Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение лейкоцитов из мышиного тканей на матери и плода интерфейс

17.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52866

⸱

21 мая 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics & Gynecology, Wayne State University School of Medicine, 2School of Paediatrics and Reproductive Health, Research Centre for Reproductive Health, the Robinson Research Institute, The University of Adelaide, 3Department of Immunology & Microbiology, Wayne State University School of Medicine, 4Perinatology Research Branch, NICHD/NIH/DHHS

В этой статье

Краткое содержание

Описанный здесь протокол для выделения и анализа инфильтрирующих лейкоцитов тканей на границе матери и плода (матка, децидуа и плацента) мышей. Этот протокол поддерживает целостность большинства маркеров клеточной поверхности и позволяет получить достаточное количество жизнеспособных клеток для последующих применений, включая анализ проточной цитометрии.

Аннотация

Иммунная толерантность во время беременности требует, чтобы иммунная система матери претерпевает изменения отличительные для того, чтобы принимать и лелеять развивающегося плода. Эта терпимость начинается при половом акте, созданы во оплодотворения и имплантации, и поддерживается на протяжении всей беременности. Активные клеточные и молекулярные медиаторы толерантности материнской плода обогащены в месте контакта между плода и материнской тканей, известных как материнской плода интерфейс, который включает в себя плаценту и матки и децидуальной ткани. Этот интерфейс состоит из стромальных клеток и инфильтрацией лейкоцитов, и их обилие и фенотипические характеристики меняются в течение беременности. Лейкоциты проникают в интерфейсе материнской плода включают нейтрофилы, макрофаги, дендритные клетки, тучные клетки, Т-клетки, В-клетки, NK-клетки и NKT клетки, которые вместе создают локальную микросреду, которая поддерживает беременность. Дисбаланс между этими клетками или любой inappropетел изменение в их фенотипов считается механизм болезни во время беременности. Таким образом, исследование лейкоцитов, которые проникают интерфейс материнской плода необходимо для того, чтобы выяснить иммунных механизмов, которые приводят к осложнениям, связанных с беременностью. Описанный здесь протокол, который использует комбинацию нежной механической диссоциации с последующим надежной ферментативной дезагрегации с протеолитической и коллагенолитического ферментативной коктейль, чтобы изолировать Лейкоциты проникают из мышиных тканей на границе материнской плода. Этот протокол позволяет изоляции высокой численности жизнеспособных лейкоцитов (> 70%) с достаточно консервативными антигенных и функциональные свойства. Изолированные лейкоциты могут быть проанализированы с помощью нескольких методов, в том числе иммунофенотипирования, сортировки клеток, изображений, иммуноблотинга, экспрессии мРНК, клеточной культуры, и в пробирке функциональных анализов, таких как смешанные реакции лейкоцитов, пролиферации, или цитотоксичности.

Введение

Иммунная толерантность во время беременности период, когда отличительные изменения происходят в иммунной системе матери. Эти изменения позволяют мать терпеть плод, полу-аллогенную трансплантата 1. Плод выражает отцовской главного комплекса гистосовместимости (МНС) антигены 2 и фетальные клетки были обнаружены в материнском кровотоке 3; Однако, плод не отторгается 4,5. Это загадка полностью не поняты.

Самая недавняя гипотеза утверждает, что толерантность материнского плода создается во время полового акта и оплодотворения 6,7 и поддерживается выдержать полный срок беременности 8-10. Разбивка этой материнской плода толерантности считается механизм заболевания на ранних и поздних стадиях беременности 10-16. Допуск матери и плода включает в себя участие различных лейкоцитов групп населения, в том числе Т-клеток (регуляторных Т-клеток, клеток Th1, Th2 клеток, и клетки Th17), Macмакрофаги, нейтрофилы, тучные клетки, NK-клетки, и НКТ-клеток, дендритные клетки, В-клетки и, что изменения в плотности и локализации во время беременности 15,17-19. Допуск матери и плода обогащается на материнской плода интерфейс 20 - анатомической месте, где иммунная система матери взаимодействует с антигенами плода 20,21.

Интерфейс материнской плода создается во время плаценты, когда эмбриональные клетки трофобласта extravillous вторгнуться слизистой оболочки матки 22-24. На стороне плода этого интерфейса, мембраны, окружающие плод создать специализированный эпителиальной поверхности в плаценте, и syncytiotrophoblast клетки контролировать обмен питательных веществ через их непосредственном контакте с материнской кровью 22. По материнской стороне интерфейса, децидуальной набирает гетерогенную пул лейкоцитов у мышей, которые составляют 30% до 50% всех клеток плаценты. В дополнение к их участию в Матерналь иммунной толерантности, эти клетки являются главными участниками различных процессов во время беременности., например, защиты репродуктивного тракта от инфекций, оплодотворения, имплантации эмбриона 7,25, децидуальный ангиогенез 26, ремоделирование сосудов 24,27, трофобласт вторжение 28, плацентарный Развитие 24,25, и, в итоге, труда и доставка 15,17. Таким образом, изучение лейкоцитов, участвующих в толерантности материнской плода имеет важное значение для выяснения патогенеза осложнений, связанных с беременностью.

Хотя использование иммуногистохимии и иммунофлуоресценции породила данные для непосредственной визуализации и локализации матки, плаценты, или плацентарных лейкоцитов 29,30, проточной цитометрии анализа показали еще более конкретные субтипов лейкоцитов в каждой из этих тканей 31,32. Кроме того, проточной цитометрии был использован для определения плотности и часть оболочкинал плода интерфейс лейкоциты 33 и уровни экспрессии внеклеточных и внутриклеточных белков 8-10,34. Проточной цитометрии анализ лейкоцитов на границе материнской плода требует одного суспензии клеток. Для того, чтобы изолировать Лейкоциты проникают из децидуальной, матки, плаценты и тканей, были использованы два метода ткани диссоциации: механическая и ферментативная. Оба метода позволяют разделение проникших лейкоцитов из внеклеточного матрикса (ЕСМ) этих тканей. Ферментативный диссоциации ткани превосходит механической ткани диссоциации, так как позволяет более высокий выход лейкоцитов с менее сдвига силы ассоциированного повреждения 35. Следовательно, механическая ткани диссоциации требует объединения тканей 36, которые могут увеличить изменчивость и неоднородность образцов. Тем не менее, механической диссоциации может быть выбор, когда представляющий интерес антиген может быть изменена путем ферментативной диссоциации или, когда функциональные клеткис процентной необходимости быть сохранены (например., цитотоксичность NK клеток) 35.

Использование протеолиза с конкретными ферментами, чтобы ухудшить ECM исключает низкие выходы, наблюдаемые с механической диссоциацией. Некоторые исследования показали использование трипсина 32, 37, коллагеназы ДНКазы 31 диспазу 38 и коммерческих коктейлей различных ферментов 32,39. Однако природа и концентрация различных ферментов и продолжительность пищеварения должны быть тщательно определена и подтверждена, чтобы гарантировать поддержание целостности клеточных поверхностных антигенных эпитопов, необходимых для иммунофенотипирования. Различные структуры поверхности дифференциально восприимчивы к разрушению различными ферментами, с некоторыми ферментами, такими как трипсин, будучи известно, для зачистки поверхности лейкоцитов эпитопы, распознаваемые многих моноклональных антител.

Введенный здесь, представляет собой способ, использующий proteolytIC и коллагенолитической ферментативная коктейль, названный Accutase. Это решение ферментативного нежно достаточно в то же время эффективно диссоциации мышиных тканей на границе материнской плода, и не требует добавления других реагентов или диссоциирующих сыворотки, чтобы закончить реакцию диссоциации. Кроме того, он готов для использования в качестве подается и, хотя время диссоциации должно быть подтверждено, что более надежными, чем вышеуказанных ферментов 40,41.

Использование комбинации обоих типов тканей дезагрегации улучшает качество и количество клеток, полученных; Таким образом, несколько исследований реализованы комбинированное применение механической и ферментативной диссоциации с удовлетворительными результатами 31,32,37. Протокол, описанный здесь, был создан и утверждена в нашей лаборатории; он использует комбинацию мягкого механического диссоциации с последующим надежной ферментативной дезагрегации. Этот протокол позволяет изоляции и дальнейшее изучениев проникают лейкоциты в мышиных тканях на границе материнской плода (матка, децидуальной и плацента). Следующий протокол также поддерживает целостность маркеров клеточной поверхности и доходности достаточно жизнеспособных клеток для последующих применений, как показано с помощью анализа проточной цитометрии. Наконец, этот протокол поддерживает согласованность клеточного препарата для анализа и сравнения различных мышиных тканях, составляющих интерфейс материнской плода.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Перед началом работы с образцами, указанных в этом протоколе, животное этическое одобрение должно быть дано комитетом по этике местного научно-исследовательского и организационного обзора советов по. При работе с кровью животных, клетки, или опасных веществ, упомянутые в настоящем протоколе, надлежащие биобезопасности и лабораторной безопасности действия должны быть соблюдены.

1. Обращение мыши и тканей Коллекция

  1. Подготовьте стерильную рабочую станцию ​​и получить стерильные инструменты для коллекции тканей. Эти инструменты включают большие и малые хирургические ножницы, щипцы и тонкой кончик пинцетом. Включают небольшие чашки Петри помечены соответствующими именами ткани, наполненные 1x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), раствор (3 - 5 мл), уравновешенную до комнатной температуры (20 - 22 ° C). Также есть большой чашки Петри, без маркировки, наполненный 1x решения PBS (10 - 15 мл).
  2. Эвтаназии беременную мышь (10,5 до 19,0 дней после коитуса (DPC) или до родов) с использованием диоксида углерода (СО 2). Чтобы убедиться, что мышь эвтаназии, используйте технику шейки дислокации.
    Примечание: До 10,5 DPC, трудно отделить вручную децидуальной ткани из матки ткани. Если выделение децидуальных лейкоцитов не требуется, лейкоциты из маточных тканей небеременных мышей или те, у мышей при <10,5 DPC может также быть выполнена с помощью следующей этот протокол.
  3. Используя пару стерильных хирургических ножниц, полностью удалить нижнюю брюшную часть кожи и мышечной ткани. С пинцетом, не перемещать в сторону все другие органы до матки и яичников видны. С матки еще привязаны, используйте щипцы, чтобы переместить его вне брюшной полости (рис 1А).
  4. Найдите яичники дистальных к яйцевода и uterotubal стыке каждого рога матки. Используя небольшие хирургические ножницы, сделать надрез на uterotubal перехода и отделить рога матки от брыжейки, содержащей сосудов матки; тогда,акцизные на шейку, чтобы отделить рога матки из брюшной полости (Фиг.1В).
  5. С небольшими хирургическими ножницами, сделать надрез между шейки матки и нижнего сегмента матки рога. Оставить присоединены часть шейки матки во время этого процесса (рис 1С), чтобы избежать открытия рог матки.
  6. Погружают рога матки (включая шейку матки) в большую чашку Петри, наполненной 1x раствора PBS (10 - 15 мл), чтобы гидратировать мест имплантации.
  7. В то время как по-прежнему погружен в раствор PBS 1x, обрезать любой жир из рога матки с малыми хирургическими ножницами. Держите ткани погруженных в раствор PBS 1x в течение вскрытия.
  8. Проведение рога матки в месте с пинцетом, удалите один из участков имплантации из матки с поперечный разрез через область между имплантации, используя небольшие хирургические ножницы (рис 1D). Имплантация Сайт содержит зародыш, окруженныйхориоаллантоиса мембраны, и матки, децидуальный и плацентарные ткани.
  9. Используя щипцы, держать сайт на место и сделать небольшой разрез в стенке матки, прилегающей к плацентарного и децидуальных тканей (рис 1E). Обрежьте по периметру плаценты / децидуальной пока они не станут отделен от обоих стенке матки и хориоаллантоисной мембране, которая включает плода (рис 1F).
  10. Удалить плаценту и прикрепленные децидуальной ткани и место в 1x PBS раствора (3 - 5 мл; см шаг 1.12).
  11. Поместите плод, окруженный хориоаллантоисной мембране, прикрепленной к маточных тканей в чашку Петри с раствором PBS 1x (3 - 5 мл). Гидратация этих тканей будет способствовать отделению хориоаллантоисной мембране от стенки матки (см шаг 1,14).
  12. Используя пару тонкой кончик пинцетом, осторожно очистите децидуальной ткани (бело-серый слой) из поверхности плаценты. Выполните этошаг тщательно поддерживать целостность плаценты и плаценты тканей (рис 1 г).
  13. Поместите плаценту и децидуальной ткани в двух отдельно меченых чашки Петри, заполненные раствором PBS 1x (3 - 5 мл каждая).
  14. Аккуратно снимите стенки матки с хорионаллантоисной мембраны с тонкой наконечником пинцетом. Эти маточные ткани.
  15. Поместите матки ткани в чашке Петри, наполненной 1x раствора PBS (3 - 5 мл).
  16. Повторите шаги 1.8 через 1.15 до все сайты имплантации не были обработаны.
  17. Собрать несколько матки, плаценты и плацентарной ткани, чтобы улучшить выход клеток в процессе ферментативного расщепления. Количество ткани зависит от размера помета; Однако, изоляция лейкоцитов требуется> 2 кусочки ткани.
    Примечание: Для получения более подробной информации о вскрытии имплантации сайтов на разных сроках беременности дней, смотреть фотографии, найденные во второй главе Руководства по Investigatiна мышиного беременности 42.

2. матки, децидуальной и плацентарной ткани Диссоциация

  1. Добавьте несколько стерильных 2 мл конические пробирки с соответствующим названием ткани и поместите флакон с 1000 мкл ферментного раствора на льду.
  2. Из чашку Петри с раствором 1X PBS, передавать две части (100 - 150 мг) матки, плаценты, или плацентарных тканей с меченым 2 мл коническую пробирку.
  3. Добавить 500 мкл холодного ферментативного раствора в каждой 2 мл коническую трубку.
  4. С тонкими стерильными ножницами, начинают отделить ткань, погруженную в раствор ферментного пока он не будет мелко измельченного. Со временем, подвеска будет развивать молочный вид. Этот шаг не должен превышать более чем на 2 мин, чтобы предотвратить чрезмерную манипуляции образца.
  5. После того, как ткань была диссоциируют, добавить дополнительные 500 мкл холодного раствора ферментативного к 2 мл коническую трубку.
  6. Поместите коническую трубку 2 мл на льду.
  7. Повторите этапы 2.2 до 2.6 и с каждой отдельной ткани, пока все ткани не будут обработаны.
  8. Перевести все 2 мл конические пробирки с гомогенизированный ткани (фарш ткани + ферментативного раствора) образцов из льда в инкубаторе при 37 ° С и выполнить нежный орбитальной агитацию (80 оборотов в минуту). Выдержите в течение 30 - 35 мин. Убедитесь, что температура в инкубаторе стабилизируется перед началом времени инкубации.
  9. После инкубации, удалить 2 мл конические пробирки с диссоциированных тканей из инкубатора и разместить их на лед, чтобы предотвратить дальнейшее пищеварение.
  10. Добавьте 50 мл стерильные конические пробирки в зависимости от типа ткани. Снимите крышки и заменить их стерильной фильтр клеток (100 мкм размер пор).
  11. Вылейте разложенных ткани от 2 мл конические трубки через ячейки сетчатого фильтра с использованием ~ 20 мл раствора PBS 1x. Фрагменты ткани останется в клеточный фильтр и суспензию клеток будет проходить через него.
  12. Вымойте диssociated ткани в клеточный фильтр 2 - 3 раза по 20 мл раствора PBS 1x использованием передачи пипетки.
  13. Промыть пустой 2 мл конические пробирки с раствором 1x PBS (1 мл) и вылить содержимое через клеточные сита.
  14. Удалить клеточные фильтры из 50 мл конические пробирки и заменить крышки. Центрифуга трубки при 1250 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
  15. Осторожно, аспирата супернатант, не нарушая клеточный осадок. Клеточный осадок содержит отдельные лейкоциты и стромальные клетки.
  16. Повторное приостановить осадок клеток в 1 мл культуральной среды RPMI без сыворотки плода коровы (FBS). Осторожно перемешать. Не используйте вихрь.
  17. Добавить 500 мкл FBS ровными в 5 мл полистирола пластиковой трубки и медленно наложения клеточной суспензии.
  18. Центрифуга в течение 10 мин при 1100 х г без тормоза при комнатной температуре, чтобы осадить жизнеспособных клеток, а клеточный дебрис сохраняется на границе PBS / FBS.
  19. Аспирируйте супернатант, не касаясь осадок клеток. Челл Осадок содержит в основном жизнеспособных клеток.
  20. Дополнительно: сконцентрировать мононуклеарных клеток, используют 20% насыщенный раствор полисахарида, как описано ниже.
    1. Ресуспендируют осадок клеток в 1000 мкл RPMI питательной среды без FBS.
    2. Добавить 1 мл 20% насыщенного раствора полисахарида в 5 мл полистирола пластиковой трубки и медленно наложения клеточной суспензии в верхней части этого раствора, в соответствии с инструкциями изготовителя. В то время как наслоение образца, во избежание смешивания 20% насыщенного раствора полисахарида с клеточной суспензии.
    3. Центрифуга с поворотно-откидной ротор на 500 мкг в течение 30 мин при комнатной температуре без тормоза. Это очень важно, чтобы выключить тормоз, чтобы избежать смешивания клеток и потери градиент. Мононуклеары можно найти в интерфейсе между 20% насыщенным раствором полисахарида и раствора 1X PBS.
    4. Аспирируйте и отбросить супернатант. Клеточный осадок содержит в основном мононуклеарных клеток.
      НетTe: Для выполнения жизнеспособность окрашивание и внутриклеточного окрашивания, см шаг 3. Для выполнения иммунофенотипирование см шаг 4. Для выполнения жизнеспособность окрашивание и только внеклеточный окрашивание см шаг 5. Чтобы выполнить клеточной культуры изолированных лейкоцитов, см шаг 6. Чтобы выполнить Магнитное сортировка клеток, обратитесь к пункту 7.

3. Жизнеспособность Окрашивание для поправимо клеток

  1. Ресуспендируют осадок клеток в 1100 мкл раствора PBS 1x. Осторожно перемешать с помощью микро-пипетки.
  2. Передача 100 мкл суспензии клеток в 5 мл полистирола пластиковой трубки. Добавить 400 мкл раствора PBS 1x в 5 мл полистирола трубки. Это трубка управления тканей автофлуоресценции. Храните в 4 ºC до шага 3.5.
  3. Передача оставшиеся 1000 мкл клеточной суспензии на новый 5 мл полистирола пластиковой трубки. Добавить 1 мкл жизнеспособности красителя и осторожно гомогенизируют. Инкубировать в течение 30 мин в темноте при температуре 4 ° С.
  4. После инкубации, добавить 1000 & #181; л раствора 1x PBS. Осторожно перемешать вручную.
  5. Центрифуга оба 5 мл полистирола пластиковые трубы (шаги 3.2 и 3.3) при 1250 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Аспирируйте и отбросить супернатант.
    Примечание: Осадок клеток (шаг 3.3) будет использоваться в шаге 4. Осадок клеток (шаг 3,2) будет служить в качестве контроля для ткани автофлуоресценции.

4. Иммунофенотипирование

  1. Ресуспендируют осадок клеток в 50 мкл анти-CD16 мыши / CD32 (разбавленного 1: 100 в FACS буфере [0,1% BSA, 0,05% азида натрия, раствор 1X PBS, рН 7,4]). Смешайте клеточной суспензии осторожно. Не используйте вихрь.
  2. Инкубируйте клеточной суспензии в 5 мл полистирола трубки в темноте при 4 ° С в течение 10 мин.
  3. После инкубации, добавление 50 мкл каждого анти-лейкоцитов моноклонального антитела в реакцию с внеклеточным маркеров клеточной поверхности или контрольного антитела изотипа антител (разведений должно быть подтверждено). Например, чтобы проанализировать лейкоцитов субпопуляции, использовать анти-моиспользовать антитела, взаимодействующие со следующими поверхности лейкоцитов маркеров клеточной: CD45, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4, и CD8 (таблица 1).
  4. После того, как антитела против внеклеточного маркеров были добавлены в 5 мл полистирола пластиковой трубки, осторожно перемешать. Инкубируют в темноте в течение 30 мин при 4 ° С.
  5. В течение этого инкубации, готовят и предварительно нагреть фиксации буферный раствор (разбавленный деионизированной водой, 1: 5) до 37 ºC, если это необходимо. Держите буфер на 37 ºC в темноте, пока его использование не требуется.
  6. Через 30 мин инкубации добавить 500 мкл буфера FACS в 5 мл полистирола пластиковой трубки и аккуратно перемешать. Этот шаг необходим, чтобы промыть клетки и удалить излишки несвязанного антитела.
  7. Центрифуга образцов при 1250 х г при 4 ° С в течение 10 мин. Аспирируйте и отбросить супернатант.
    Примечание: Если внутриклеточное окрашивание не требуется, см шаг 5. Если внутриклеточное окрашивание требуется, выполните пермеабилизации и внутриклеточныхулар окрашивание здесь, а затем приступить к фиксации (шаг 4.8).
  8. Добавить 500 мкл подогретого фиксации буферного раствора к осадку клеток и инкубируют в темноте в течение 10 мин при 37 ° С.
  9. Разливают 500 мкл FACS буфера в 5 мл полистирола пластиковой трубки. Осторожно перемешать.
  10. Центрифуга образцов при 1250 х г при 4 ° С в течение 10 мин. Аспирируйте и отбросить супернатант.
  11. Добавить 500 мкл FACS буфера для каждого образца. Эти образцы теперь могут быть проанализированы с помощью проточной цитометрии. Приобретать образцы сразу для лучших результатов.

5. Жизнеспособность Окрашивание для клеток невозможно исправить

  1. После внеклеточной иммунофенотипирования, ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл FACS буфера.
  2. Добавить 1 мкл 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид (DAPI, 200 мкг / мл) непосредственно перед получения образца.
  3. Представьте образцы в течение 1 - 2 мин после добавления DAPI с использованием проточного цитометра.

6. Культура Клеток

  1. Подготовьте рабочее место в стерильной вытяжкой. Предварительно нагреть культуральной среды RPMI до 37 ° С на водяной бане.
  2. Ресуспендируют осадок клеток в 1000 мкл FACS буфера для подсчета клеток.
  3. Подсчитайте количество жизнеспособных клеток, используя автоматический счетчик клеток или гемоцитометр и 0,4% трипанового синий раствор, следуя инструкциям производителя. Запишите общее число живых клеток.
  4. Центрифуга клетки при 1250 х г при 4 ° С в течение 10 мин, чтобы удалить буфер FACS.
  5. Ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл подогретого культуральной среде RPMI, осторожно пипеткой 2 до 3 раз.
  6. Пластинчатый нужное количество клеток в стерильной 24-луночного планшета и инкубировать при 37 ° С. Инкубационный период будет определяться исследования вопроса.

7. Магнитный сотовый Сортировка

  1. Установите чистую рабочую станцию ​​со следующими материалами: MS колонн, разделительных магнитная ячейка, 15мл конические трубки, 30 мкм фильтры грубой очистки, и мульти-стенд.
  2. Ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл буфера MACS (0,5% BSA, 2 мМ ЭДТА, решения 1x PBS, рН 7,2).
  3. С применением автоматического счетчика клеток или гемоцитометра и 0,4% -ным раствором трипанового синего, подсчитывают и записывают общее количество живых клеток.
  4. Центрифуга клеток при 1250 х г при 4 ° С в течение 10 мин. Аспирируйте и отбросить супернатант. Добавить еще 500 мкл буфера MACS.
  5. Продолжать выполнять магнитной сепарации в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя.
  6. Определить чистоту по цитометрии потока или микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рассечение тканей мышиных из интерфейса материнской плода показано на рисунке 1; эта процедура включает в себя открытие в брюшную полость (рис 1а, б), рога матки (рис 1в) в том числе мест имплантации (рис 1D) и сбор маточных тканей (рис 1E), плацента (рис 1F), и децидуальной ткани (Рисунок 1G) на 16,5 DPC. Рисунок 2 показывает морфологию изолированных макрофагах (F4 / 80 +) собраны из п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Коллекция согласованных данных, которая записывает обилие и фенотипические характеристики Лейкоциты проникают в интерфейсе материнской плода имеет важное значение для понимания патогенеза осложнений, связанных с беременностью. Несколько методов было описано, что облегчать отделение проникновение лейкоцитов из мышиных тканей на границе раздела матери и плода во время беременности 31,38,39,43-46. Тем не менее, каждая техника отличается, использует разные ферменты или комбинации ферментов, требуется разное время...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не раскрывают никаких конфликтов интересов.

Благодарности

ШФЛУ при поддержке университета перинатального инициативы Wayne State в материнской, перинатальной и детского здоровья. Мы выражаем глубокую признательность Морин McGerty и Эми Е. Furcron (Wayne State University) за их критическое прочтение рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Magentic Cell Separation
MS ColumnsMilitenyi Biotec130-042-201
Сепаратор клетокMilitenyi Biotec130-042-102
30 μ m фильтры предварительной сепарацииMilitenyi Biotec130-041-407
MultistandMilitenyi Biotec130-042-303
15 мл конические пробиркиThermo Fisher339650
MACS BufferMilitenyi BiotecЛабораторный препарат(0,5% бычьего сывороточного альбумина, 2 мМ ЭДТА и 1x PBS, pH 7,2)
<сильные>Реагенты
Ферментативный раствор аккутазыLife TechnologiesA11105-01
Антимышиный CD16/CD32BD Biosciences533142
Мышиные внеклеточные антителаBD Bioscences/eBiosciencesTable 1
Sodium azideFisherS227-500
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Sigma-AldrichA7906-100G
ЖИВОЙ/МЕРТВЫЙ жизнеспособный красительLife TechnologiesL23105
Фиксирующий буферный растворBD Biosciences558049
FACS БуферBD BiosciencesЛабораторный препарат0,1% БСА, 0,05% азид натрия, 1x PBS, pH 7,4
Раствор трипанового синего 0,4%BIO-RAD145-0013
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Life Technologies16000-044
Дополнительные инструменты
Инкубатор с шейкеромThermoScientific MaxQ 4450
Проточный цитометрBD LSRFortessa
CentrifugeThermo ScientificLegend LXTR
Построен вакуумный системный
ИнкубаторThermo ScientificIncubator 3307
Водяная баняPrecision51221035
Счетчик клетокBIO-RADTC20 Автоматизированный счетчик
Оптические и флуоресцентные микроскопыZeiss и OlympusZeiss LSM780 и Olympus CKX41
комплексклеток

Ссылки

  1. Trowsdale, J., Betz, A. G. Mother's little helpers: mechanisms of maternal-fetal tolerance. Nat Immunol. 7 (3), 241-246 (2006).
  2. King, A., et al. Evidence for the expression of HLAA-C class I mRNA and protein by human first trimester trophoblast. J Immunol. 156 (6), 2068-2076 (1996).
  3. Bonney, E. A., Matzinger, P. The maternal immune system's interaction with circulating fetal cells. J Immunol. 158 (1), 40-47 (1997).
  4. Tafuri, A., Alferink, J., Moller, P., Hammerling, G. J., Arnold, B. T cell awareness of paternal alloantigens during pregnancy. Science. 270 (5236), 630-633 (1995).
  5. Chaouat, G., Petitbarat, M., Dubanchet, S., Rahmati, M., Ledee, N. Tolerance to the foetal allograft. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 624-636 (2010).
  6. Robertson, S. A., et al. Seminal fluid drives expansion of the CD4+CD25+ T regulatory cell pool and induces tolerance to paternal alloantigens in mice. Biol Reprod. 80 (5), 1036-1045 (2009).
  7. Robertson, S. A., Moldenhauer, L. M. Immunological determinants of implantation success. Int J Dev Biol. 58 (2-4), 205-217 (2014).
  8. Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
  9. Rowe, J. H., Ertelt, J. M., Xin, L., Way, S. S. Pregnancy imprints regulatory memory that sustains anergy to fetal antigen. Nature. 490 (7418), 102-106 (2012).
  10. Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
  11. Saito, S., Sakai, M., Sasaki, Y., Nakashima, A., Shiozaki, A. Inadequate tolerance induction may induce pre-eclampsia. J Reprod Immunol. 76 (1-2), 30-39 (2007).
  12. Lee, J., et al. A signature of maternal anti-fetal rejection in spontaneous preterm birth: chronic chorioamnionitis, anti-human leukocyte antigen antibodies, and C4d. PLoS One. 6 (2), 0016806(2011).
  13. Steinborn, A., et al. Pregnancy-associated diseases are characterized by the composition of the systemic regulatory T cell (Treg) pool with distinct subsets of Tregs. Clin Exp Immunol. 167 (1), 84-98 (2012).
  14. Gomez-Lopez, N., Laresgoiti-Servitje, E. T regulatory cells: regulating both term and preterm labor. Immunol Cell Biol. 90 (10), 919-920 (2012).
  15. Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. 23 (10), 46(2014).
  16. Romero, R., Dey, S. K., Fisher, S. J. Preterm labor: one syndrome, many causes. Science. 345 (6198), 760-765 (2014).
  17. Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
  18. Timmons, B., Akins, M., Mahendroo, M. Cervical remodeling during pregnancy and parturition. Trends Endocrinol Metab. 21 (6), 353-361 (2010).
  19. Arck, P. C., Hecher, K. Fetomaternal immune cross-talk and its consequences for maternal and offspring's health. Nat Med. 19 (5), 548-556 (2013).
  20. Erlebacher, A. Immunology of the maternal-fetal interface. Annu Rev Immunol. 31, 387-411 (2013).
  21. Wambach, C. M., Patel, S. N., Kahn, D. A. Maternal and fetal factors that contribute to the localization of T regulatory cells during pregnancy. Am J Reprod Immunol. 71 (5), 391-400 (2014).
  22. Cross, J. C., Werb, Z., Fisher, S. J. Implantation and the placenta: key pieces of the development puzzle. Science. 266 (5190), 1508-1518 (1994).
  23. Georgiades, P., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Comparative developmental anatomy of the murine and human definitive placentae. Placenta. 23 (1), 3-19 (2002).
  24. Croy, B. A., et al. Imaging of vascular development in early mouse decidua and its association with leukocytes and trophoblasts. Biol Reprod. 87 (5), (2012).
  25. Hofmann, A. P., Gerber, S. A., Croy, B. A. Uterine natural killer cells pace early development of mouse decidua basalis. Mol Hum Reprod. 20 (1), 66-76 (2014).
  26. Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy, B. Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
  27. Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
  28. Lash, G. E., et al. Regulation of extravillous trophoblast invasion by uterine natural killer cells is dependent on gestational age. Hum Reprod. 25 (5), 1137-1145 (2010).
  29. Kruse, A., Merchant, M. J., Hallmann, R., Butcher, E. C. Evidence of specialized leukocyte-vascular homing interactions at the maternal/fetal interface. Eur J Immunol. 29 (4), 1116-1126 (1999).
  30. Degaki, K. Y., Chen, Z., Yamada, A. T., Croy, B. A. Delta-like ligand (DLL)1 expression in early mouse decidua and its localization to uterine natural killer cells. PLoS One. 7 (12), 28(2012).
  31. Habbeddine, M., Verbeke, P., Karaz, S., Bobe, P., Kanellopoulos-Langevin, C. Leukocyte Population Dynamics and Detection of IL-9 as a Major Cytokine at the Mouse Fetal-Maternal Interface. PLoS One. 9 (9), (2014).
  32. Blaisdell, A., Erlbacher, E. Ch. 53. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. , Elsevier Academic Press. 619-635 (2014).
  33. Rinaldi, S. F., Catalano, R. D., Wade, J., Rossi, A. G., Norman, J. E. Decidual neutrophil infiltration is not required for preterm birth in a mouse model of infection-induced preterm labor. J Immunol. 192 (5), 2315-2325 (2014).
  34. Plaks, V., et al. Uterine DCs are crucial for decidua formation during embryo implantation in mice. J Clin Invest. 118 (12), 3954-3965 (2008).
  35. Parr, E. L., Szary, A., Parr, M. B. Measurement of natural killer activity and target cell binding by mouse metrial gland cells isolated by enzymic or mechanical methods. J Reprod Fertil. 88 (1), 283-294 (1990).
  36. Arck, P. C., et al. Murine T cell determination of pregnancy outcome. Cell Immunol. 196 (2), 71-79 (1999).
  37. Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. 7 (7), 1-11 (2012).
  38. Li, L. P., Fang, Y. C., Dong, G. F., Lin, Y., Saito, S. Depletion of invariant NKT cells reduces inflammation-induced preterm delivery in mice. J Immunol. 188 (9), 4681-4689 (2012).
  39. Collins, M. K., Tay, C. S., Erlebacher, A. Dendritic cell entrapment within the pregnant uterus inhibits immune surveillance of the maternal/fetal interface in mice. J Clin Invest. 119 (7), 2062-2073 (2009).
  40. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
  41. Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
  42. Pang, S. C., Janzen-Pang, J., Tse, Y., Croy, B. A. Ch. 2. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. , Elsevier Academic Press. 21-42 (2014).
  43. Zenclussen, A. C., et al. Murine abortion is associated with enhanced interleukin-6 levels at the feto-maternal interface. Cytokine. 24 (4), 150-160 (2003).
  44. Mallidi, T. V., Craig, L. E., Schloemann, S. R., Riley, J. K. Murine endometrial and decidual NK1.1+ natural killer cells display a B220+CD11c+ cell surface phenotype. Biol Reprod. 81 (2), 310-318 (2009).
  45. Addio, F., et al. The link between the PDL1 costimulatory pathway and Th17 in fetomaternal tolerance. J Immunol. 187 (9), 4530-4541 (2011).
  46. Shynlova, O., et al. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. J Cell Mol Med. 17 (2), 311-324 (2013).
  47. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
  48. Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
  49. Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
  50. Gordon, K. M., Duckett, L., Daul, B., Petrie, H. T. A simple method for detecting up to five immunofluorescent parameters together with DNA staining for cell cycle or viability on a benchtop flow cytometer. J Immunol Methods. 275 (1-2), 113-121 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Выделение лейкоцитов из мышиного тканей на матери и плода интерфейс
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.