллированной водой и уравновешивают в буфере передачи, по меньшей мере в течение 5 мин. Замачивание губки передачи аппарата в буфере передачи при 4 ° С до использования.
  8. При электрофоретического запустить закончилась, собрать бутерброд в стеке передачи в следующем порядке (снизу вверх): три губки, насыщенные в передаче буфера, один сорт 3 мм лист бумаги насыщен передачи буфера, геля, активированного PVDF мембрану, один 3ММ оценка лист бумаги насыщен передачи буфера, три губки насыщен передачи буфера 13,14. Поместите стопку в устройство и передача белков при 350 мА в течение 4 ч при 4 ° С или при 180 мА в течение ночи при 4 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существо BRCA2 очень большой белок, важно, чтобы продлить время передачи от 1 часа (как было предложено производителем и большинство протоколов передачи) до 4 часов или на ночь, чтобы обеспечить полную передачу белков высокой молекулярной массой. Кроме того, из-за длительного времени передачи, важно, чтобы выполнить блоттинга в холодной комнате при 4 ° С, чтобы свести к минимуму перегрев и облегчить сэндвич разборки. Полусухие системы передачи не хорошо для передачи больших белков.
  9. После передачи, мыть мембрану с TBS, блокируют его в течение 1 часа при комнатной температуре в TBS-Tween 0,25% (TBS-T), содержащей 5% обезжиренное сухое молоко и зонд в течение ночи при 4 ° С с 30 мкл анти-BRCA2 поликлональное антитело кролика ( 200 мкг / мл), разводили в 9 мл ТБС-Т + 5% обезжиренное сухое молоко [1: 300 (объем / объем) разбавления].
  10. Промыть мембраны три раза (10 мин каждый) с TBS-T, затем инкубируют фильтр в течение 1 часа с 1 мкл конъюгированного с пероксидазой хрена анти-кроличьего вторичного антитела разбавленных в 10 мл TBS-T + 5% обезжиренное сухое молоко. После этого промойте мембрану три раза (10 минут каждый) с TBS-T.
  11. Выполните иммунологического по ECL выявить BRCA2 белок с помощью усиленной хемилюминесценции (ECL) Вестерн-блоттинга обнаружения реагента, следуя инструкциям изготовителя. Представьте immunochemiluminescent полосы на высокой разрешающей ECL фильмов.
  12. Выполнение иммунологического с антителом для гена домашнего хозяйства, как β-тубулина (55 кДа), в тот же фильтр в качестве контроля загрузки с помощью моноклонального антитела к β-тубулина разбавленный в соотношении 1: 1000 (10 мкл анти-тубулина антителами в 10 мл ТБС-Т + 5% обезжиренное сухое молоко) в течение 1 ч при комнатной температуре. Промыть и инкубируют вторичное антитело, как описано в BRCA2 (5.10-5.11), для использования конъюгированного с пероксидазой хрена анти-мыши вместо анти-кроличьего вторичного антитела, за исключением.
  13. Приобретите цифровое изображение фильмов впечатлен immunochemiluminescent полос и анализа интенсивности полосы программного обеспечения для анализа изображений выделенный (например,., ImageJ).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Прежде чем приступить к биологической / биохимической анализе для изучения влияния BRCA2 молчания на клеточных функций, первым шагом является подтверждение специфичности молчания, используя зашифрованный миРНК (ненацеливании миРНК) бок о бок с BRCA2 миРНК (рис 1A ). Важно выполнить второй раунд миРНК трансфекции с высокой степенью миРНК / трансфекции, чтобы получить высокую эффективность BRCA2 молчания. Действительно, выполняя только один раунд миРНК трансфекции или с использованием ме...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Потому что зародышевые мутации гена BRCA2 приводят к увеличению риска некоторых видов рака, в том числе женского и мужского рака молочной железы, рака яичников, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, меланомы и 3,4, ряд исследований были предприняты, чтобы понять биологическую функцию белка BRCA2. Большинство из этих исследований являются генетическими основе, главным образом, из-за технических трудностей в анализе гигантский белок BRCA2, как. Метод, описанный здесь для глушителей и а...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами FIRB-Merit RBNE08YFN3_005 и RBNE08HWLZ_012, а также Министерством экономики и финансов Италии для CNR для проекта "FaReBio di Qualità".

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BRCA2 siRNADharmaconL-003462-00SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA
Ctrl siRNADharmacon  D-001810-10-05ON-TARGETplus Реагент для нецелевого пула
липофектамина RNAiMAX Life Technologies13778075Реагенттрансфекции
OPTI-MEM I Reduced Serum MediumLife Technologies31985-070Среда для процедуры трансфекции
NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 мм Гель сборныйLife TechnologiesEA0378Гель для электрофореза белка
NuPAGE LDS Образец буфера Life TechnologiesNP0007Реагент для электрофореза белка
NuPAGE Sample Redagent (10x)Life TechnologiesNP0004Реагент для электрофореза белка
NuPAGE AntioxidantLife TechnologiesNP0005Реагент для электрофореза белка
HiMark Предварительно окрашенный белок стандартLife TechnologiesLC5699Предварительно окрашенный маркер для геля электрофорез
XCell SureLoc Mini-Cell  SystemLife TechnologiesEI0002Оборудование для электрофореза/переноса белков
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running BufferLife TechnologiesLA0041Реагент для вестерн-блоттинга
PVDF мембранаMilliporeIPVH00010Реагент для вестерн-блоттинга
NuPAGE Transfer BufferLife TechnologiesNP0006-1Реагент для вестерн-блоттинга
BRCA2 H-300 кроличье поликлональное антителоSanta Cruz Biotechnologysc-83261:300 разведение
Бета-тубулин моноклональное антителоSigma AldrichT4026-100UL1:1,000 разведение
обезжиренного сухого молокаSigma Aldrich70166Реагент для вестерн-блоттинга
Tween-20Sigma AldrichP1379Реагент для вестерн-блоттинга
SuperSignal West Pico/Femto Хемилюминесцентный субстратPierce Thermo Scientific34080/34096Хемилюминесцентная система
PNT1A клеткиSIGMA Aldrich (для ECACC)95012614PNT1A человек, нормальный эпителий предстательной железы увековечен с помощью клеток SV40
NthySIGMA Aldrich (для ECACC)90011609Nthy-ori 3-1 Клеточная линия человека, клетки фолликулярного эпителия щитовидной железы
Пролиферация клеток Kit I (MTT)Roche11465007001Набор для анализа пролиферации клеток
для

Ссылки

  1. Thorslund, T., West, S. C. BRCA2: a universal recombinase regulator. Oncogene. 26, 7720-7730 (2007).
  2. Yoshida, K., Miki, Y. Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage. Cancer Sci. 95, 866-871 (2004).
  3. Martin, A. M., et al. Germline mutations in BRCA1 and BRCA2 in breast-ovarian families from a breast cancer risk evaluation clinic. J Clin Oncol. 19, 2247-2253 (2001).
  4. Castro, E., Eeles, R. The role of BRCA1 and BRCA2 in prostate cancer. Asian J Androl. 14, 409-414 (2012).
  5. Vencken, P. M., et al. Chemosensitivity and outcome of BRCA1- and BRCA2-associated ovarian cancer patients after first-line chemotherapy compared with sporadic ovarian cancer patients. Ann Oncol. 22, 1346-1352 (2011).
  6. Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434, 917-921 (2005).
  7. Arbini, A. A., et al. Mitochondrial DNA depletion sensitizes cancer cells to PARP inhibitors by translational and post-translational repression of BRCA2. Oncogenesis. 2, e82(2013).
  8. Yang, F., Guo, X., Yang, G., Rosen, D. G., Liu, J. AURKA and BRCA2 expression highly correlate with prognosis of endometrioid ovarian carcinoma. Mod Pathol. 24, 836-845 (2011).
  9. Guaragnella, N., Marra, E., Galli, A., Moro, L., Giannattasio, S. Silencing of BRCA2 decreases anoikis and its heterologous expression sensitizes yeast cells to acetic acid-induced programmed cell death. Apoptosis. 19, 1330-1341 (2014).
  10. Mahato, R. I., Rolland, A., Tomlinson, E. Cationic lipid-based gene delivery systems: pharmaceutical perspectives. Pharm Res. 14, 853-859 (1997).
  11. Su, L. K., et al. Characterization of BRCA2: temperature sensitivity of detection and cell-cycle regulated expression. Oncogene. 17, 2377-2381 (1998).
  12. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  13. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 4350-4354 (1979).
  14. Burnette, W. N. ' 'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).
  15. Hunter, F. W., et al. Dual targeting of hypoxia and homologous recombination repair dysfunction in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. , (2014).
  16. Drew, Y., et al. Therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor AG014699 in human cancers with mutated or methylated BRCA1 or BRCA2. J Natl Cancer Inst. 103, 334-346 (2011).
  17. Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434, 913-917 (2005).
  18. Ihnen, M., et al. Therapeutic potential of the poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib for the treatment of sporadic human ovarian cancer. Mol Cancer Ther. 12, 1002-1015 (2013).
  19. Jeong, J. H., Jo, A., Park, P., Lee, H., Lee, H. O. Brca2 Deficiency Leads to T Cell Loss and Immune Dysfunction. Mol Cells. , (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

BRCA2siRNAsiRNA

Похожие статьи