Подавление<em&gt; BRCA2</em&gt; Для идентификации новых BRCA2-биологические функции регулируются в культивируемых клетках человека

Loredana Moro; Nicoletta Guaragnella; Sergio Giannattasio

doi:10.3791/52849

Методическая статья

Подавление

9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52849

⸱

12 августа 2015 г.

Loredana Moro¹ , Nicoletta Guaragnella¹ , Sergio Giannattasio¹

¹Institute of Biomembranes and Bioenergetics, National Research Council

В этой статье

Краткое содержание

Сайленсинг генов с помощью миРНК представляет собой удобную экспериментальную стратегию для анализа BRCA2-зависимых биологических функций с немедленными последствиями для лучшего понимания биологии рака. Представлен метод эффективного подавления BRCA2, а также экспериментальная процедура обнаружения и количественной оценки изменений экспрессии белка BRCA2 методом иммуноблоттинга в клеточных линиях человека.

Аннотация

Подавление в BRCA2 белка-супрессора опухоли и ее детектирования обычными биохимических анализов представляют собой большую техническую проблему из-за большого размера человеческого белка BRCA2 (приблизительно 390 кДа). Мы сообщаем модификации стандартных киРНК трансфекции и иммуноблоттинга протоколов, чтобы заставить замолчать человека BRCA2 и выявления эндогенной BRCA2 белок, соответственно, в клеточных линиях человека эпителиальных. Основные шаги включают в себя высокую миРНК соотношение реагентов трансфекции и два последующих раундов миРНК трансфекции в пределах того же эксперимента. Используя эти и другие модификации стандартного протокола мы последовательно достичь более 70% молчание гена BRCA2 человека, о чем судили с помощью иммуноблоттинга анализ с анти-антителами BRCA2. Кроме того, денатурации клеточных лизатов при 55 ° С вместо обычных 70-100 ° С и других технических оптимизации процедуры иммуноблоттинга позволяют обнаружение интактного белка BRCA2 даже WHан очень низких количеств исходного материала доступны, или когда уровни экспрессии белка BRCA2 очень низки. Эффективное глушение BRCA2 в клетках человека предлагает ценную стратегию, чтобы разрушить функцию BRCA2 в клетках с интактным BRCA2, в том числе опухолевых клеток, для изучения новых молекулярных путей и клеточные функции, которые могут быть затронуты патогенных мутаций BRCA2 в опухоли. Адаптация этого протокола для эффективного молчания и анализа других «больших» белков, таких как BRCA2 должны быть легко достижимы.

Введение

BRCA2 (рак молочной железы ген восприимчивости-2) ген кодирует белок-супрессор опухоли, который играет решающую роль в восстановлении ДНК двухцепочечной разрывы путем регулирования функцию рекомбиназы фермента Rad51 ^1. BRCA2 также вовлечен в модулирование транскрипции и в контроле клеточного цикла ^2. Зародышевой линии мутации в гене BRCA2 вызывают аутосомно-доминантный восприимчивость к рака груди и яичников у женщин и рака простаты у мужчин, а также предрасположенность к другим типам рака ^3,4. Тем не менее, несмотря на повышенный риск развития рака в BRCA2 мутации, которые подавляют или уменьшить функцию BR....