Выделение и распространение циркулирующих опухолевых клеток из мыши рака Модель

Краткое содержание

Было показано, что циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) играют важную роль в метастазировании опухоли. В данной работе описан способ выделения и размножения ЦОК из цельной крови модели метастазирования гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) сингенной опухоли мыши.

Аннотация

Метастазирование рака является основной причиной смертности, связанной с раком. Недавние исследования показали, что циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) играют важную роль в метастазировании рака. Действительно, количество ЦОК коррелирует с размером опухоли. В данной работе подробно описывается методология выделения и размножения ЦОК из сингенной мышиной модели гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК), которая позволяет проводить последующий анализ потенциально важных молекулярных механизмов метастазирования опухоли солидных органов. Этот метод эффективен и воспроизводим. Это неинвазивный метод и, следовательно, он может заменить инвазивную биопсию тканей человека, которая может быть связана с осложнениями. Таким образом, обсуждаемый здесь метод позволяет выделять и распространять ЦОК из образцов цельной крови таким образом, чтобы их можно было исследовать и охарактеризовать. Это имеет потенциал для будущей адаптации для клинических применений, таких как диагностика и персонализированная таргетная терапия.

Введение

Сообщество исследователей рака знало о существовании циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) с тех пор, как они впервые были обнаружены Томасом Эшвортом в 1869 году¹. С тех пор было показано, что ЦОК играют важную роль в метастазировании опухоли и прогрессировании заболевания^2-5. На сегодняшний день солидные опухоли являются основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. ЦОК – это редкие клетки, которые происходят из первичных опухолей и путешествуют по кровотоку к различным органам, из которых лишь небольшая часть в конечном итоге развивается в метастазы^2-5. Примечательно, что существует положительная корреляция между размером опухоли и числом^{ЦОК 3,4}.

Понимание биологии ЦОК может способствовать поиску таргетной терапии. Кроме того, ЦОК могут иметь диагностическое применение. Чтобы достичь этих потенциальных клинических применений, необходимо преодолеть некоторые текущие проблемы в изучении ЦОК. Одна из проблем связана с тем, что ЦОК могут присутствовать в виде отдельных клеток или кластеров, и они могут даже изменять свой фенотип в ответ на микроокружение крови^. Более того, обнаружение может быть очень сложной задачей, отчасти из-за низкого количества ЦОК (от нескольких до сотен на миллилитр) среди одного миллиарда гематологических клеток на миллилитр^{в крови}. Тем не менее, в последние годы активизировались исследования потенциального клинического применения ЦОК при раке солидных органов.

Несмотря на эти усилия, проблемы изучения и понимания роли ЦОК сохраняются из-за редкости ЦОК и неадекватности доступных в настоящее время технологических инструментов. Несмотря на эти проблемы, огромный потенциал клинического применения продолжает оставаться стимулом для продолжения исследований роли ЦОК в метастазировании рака.

Недавно нам удалось выделить и размножить в клеточной культуре ЦОК из ортотопической сингенной мышиной модели метастазирования гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК)⁵. Цель данной работы – подробно описать все аспекты успешной методологии. Значимость данной методологии заключается в том, что данный подход может быть модифицирован с целью успешной выделения и размножения в культуре ЦОК человека, что расширяет возможности исследований биологии ЦОК in vitro.

Существует множество потенциальных клинических применений использования ЦОК. ЦОК могут быть полезны для прогнозирования, мониторинга ответа, скрининга, динамического мониторинга молекулярных изменений опухоли и персонализированной терапии⁴. Таким образом, лучшее понимание биологии ЦОК имеет высокий потенциал для клинического воздействия.

Протокол

О себе Этика: Все исследования на животных были одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) в Хантер-колледже из Городского университета Нью-Йорке.

1. Предварительно эксперимент процедуры

1. По прибытии на объект животного, первоначально дом 3 линии BALB / C мышей в клетке с фильтрованной верхней и щепы постельные принадлежности. Убедитесь, что мыши имеют свободный доступ к пище, Purina грызунов и воды. Постельное белье и еда должна быть изменена два раза в неделю, пока клетки должны быть очищены один раз в неделю.
2. Вызвать общую анестезию на мышах с использованием изофлуран испаритель вместе с кислородом при постоянной скорости потока 1 л в минуту. Система самостоятельной и включает в себя точность испаритель.
3. Позиция животных в пластиковой коробке, которая имеет точность испаритель и газа / обезболивающий систему, связанную с ним. Первоначально установлен испаритель до 2,5 до животное не находится в бессознательном состоянии, в котором точка снизить испарителя до 2.
4. В то время, переключитьклапан на линии, уплотнения его в коробку и открытии его в носовом конусе.
5. Перемещение животное в области подготовки, с носовой конус расположен правильно и подключен (для обслуживания анестезии).
6. Подготовьте 5 × 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 мыши ГЦК клетки для имплантации в мышь. BNL 1ME A.7R.1 следует росли в среде (10% инактивированной нагреванием FBS, 1% пенициллина / стрептомицина и 2 мМ L-глутамина) инкубирование клеток в культуральной чашке при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с воздуха и 5% _{СО 2.}
7. С шприц, имеющий 20 G иглу, имплантаты 100 мкл PBS, содержащие 5 ^х 10 6 BNL 1ME A.7R.1 мыши гепатоцеллюлярной карциномы клеток в доле печени BALB / с мышей, чтобы произвести первичные опухоли. После имплантации, дом BALB / с мышей в клетке с теми же требованиями, как дома предварительной имплантации.
8. В экспериментальной конечной точки, клинические признаки гепатоцеллюлярной карциномы наблюдается в значительному снижению состояния организмаоценка (обычно обнаруживается после 4 недель). В этот момент, существует вероятность того, что первичные опухоли были разработаны в печени, а метастатические отложениях в легких. После начала процесса выделения и распространения циркулирующих опухолевых клеток.

2. Сбор цельной крови для циркулирующих опухолевых клеток изоляции

ПРИМЕЧАНИЕ: Правильно продезинфицировать область хирургии и убедитесь, что это беспорядок бесплатно. Автоклав все хирургические инструменты или понежиться в качестве дезинфицирующего средства в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя

1. Жертвоприношение мышей гуманными эвтаназии при экспериментальном конечной точки (клинические признаки развития опухоли). Euthanization мышей следует привлекать СО ₂ удушья. Соблюдайте мышей правильно, чтобы подтвердить анестезии правильно распределены. Двуокись углерода должна быть выпущена медленно в камере в течение определенного периода 5 - 10 мин, в результате чего остановку дыхания. Следуйте внутрисердечной обескровливания и cervicаль дислокации. ⁵
2. Использование 25 г иглу, прикрепленную к 1 мл шприца для сбора цельной крови. Heparanize шприц с 0,01 мл гепарина. Прокол кожи сразу с иглой уступает xyphisternum примерно под углом 45 °. Авансовые иглу медленно, чтобы проколоть сердце, а затем опустите угол иглы. Неуклонно проводить иглу и шприц на месте, и вытянуть 500 мкл - 1000 мкл цельной крови из сердца.
3. Извлеките шприц и иглу и передачи кровь в предварительно меченных 1,5 мл апирогенной трубки. Центрифуга цельной крови в 1,5 мл апирогенной трубки при 1167 х г в течение 5 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: центрифугирования отделяет всего образца крови в три слоя: нижний и гематокрита слой, состоящий из красных кровяных клеток, промежуточного тонкого слоя светлого сгустка крови, и верхний слой плазмы.
4. Удалить плазму тщательно с помощью пипетки и сбора его в отдельном 1,5 мл апирогенной трубки для FurthER эксперименты, такие как обнаружение бесклеточных нуклеиновых кислот. ⁷
5. Для выделения циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК), собирают слой светлого сгустка крови в отдельную 1,5 мл апирогенной трубки при подготовке к эритроцитов (RBC) лизиса. Это необходимо для удаления остаточных эритроцитов в Баффи пальто слоя.

3. Рецепт для красных кровяных телец (эритроцитов) буфера для лизиса

1. Сделайте 1 л раствора РБК буфера для лизиса.
2. Сделать 500 мл раствора хлористого аммония и 500 мл Трис. Затем смешать, чтобы создать 1 л раствора буфера для лизиса эритроцитов с конечной концентрацией 155 мМ хлорида аммония и 10 мМ Трис.
3. Буфер раствора до рН 7,5. Храните буфера для лизиса эритроцитов при от +2 до +8 ° C, и довести до комнатной температуры непосредственно перед использованием.

4. РБК Лизис Баффи пальто

1. Добавить 1 мл буфера для лизиса эритроцитов в стерильной апирогенной 1,5 мл пробирку, содержащую собранную поглощающее покрытие.
2. Смешайте содержимое пробирки с помощьюинвертирующий несколько раз. Выдержите смешанной содержимое пробирки в течение 5 мин при комнатной температуре на скамейке. Центрифуга смешанные содержимое в течение 5 мин при 1167 х г.
3. После центрифугирования осадок беловато будут получены. Откажитесь от красновато супернатант медленно и осторожно в 10% отбеливателя без каких-либо сбоев в гранулы. Если осадок не беловатый, повторно выполните шаги 3.1 - 3.5. Увеличение времени инкубации в буфере для лизиса эритроцитов до 10 - 15 мин и может быть полезным.
4. Безопасное распоряжаться биологические отходы сразу обеззараживания биологических отходов в 10% отбеливателя полный после 24 часов.

5. Распространение в клеточной культуре

Примечание: Опухолевые клетки, как правило, быстро растущие клетки лейкоциты, которые в изобилии в исходной смеси клеток, посеянных на блюдо. После повторного изменения среды, и последующих проходов ЦОК, все белые клетки крови удаляются и относительно чистой население ЦОК остается.

1. Послеотбрасывая супернатант в 10% хлорной, мыть беловатый осадок в 1 мл фосфатно-солевом буфере (PBS), по крайней мере один раз, и ресуспендируют в полной культуральной среде для распространения в клеточной культуре.
2. После промывки завершена, добавляют 1 мл полной BNL 1ME A.7R.1 культуральной среде (10% инактивированной нагреванием FBS, 1% пенициллина / стрептомицина и 2 мМ L-глутамина) к осадку и ресуспендируют осадок в культуральной среде.
3. Семенной ресуспендированные смесь клеток в культуре клеток блюдо. Инкубируйте клеточной культуры блюдо при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с воздуха и _5% CO 2.
4. Изменить среду для культивирования клеток каждые два-три дня. После пяти до семи дней, ЦОК будет присоединились к клеточной культуры блюдо и начал пролиферирующих. Эти клетки остаются жизнеспособными за 25 проходов и после повторных циклов замораживания и оттаивания ^5.

6. Проверка гепатоцеллюлярной карциномы циркулирующих опухолевых клеток линии

1. Выполните APolymerase цепной реакции (ПЦР) основе метода, чтобы усилить только один конкретный сегмент ДНК мыши β-глобина гена, чтобы подтвердить, что роман создан клеточные линии СТС являются клетки мыши, как в оригинальной имплантированного BNL 1ME A.7R.1 HCC линии. Метод был впервые описан и подтверждено Steube др. ^5,8
2. Выполнение иммунного окрашивания для гепатоцитов-специфическим маркером цАМФ реагировать элемент связывающего белка 3-3 (как CREB3L3) с помощью специфического антитела. Это подтвердит, что роман, установленные ЦОК действительно гепатоцитов, как в оригинальной имплантированного клеточной линии BNL 1ME A.7R.1. ⁵

Результаты

Методика описана здесь показал, что ЦОК может быть выделен. Мышей умерщвляли гуманным в экспериментальной конечной точки. Этот процесс предполагает углерода диоксида удушье, внутри сердца обескровливание и шейки дислокации. Схема основных этапов процедуры, показаны на рисунке 2. Образцы цельной крови с помощью внутри сердечной обескровливания были обработаны с использованием протокола, описанного выше. После чего, центрифугирование используется для определения слой лейкоцитарной пленки, которые подверга...

Обсуждение

В этом исследовании были описаны способы выделения и размножения ЦОК из цельной крови сингенной мыши с ГЦК. Целью данной работы является совершенствование текущих исследований механизмов метастазирования рака.

Фактором, способствующим плохому прогнозу многих видов рака, является отсутствие своевременного выявления и последующее широкое распространение злокачественного новообразования³. ЦОК возникают из первичного рака и распространяются через кровоток к отдаленным органам. Таким об...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Гепарин натриевая соль 1 г	VWR	89508-852
BTX Tube Micro 1,5 мл Clear NS	VWR	89511-254	1,5 мл   безпирогеновые трубки eppendorf Tubes
Игла стерильная дисп BD 25 G x 1 in	VWR	BD305125	25 г Игла
Slp Tip SRNG 1 мл 200 каждый в упаковке	VWR	BD309659	1 мл наконечник шприца
Шприц 1 мл leur lok Pk 100	VWR	BD309628	1 мл шприц
VWR Щипцы для салфетки 6	VWR	82027-446	Щипцы
Cyromold intrm 15 x 15 x 5 мм PK 100	VWR	25608-924	Cyromold
Cryo-oct compund 4 унции	VWR	25608-930	Oct compound
VWR Slide sprfrst 25 x 75 мм PK72	VWR	48311-703	Slides
VWR Cover Glass #2 22 x 50 мм	VWR	48-382-128	Защитное стекло
VWR Slide Box True North fm Pu	VWR	89140-278	Slide Box
Super HT PAP Pen	VWR	89427-058	PAP
Pen Water RNASe и DNAse free 2 л	VWR	101454-204	Нуклеазный безмасляный
буфер Tris Ultra Pure Grade 500 г	VWR	97061-796	Tris Buffer
Ammonium Chloride ACS Grade 2, 5 кг	VWR	97062-048	Чашка для культуры тканей хлорида аммония
Falcon 60 x 15 мм Style полистирол	VWR	353002	Чашка для культуры тканей
Clorox Бактерицидный отбеливатель, обычный	VWR	89501-620	Clorox Bleach
PBS, 1x (фосфатно-солевой буфер) без кальция и магния (500 мл)	Thermo Fischer Scientific	21-040-CV	PBS, 1x
DMEM, 1x  с 4,5 г/л глюкозы и L-глутамин без пирувата натрия	Thermo Fischer Scientific	10-017-CV	DMEM 1x media for BNL 1ME A.7R.1 cells
Фетальная бычья сыворотка	Thermo Fischer Scientific	35-010-CV	FBS
Пенициллин стрептомицин раствор, 100x	Thermo Fischer Scientific	30-002-Cl	Пенициллин стрептомицин
Sorvall Biofuge pico	Thermo Fischer Scientific	75002411	Центрифуга 13 000 об/мин