Метастатического распространения рака является основной причиной смертности от онкологических заболеваний. Мы предоставляем углубленный описание нашего выживания методологии хирургии для создания "пациента, как" ортотопическая сингенными модели мыши систему для изучения механизмов метастазирования в солидных опухолей органов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
А "Пациент-лайк" Ортотопическая Сингенная мышь Модель гепатоцеллюлярной карциномы Метастазы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Большинство смертей, связанных с раком, вызваны метастазированием рака, а не самой первичной опухолью. Тем не менее, основные механизмы метастазирования рака до сих пор неясны. Животные модели имеют важное значение для выяснения механизмов и оценки новых стратегий лечения метастатического рака. В данной работе дается подробное описание «пациентоподобной» ортотопической сингенной модели мыши для изучения механизмов метастазирования опухолей солидных органов. Описана выживаемость хирургической имплантации клеток гепатоцеллюлярной карциномы мыши BNL 1ME A.7R.1 непосредственно в печень (орган происхождения) инбредного иммунокомпетентного лабораторного штамма мышей дикого типа BALB/c. Успех и воспроизводимость данной методологии позволяют использовать ее для широкого использования для выяснения биологических механизмов метастазирования рака солидных органов.
Введение
Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является одним из самых смертоносных видов рака, с плохим прогнозом и низкой продолжительностью жизни. Почти все случаи смерти, связанные с раком, обусловлены метастатическим распространением болезни от исходного органа к дополнительным отдаленным органам2-6. Прогрессирование ГЦК – сложный процесс. Таким образом, возможность моделировать опухолевое микроокружение, которое естественным образом обнаруживается в метастатической ГЦК на животных моделях, может оказаться успешным и полезным способом выявления соответствующих механизмов у людей. 7К сожалению, механизмы метастазирования рака до сих пор в значительной степени неясны. Таким образом, существует необходимость в создании животных моделей, которые позволят нам выяснить основные молекулярные механизмы метастазов рака, таких как HCC3,5.
Мышиные модельные системы являются очень полезным подходом для определения механизмов и оценки новых стратегий лечения метастатического рака человека5,8. Различные системы мышиных моделей, которые существуют в настоящее время, являются свидетельством усилий исследователей по правильному изображению сложности заболевания5,8,9.
Огунвоби и его коллеги недавно использовали хирургический подход на выживание, чтобы продемонстрировать создание новой ортотопической сингенной модели мыши для изучения метастазирования при ГЦК3. Их работа позволила создать «пациентоподобную» мышиную модель, которая повторяет особенности агрессивных и метастатических ГЦК. Они также продемонстрировали, что эта мышиная модельная система может быть использована для изучения биологии циркулирующих опухолевых клеток, и что это имеет потенциал для получения новых знаний о механизмах метастазирования рака.
Целью данной статьи является подробное описание методологии, использованной при создании этой «пациентоподобной» ортотопической сингенной мышиной модели метастазирования ГЦК3. Будет описана методика имплантации клеток ГЦК мыши BNL 1ME A.7R.1 непосредственно в печень (орган происхождения) инбредного иммунокомпетентного лабораторного штамма мышей дикого типа BALB/c3 с использованием операции по выживанию. В отличие от других моделей опухолей ксенотрансплантатов мышей, в которых опухолевые клетки человека имплантируются иммунодефицитным мышам, эта система является сингенной и, следовательно, подходит для изучения роли иммунной системы в метастазировании опухоли3,5,8. Этот подход, вероятно, получит широкое применение для изучения механизмов метастазирования при раке солидных органов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
О себе Этика
Все исследования на животных были одобрены уходу и использованию комитета Институциональные животных (IACUC) в Хантер-колледже из Городского университета Нью-Йорке.
Примечание: Восемь BALB / C мышей использовали в этом экспериментальной процедуры. Пять BALB / C мышам имплантировали 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 мыши гепатоцеллюлярной карциномы клеток для получения первичных опухолей. Три линии BALB / C мышей, не имеющие имплантации использовали в качестве контролей. BNL 1ME A.7R.1 является мышиным гепатоцеллюлярной линию клеток карциномы, которые были получены путем химического превращения из мышиного без онкогенного линии гепатоцитов клетки BNL CL.2. BNL 1ME A.7R.1 была получена из Американской коллекции типовых культур (АТСС).
1. Предварительная операция
- Убедитесь, что у мышей, для всех операций выживания здоровы. Чтобы убедиться, что мыши являются здоровыми, проверьте признаки обезвоживания палаток кожи. Не используйте мышей каких-либо доказательств заболевания или Distress в этих экспериментах.
- Взвесьте мышей, чтобы они не имеют недостаточный вес. Убедитесь, что вес, по крайней мере 16-20 грамм.
- Подготовьте 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 мыши ГЦК ячейки для имплантации в мышь:
- Аспирируйте средств массовой информации из 10 мл 60% - 70% сливающийся культуры клеток блюдо BNL 1ME A.7R.1 мыши ГЦК клеток. Дважды промывали 5 мл PBS. Добавляют 2 мл трипсина на блюдо и инкубировать при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с воздуха и 5% CO 2 в течение 5 мин.
- Впоследствии, пипеток 10 мкл трипсином клетки в ручном гемоцитометра для подсчета клеток под микроскопом при увеличении в 10 раз. Подсчитайте общее количество клеток в четырех угловых квадратах больших и умножают коэффициент разбавления на общее количество клеток. Затем разделить на число подсчитанных площадей и умножить на 10 6 для концентрации клеток (клеток на мл).
- Использование расчет, собрать 5 миллионов клеток на мышь в стерильной1,5 мл микроцентрифужных трубки. Добавьте 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
- Ресуспендируют BNL 1ME A.7R.1 мыши ГЦК ячейки 5 × 10 6 в 100 мкл фосфатным буферным раствором (PBS). Храните эти клетки на льду до имплантации в хирургии.
- Выполнение работ, необходимых для подготовки к операции мышей, таких как анестезия индукции и волосы отсечения от стерильной оборудования и материалов, чтобы избежать загрязнения.
- Вызвать общей анестезии у мышей при вдыхании изофлуран использованием изофлуран испаритель вместе с кислородом при постоянной скорости концентрации потока 1 л в минуту (прим. 2,1%). Примечание: Система самостоятельными, и включает в себя точность испаритель, в снабжение кислородом и угольный фильтр, который связан с дыхательной цепи, необходимой для газа / обезболивающий продувкой.
- Убедитесь, что анестезия достаточными для предотвращения животное от прохождения боль во время операции. Выполните схождение щепотку и наблюдать животное за неисполнение responслуживания, чтобы подтвердить анестезии.
- В то время, переключить клапана линии, печать на коробке и открыты для носового конуса.
- Как только мышь под наркозом, нанесите небольшое количество глазной мази роговицы в качестве превентивной меры от высыхания и повреждений.
- Впоследствии, двигаться животное в области подготовки, с носовой конус правильно расположены и подключены (для обслуживания анестезии). Подготовьте место хирургического разреза для операции по депиляции в этот препарат области.
- Убедитесь, что площадь хирургии в месте, свободной от всех других активности.
- Убедитесь, что рабочая поверхность является прочным и надлежащим образом продезинфицировать, незагрязненные и удобна перед операцией. Поместите стерильную кусок льняной или хирургического лоток над ним.
- Убедитесь, что операционное поле доступно только лиц, осуществляющих операции. Убедитесь, что хирургическое Уборка номера и прокатилась с соответствующим очистителем и распыляется с соответствующим disinfectant.
- Убедитесь, что он также расположен далеко от дверей и окон, как воздушные потоки могут распространяться пыли, ведущую к загрязнению участка.
- Выполните операцию выживания с стерильных инструментов. Либо замочить инструментов в качестве дезинфицирующего средства в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя или автоклаве. Использование основных стерильные материалы, которые готовы к использованию.
- Отдельные инструменты в соответствии с функцией, чтобы помочь предотвратить загрязнение стерильных зонах.
- Бритье примерно на 1 дюйм вокруг места разреза (срединный разрез), чтобы получить доступ к печени животного. Удалить волосы от животного от места операции.
- После бритья, скраб области с мыльной дезинфицирующим (Бетадин скраб хирургическое) и мыть лишнюю дезинфицирующее покончить с стерильного раствора PBS. Выполните это несколько раз, со всем процессом скраб продолжительностью около 5 мин. Снять и выбросить в употреблении перчатки.
- Потом перейти к защитной одежды, такие, как Surgicаль платье, скраб сверху, и маска. Далее, санировать руки с правильного решения скраб, прежде чем положить хирургические перчатки. Примечание: Это необходимый шаг, чтобы предотвратить пролития и загрязнение хирургической сайт с потенциальными загрязнителями.
2. Хирургическое
- Обеспечить внешний источник тепла в тепле на протяжении всего периода анестезии. Животное может испытывать некоторые переохлаждение, потому что анестезия вызывает нарушения терморегуляции; Поэтому, поддержание температуры тела.
- Положите мышь на спине на протяжении операции.
- Закрепите передние конечности, задние конечности и хвост мыши к столу с кусочками хирургии хирургических лент.
- Сделайте прямой разрез сразу уступает xyphisternum.
- Используйте стерильную самоудерживающийся хирургического втягивающим подвергать печень.
- С шприц, имеющий 20G иглу, медленно и осторожно вводят 100 мкл PBS, содержащие 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1мыши HCC клеток в правой доле печени.
- После удаления иглы, применять стерильную ватный тампон по крайней мере 1 мин, чтобы остановить кровотечение любого потенциального из-за высокой васкуляризации печени.
- Закрыть подкожной ткани с рассасывающиеся нити с последующим замыканием кожи с использованием хирургических зажимов. Впоследствии, очистить рану еще раз с бетадином скраба. Примечание: Это обеспечит закрытие операционной раны.
- Подкожно дать 100 мкл физиологического раствора.
3. Послеоперационный
- Сразу же после операции, переводить мышь на чистую клетку с идентификационной карты после операции, чтобы уведомить смотрителей состоянии мыши. Обеспечить еду и воду. Примечание: В нашем опыте, мышь, которая только что перенес операцию будет развиваться лучше, если расположен наедине с мокрой пищи и воды в начальный период 24-ч после операции.
- Держите животное в тепле с лампой тепло, выделяющее тепло не превосходящие 38 ºC. Uсе термометр для измерения температуры, пока мышь не полностью выздоровел.
- Дом животное в клетке желательно с бумажной подстилки, чтобы обеспечить комфорт.
- После первоначального восстановления, мониторинга животного признаки дискомфорта, кровотечения, боли и страданий. Дайте бупренорфин (0,05 -0,1 мг / кг) для облегчения боли. Внимательно следить за активность, поведение и внешний вид, а также расход воды и пищи в течение приблизительно 2 ч. Если амбулаторно, переместите животное обратно в район для регулярного нормального жилья мышей и продолжать следить за 6-12 ч с интервалом 24 ч для пост-операции. Выполните проверку веса, если это необходимо.
- Однако, если животное испытывает проблемы выздоравливал, принять соответствующие меры Поддерживающий уход. Если мыши не в состоянии восстановить, гуманно усыпить мышей через СО 2 удушья и цервикальной дислокации. Следуйте утвержденных организационных принципов для эвтаназии.
- Послеоперационный проверьте клинических признаков ГЦК, которые, как правило, observabле, как значительное снижение оценка состояния тела. Примечание: В этот момент первичной опухоли, скорее всего, разработаны в печени и метастатические отложения скорее всего разработаны в легких.
- На данный момент, пожертвовать всем мышей (экспериментальные и управления), участвующих в эксперименте по гуманной эвтаназии. Подвергать мышей углерода асфиксией диоксидом: очень медленно выпускают углекислый газ в камеру в течение 5 мин -10. Это вызовет остановку дыхания.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Печень Balb / с мышей имплантировали 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 мыши ГЦК клеток. Клинические признаки развития ГЦК было наблюдать 63 дней после операции. Следовательно, мышей умерщвляли гуманным. Вскрытие проводили на мышах эвтаназии. Легкие и печень иссекают и осторожны валовой экспертиза была проведена, чтобы определить макроскопические опухоли. В одной мыши, поверхностное опухоли наблюдали на поверхности печени с некоторой прикрепления к стенке брюшной полости (фиг.1А). Во втором мыши, аномал...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этой статье углубленное описание метода, учитывая, что недавно был сообщил Ogunwobi и коллегам успешного создания ортотопической сингенной мышиной модели HCC метастазов (рис 2) 3. Скорость отбора опухолей для этой процедуры, как правило, высока. Ранее мы наблюдали скорость намотки опухоли в 100% 3. Тем не менее, скорость намотки может быть переменной в зависимости от компетенции следователя. В недавнем эксперименте, выполненном в новом аспиранта проходят обучение, скорость намотк...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Паскаля Дюбуа за корректуру статьи. Авторы также хотели бы поблагодарить персонал Центра для животных при Хантер-колледже Городского университета Нью-Йорка. Эта работа была поддержана грантом NIH RCMI для Хантер-колледжа.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Пинцайзер для микрорассечения | Roboz | (RS-5040) | Наконечник 0,20 x 0,12 мм |
| Микрорассекающий щипцы Graefe, зубчатый изогнутый наконечник | Roboz | (RS-5111) | 1 X 2 зуба, изогнутый наконечник шириной 0,6 мм |
| Микрорассекающий ретрактор-Agricola (3 на 3 зубца) | Roboz | (RS-6501) | Тупой 3 x 3 зубца, глубина 4 мм, разверточный |
| микрорассекающий ретрактор-Гольдштейн 25 мм (3 на 3 зубца) | Roboz | (RS-6503) | Тупой, 3 x 3 зубца, глубина 4 мм, разверточный 19 мм |
| Штангенциркуль Джеймсона (Измеряет опухоли) | Roboz | (RS-6466) | Шкала 80 мм/3 дюйма, хромированный |
| Микро ножницы для препарирования, большие кольцевые ножницы, прямые и острые | Roboz | (RS-5852) | Лезвия 23 мм, длина 4 дюйма, плоские хвостовики и большие кольца |
| Скальпель с лезвиями, для деликатных процедур препарирования | Roboz | (RS-9861-36) | |
| Ручка скальпеля | Roboz | (RS-9884) | Твердотельные |
| стежки Littauer Sissors | Roboz | (RS-7074) | Длина 4,5 дюйма |
| Коричневый иглодержатель, для легкого наложения швов | Roboz | (RS-7960) | Выпуклая челюсть, мелкие зазубрины |
| Reflex 7MM раневые зажимы с аппликатором Reflex 7 Clip Applier | Roboz | (RS-9262) | безопасный, надежный альтернативный метод закрытия раны |
| Лоток и крышка для инструментов | Roboz | RT-1350S | |
| Мини-машинка для стрижки со съемным лезвием | Roboz | (RS-5903) | |
| Germinator 500 (Микробный Терминатор) Сухой стерилизатор | Roboz | Ds-400, Ds-401, DS-501 | Для быстрого обеззараживания микродиссекционных инструментов. Обеззараживание инструментов в течение 15 сек. |
| Иглы для микроинъекций | VWR | BD305125 | 25G Needle |
Ссылки
- Sheng, W., et al. Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab on a Chip. 14, 89-98 (2014).
- Ogunwobi, O. O., Liu, C. Therapeutic and prognostic importance of epithelial-mesenchymal transition in liver cancers: insights from experimental models. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 83, 319-328 (2012).
- Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma. PloS One. 8, e63765(2013).
- Ogunwobi, O. O., Liu, C. Hepatocyte growth factor upregulation promotes carcinogenesis and epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma via Akt and COX-2 pathways. Clinical and Experimental Metastasis. 28, 721-731 (2011).
- Fujiwara, S., et al. A novel animal model for in vivo study of liver cancer metastasis. World Journal of Gastroenterology : WJG. 18, 3875-3882 (2012).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11, 512-522 (2011).
- Heindryckx, F., Colle, I., Van Vlierberghe, H. Experimental mouse models for hepatocellular carcinoma research. International Journal of Experimental Pathology. 90, 367-386 (2009).
- Zhang, L., et al. An in vivo mouse model of metastatic human thyroid cancer. Thyroid Official Journal of the American Thyroid Association. 24, 695-704 (2014).
- Menezes, M. E., et al. Genetically engineered mice as experimental tools to dissect the critical events in breast cancer. Advances in Cancer Research. 121, 331-382 (2014).
- Ogunwobi, O. O., Wang, T., Zhang, L., Liu, C. Cyclooxygenase-2 and Akt mediate multiple growth-factor-induced epithelial-mesenchymal transition in human hepatocellular carcinoma. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 27, 566-578 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100, 57-70 (2000).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139, 1315-1326 (2009).
- Stolpe, A., Pantel, K., Sleijfer, S., Terstappen, L. W., den Toonder, J. M. Circulating tumor cell isolation and diagnostics: toward routine clinical use. Cancer Research. 71, 5955-5960 (2011).
- Saad, F., Pantel, K. The current role of circulating tumor cells in the diagnosis and management of bone metastases in advanced prostate cancer. Future Oncology. 8, 321-331 (2012).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
