Протокол жилищно мышей в обогащенной среде

Краткое содержание

Обогащение окружающей среды для мышей требует сложной и сложной настройки, а также комплексных методов содержания и обработки, чтобы обеспечить устойчивые метаболические и противораковые эффекты у мышей. Этот протокол содержит подробные процедуры для воспроизведения вышеупомянутых эффектов у мышей.

Аннотация

Обогащение окружающей среды (EE) — это среда обитания для мышей, которая улучшает психическое и физическое здоровье по сравнению со стандартным лабораторным жильем. Наши недавние исследования показывают, что обогащение окружающей среды снижает ожирение, увеличивает расход энергии, противостоит ожирению, вызванному диетой, и вызывает ремиссию рака и торможение у мышей. EE обычно состоит из большего жилого пространства, разнообразных «игрушек» для взаимодействия, беговых колес и может включать в себя ряд других новых изменений окружающей среды. Все это способствует более сложному социальному взаимодействию, когнитивной и физической стимуляции. Важно отметить, что местоположение и тип игрушки регулярно меняются, что побуждает мышей адаптироваться к часто меняющейся и новой среде. В ЭЭ можно манипулировать многими переменными, чтобы усилить воздействие на здоровье мышей. Таким образом, эти подходы трудно контролировать, и ими необходимо правильно управлять для успешной репликации ассоциированных фенотипов. Таким образом, цель этого видео состоит в том, чтобы продемонстрировать, как правильно настроена и поддерживается ЭЭ для обеспечения сложной, сложной и контролируемой среды, чтобы другие исследователи могли легко воспроизвести защитные эффекты ЭЭ против ожирения и рака.

Введение

Экологическая обогащения (EE) является экспериментальной парадигмы использоваться для изучения последствий сложной и сложной обстановке, что не подчеркнуть животных ^1. ЭЭ представляет метод содержания животных состоит повышенной пространства, физической активности и социальных взаимодействий, в свою очередь, увеличивает сенсорные, когнитивные, двигатель и социальной стимуляции ^2. Иглу, ходовые колеса, диски, блюдце труб лабиринты и другие объекты, в окружающей среде жилья способствовать этому сенсорную познавательные, социальные, и двигательное возбуждение, способствуя разведку и взаимодействие. Расположение объектов в изменениях корпуса регулярно представлять новый среду, к которой мыши вынуждены приспосабливаться. Эта стратегия предлагает легкие и краткие вызовы, которые вызывают положительный, доброкачественные и здорового адаптивную реакцию, известную как эустресса, в отличие от более отвращение, враждебной окружающей среды или неадекватного бедствия ^3,4. Способствуя эустресса и ограничения вредных бедствие, мышейпоказать различные благоприятные фенотипов.

ЭЭ является надежным экспериментальной модели с широким диапазоном применений, в то же время лишена элементов традиционно считаются стрессовой ^1. Последствия EE на грызунов были изучены более половины века. В начале 1960-х годов исследования показали, что кортикальные уровни холинэстеразы снизились и подкорковых уровней холинэстеразы увеличена у крыс, которые были размещены в среде с повышенной жилой площади, увеличение количества крыс, и различных деревянных игрушек, лабиринты и платформ ^5,6. Кроме того, Е. Е. связано со многими адаптивных изменений в мозге, поведении, и обмен веществ у мышей разных возрастов и генетических фонов. Поэтому, Е. Е. является полезная парадигма для широкого охвата экспериментов, изучающих влияние окружающей среды на мышах. Эффекты EE можно наблюдать у мышей, как быстро, как одну неделю воздействия, и их можно увидеть в животных, как старый, как восемнадцать месяцев ^7. ЕЕ часто уСЭД в неврологии и нейроповеденческих экспериментов по изучению восстановления функции, обучение и память ^2. Кроме того, Е. Е. имеет значительное влияние на фенотип целого токсина индуцированного и трансгенных животных моделях неврологических заболеваний человека, включая болезнь Хантингтона, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, эпилепсия, инсульт, и более ^2.

Тем не менее, на протяжении многих лет наблюдается несоответствие дизайн обогащение сравнений между исследованиями разных лабораториях трудно. Например, каждый из исследований по ЭЭ эффектов относительно неврологических заболеваний человека, упомянутых выше имели различные параметры для обогащения. Изучение болезни Хантингтона размещены 4-6 мышей в больших клетках (44 х 28 х 12,5 см ^3), содержащих картонные коробки, тоннелей и листов, а также деревянных и пластмассовых предметов, которые были изменены каждые два дня ^8,9. Одно из исследований, проведенных на болезнь Альцгеймера и# 8217; s расположен в 20 мышей в большей клетке (1 м ^​​3), содержащей 2 ходовые колеса, пластиковые трубы, картонные коробки и вложенности материала, которые были изменены или переставить в неделю ^10. Многие установок ЭЭ имеют схожие темы, такие как объекты для запуска или скрыть в, пока количество мышей на EE жилья, гостиной, и период изменения окружающей среды значительно варьируются.

Непоследовательные конструкции EE привели к неудачной репликации эффектов EE. Наши данные по рака и обмена веществ вместе предполагают, что сочетание раздражений, предусмотренных в следующем протокола свинца подробная жилья Е.Е. к значительному анти-рак и против ожирения эффектов ^14,15. Тем не менее, разница в настройках EE, принятые в различных лабораториях может повлиять на результаты ЭО, как видно в одном неудачной попытки воспроизвести эффекты EE на рост конкретных раковых опухолей, имплантированных мышам ^11. Различные результаты могут быть из-за различных причин, начиная сюдат различных темпов роста опухолевых клеток культур в типе используемого моющего средства для очистки корпуса оборудования ^11. Для того, чтобы повторить результаты видны в наших экспериментах, особенно дизайн обогащения и животноводства требуется. Ниже описан корпус EE, который позволит другим исследователям успешно повторить наш эффективную модель обогащения.

Протокол

Процедуры, описанные ниже, были одобрены уходу и использованию комитета Институциональные животных (IACUC) из Университета штата Огайо в.

1. Подготовка обогащенной среды До жилищно мышей

1. Очистка и поддержание инструментов.
   1. Запустите большой бункер обогащению (120 см х 90 см х 76 см), через клетку стирки. Типичный вивария протокол клетка стирки включает в себя от 5 до 6 циклов стирки, с последнего цикла достигает 82 ºC. Вся стиральная должны принять около 40 мин. Высушите мусорное ведро.
      1. Если большая бен обогащение, и любые другие жилищные инструменты, не могут быть отправлены через клетку мыть, затем распылите и протрите внутреннюю часть бункера с спороцидного дезинфицирующих следующих инструкциям производителя. Протрите ящик с водопроводной водой, смоченной бумажной салфеткой или 30% этанола и сухой с бумажным полотенцем, чтобы избавиться от любого запаха от предыдущего дезинфицирующего средства.
   2. Используйте пласкрестики трубки, иглу с блюдцем типа колес, и другие различные пластиковые Хатч, как игрушки в ЭЭ. Вымойте эти игрушки через клетку стирки. Если у вас нет доступа к клетке стирки следовать шаг 1.1.1.1.
   3. Используйте металлические ходовые колеса в ЭЭ. Вымойте колеса через клетку стирки. Если краска на колесах начинает исчезать, так что колесо становится шумным, когда животные работать на него, нанесите небольшое количество вазелина, где колесо и аксель подключения.
   4. Используйте деревянные бревна в ЭЭ. Очистите журналы, удалив все постельные принадлежности или другой мусор вручную. Затем стерилизовать автоклавированием журналы их на сухой цикла или текстильного цикла, который достигает температуры 121 ° С в течение 15 мин.
   5. Используйте клетки между размерами 29 см х 18 см х 12,5 см и 30,5 см х 19 см х 14 см, чтобы провести провод питания и питьевой rack.Cut отверстие, по меньшей мере 5 см в диаметре из передней нижней части клетки для мышей идти в и из с EE. Очистите эти кормления клетки через клетку стирки.
2. Настройка среды
   1. Налейте ¼-дюймовый кукурузного початка лабораторных животных кроватях в большой бункер обогащения. Покройте всю поверхность пола в бункер на глубину 2-2,5 см с постельными принадлежностями.
   2. Поместите два или три бревна в одном углу ведро. Место журналы в углу, чтобы изолировать площадь около 1225 см ^2. В области поглощенных в журналах, разместить три иглу с блюдцем колес на вершине. Убедитесь, что колеса не касаясь стен бункера, журналов, или друг с другом, так что есть достаточно места для колеса свободно вращаются.
   3. Часть вместе пластиковых труб, так что филиал многорукавность из centeral соединительного элемента. Поместите эту трубку в середине бункера.
   4. В двух углах бункера, разместить одно кормление клетку каждый наполненный той же постельные принадлежности, как бункер, а отверстие в передней части подающего клетке должна быть обращена к центру бункера. На вершине этих питающих клетках чистой пищи и воды проволокидолжны быть размещены провести пищу и воду. Не ставьте крышку на клетку. Положите еду и воду в клетке проводов.
   5. Поместите три металлических колеса в бункере, хотя и не все рядом друг с другом. Три различных типов колес один 11,5 см колеса, одно колесо 20.5 см, и один 28 см колеса. Затем поместите более 4-5 пластиковые клетка, как игрушки или туннели в течение бен обогащения.
   6. Накройте лоток с микро-изолятор фильтровальной бумаги. Используйте зажимы, чтобы обрезать бумагу фильтра в мусорное ведро.
   7. Новизна важно EE. Используйте эту установку в качестве рамках ЭЭ и варьировать размещение вышеуказанных клеток, объектов и игрушек, чтобы создать новый среду для животных.

2. Корпус Животные

1. Породы животных для экспериментов в лаборатории регулярно жилья и не EE. При желании, поставить животных в EE уже как 21 дней в возрасте от отъема. Генотип и ухо удар / теги животного до EE жилья.
2. При размещенииживотные в мусорное ведро обогащения от стандартной клетке, разместить клетку в мусорное ведро на его стороне, так что животные могут свободно перемещаться из стандартного клетке в мусорное ведро обогащения. Не позволяйте гнездования материалы должны быть переданы в мусорное ведро обогащения.
3. Дом 10-20 животных того же возраста, пола и генетического напряжения в ЭЭ.

3. Поддержание окружающей среды и соблюдения Мыши во время учебы

1. Ежедневно
   1. Спокойно наблюдать животных на наличие признаков болезни или бедствия. При необходимости, осторожно обращаться с животными для дальнейшего проверить состояние здоровья. Запись аномальные наблюдения и консультации специалиста здравоохранения или ветеринар персонал, если животное демонстрирует условиях, которые требуют удаления из эксперимента.
   2. Обеспечить местное лечение с тройной антибиотик мазь для небольших ран или струпья. Если животное должно быть удалено из-за хронической болезни или травмы, удаления животного из эксперимента для эвтаназии. Если животныхсоответствовать критериям раннее удаление для осуществляющего надзор животных исследования ухода комитета или ветеринаром, не вернуться животных обратно на EE.
2. Дважды в неделю
   1. Проверьте уровень корма и воды. Убедитесь, что корма и воды хватит на ближайшие 3-4 дней. Распрямись ходовых колес и игрушки обогащению, так что они распределены и могут быть использованы мышей. Заменить, которые являются слишком грязная.
3. Еженедельно
   1. Замените бутылки воды с чистыми бутылок воды. Перестановка по обогащению устройств в манере, которая следует за настройку в разделе 1.2. пока отличается от установки предыдущей недели.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если эксперимент требует животных должны быть удалены из обогащенного среды для деятельности (запись вес тела, кровяное ничью, тестирование поведения и т.д.) лучше, чтобы изменить окружающую среду в то время как животные находятся вдали от бункера обогащения.
   2. Очистите кормления клетки в EE от руки или отправить его через клетку стиркикак описано в Разделе 1.1.5. Замените проволочные стойки, которые держат пищу и воду с чистыми решетках, а также.
   3. Следуйте инструкциям в разделе 2.2. При размещении животных обратно в обогащении. Выборочная проверка остальной большой бункер обогащения и чистым, в случае необходимости, черпая из грязной подстилки и распространение вниз новый чистый постельные принадлежности.
4. Би-еженедельно
   1. При выполнении еженедельный хозяйство, очистить игрушки вручную или отправить через клетку мыть, как описано в разделе 1.1.2. При необходимости разместить мышей в стандартном микро-изолятор клетке в течение времени, необходимого для очистки.
5. Ежемесячно
   1. Очистите большинство помета путем перемещения игрушки обогащению и кормления клетки и черпая из помета. Замените свежим помета. Убедитесь, что есть один дюйм постельных принадлежностей во всех областях клетке. При необходимости разместить мышей в стандартном микро-изолятор клетке в течение времени, необходимого для очистки.
6. Каждые триМесяцев (или в конце эксперимента)
   1. Удалить все постельные принадлежности и игрушки и чистить и дезинфицировать бункер обогащению, как описано в разделе 1.1.1. Если эксперимент продолжается, замените его новым постельным бельем, кормление клетки, ассортимент игрушек, а затем вернуться мышей в мусорное ведро.
7. Лечить весь бункер обогащению чаще, чем раз в три месяца, если это требуется исследовательского института, в котором размещены ЕЕ. Если это необходимо, а другой большой контейнер обогащение доступно, настроить дополнительный контейнер обогащению, как описано в разделе 1.2. и передачи животных в новый контейнер, а предыдущий очищается.

4. Контроль Условия для дома

1. Дома животных в контрольной группе в микро-изолирующих клеток размеров 30.5 см х 19 см х 14 см. Включите решетку в клетке для проведения питание и бутылку воды, если клетка не подключен к автоматической системе полива.
2. Обеспечить тот же кукурузного початка постельные принадлежности в контрольной клетке, как это в EE. Обеспечить 4 см х 4 см nestlet для мыши, чтобы сделать гнездо из.
3. Заменить и / или очистки клетки, кормление провода, пищу и воду один раз в неделю. Чистый клетки и провода стойки через клетку мыть или как указано в разделе 1.1.1.1. Очистите клетки чаще, если животные мочится чаще, или если питьевой воды утечки на постельные принадлежности.
4. Монитор здоровья животных в жилищном управления ежедневно. Убедитесь, что у животных есть много еды и воды.
5. Дом 3 ~ 5 мышей одного пола в регулярном клетке мыши. Не предоставлять любую игрушку, трубки, или клетка в клетке.
6. Институциональные лаборатория по уходу за животными в учреждениях здравоохранения и лаборантов могут обеспечить хозяйство для этих контрольных мышей.
7. Держать животных на 12 ч циклом свет / темнота, как для мышей в ЭЭ.

Результаты

EE влияет на экспрессию фактора роста, увеличивает нейрогенез и выживание клеток в центральной нервной системе (ЦНС) ^12,13. Более поздние исследования показали, что этот метод ЭЭ приводит к замечательному подавления роста раковых в моделях рака три мыши в том числе меланомы В16, рак толстой кишки МС38 и APC ^{мин / +} мыши, который содержит мутацию зародышевой линии и очень чувствительны к спонтанному образованию аденомы в кишечник ^14. Результаты На рисунке 2 подтверждают подавление роста опухоли меланомы В16 имплантированы в мышей, подвергнутых EE в течение 5 недель (~ 80% снижение массы опухоли). Подавление роста рака даже наблюдается у мышей, когда EE был инициирован после опухоль была создана ^14. Е. привело к увеличению ингибирования роста меланомы в высоким содержанием жиров индуцированного ожирения у мышей (~ 70% уменьшение массы опухоли), чем у мышей с нормальным весом (~ 50% уменьшение массы опухоли) ^14. Е. экз uced изменения подписи в сыворотке крови биомаркеров, включая надежные капли лептина, снижение IGF-1, и повышение уровней адипонектина ^14.

Кроме того, эта методика снижает EE ожирение, увеличивает расход энергии, приводит к устойчивости к индуцированным диетой ожирением, и индуцирует белого до коричневого жира переключатель фенотипической путем активации гипоталамо-sympathoneural-адипоцитов оси ^15. Уменьшение ожирением было замечено уже через шесть дней, подверженных EE (3А, Б) и снова подтвержден в животных, подвергнутых EE в течение четырех недель (фиг.3С, D). Важно также отметить, что, один, противораковое и против ожирения эффекты, связанные с ЭЭ, не могут быть учтены при физической активности в покое, и, два, эффекты EE могут быть воспроизведены с помощью сверхэкспрессии мозгового нейротрофического фактора (BDNF ) в гипоталамусе ^14,15.

2874fig1.jpg "/>
Рисунок 1: Обогащенный среда бен настроить обогащенный среда имеет площадь 120 см х 90 см и состоит из двух модифицированных клеток, ходовых колес, иглу с блюдцем колес, пластиковых труб, деревянных бревен и других игрушек пластик обогащению..

Рисунок 2: Обогащенный среда снижает рост опухоли в мышей-самцов C57BL / 6 Три недели самцов мышей дом в EE или управления клетках в течение 5 недель до прививки опухоли.. В16 веса опухоли меланомы в 17 дней после прививки 10 ⁵ клеток на животных подкожно выше правого фланга (п = 10 в каждой группе. Т -теста Студенческая, * р <0,05).

S / ftp_upload / 52874 / 52874fig3c.jpg "/>

Рисунок 3: Обогащенный среда уменьшает ожирение у мышей C57BL / 6 мышей-самцов три недельных мышей подвергали EE;. одна группа в течение 6 дней, еще в течение четырех недель. () Шесть дней в EE снизилась жира веса панели (п = 5 в группе. Т -test Студенческая, * р <0,05). (Б) Шесть дней в EE снизилась жира веса площадку по отношению к массе тела (N = 5 в группе. Т Испытайте Стьюдента, * р <0,05). (С) четыре недели в EE снизилась жира веса панели (п = 5 в группе. Т -test Студенческая, * р <0,05). (D), четыре недели в EE снизилась жира веса площадку по отношению к массе тела (п = 5 в группе. Т Испытайте Стьюдента, * р <0,05). БАТ: бурая жировая ткань, IWAT: паховая белой жировой ткани, EWAT: придатка белый жировой ткани,RWAT: забрюшинного белой жировой ткани.

Обсуждение

Надежные эффекты EE на экспрессию генов в мозге, снижение ожирения и рост рака у мышей в значительной степени зависят от способности исследователя, чтобы сохранить новый среду и справиться животных таким образом, что способствует физической активности, социального взаимодействия и когнитивные проблемы, но не бедствия животных. Есть два самых важных процедурных шагов, чтобы помнить. Во-первых, помните, чтобы изменить размещение игрушки, предметы и клетках каждую неделю. Даже несмотря на то, игрушки и объекты могут быть такими же, на предыдущей неделе, мышей воспринимать окружающую среду как роман. Изменить игрушки и сами объекты с различными них каждую неделю. Во-вторых, помните, чтобы сохранить окружающую среду чистой. Если загрязнен постельных принадлежностей не удаляются, повышенные уровни азота может быть стресс для животных.

Кроме того, есть много методов, чтобы отметить в этом протоколе EE. Использование различных уникальных или игрушек и разныедизайн пластиковых труб лабиринты приветствуется. Среда может быть сложной, но не должно представлять угрозу для здоровья животных. Кроме того, опасаться игрушек, которые являются дисфункциональными, потому что дисфункциональные игрушки увеличить риск конечностей мыши попасться, или может быть токсичными для животных, если потребляется жевательной на нем. Один постоянной в ЭЭ является использование трех блюдца колес на верхней части иглу, поглощенных к углу или стороне бункера 2-3 бревна. Это настройка работает блюдца, лежащие бревна присутствует во всех наших исследованиях по обогащению. С точки зрения использования и размещения других объектов, описание компоновки выше основополагающим синий печать установки EE. Изменение настройки с этой основополагающей рамках пластиковой трубки, ходовые колеса, работает блюдца, клетки и журналы должны обеспечить достаточный среду новый воспроизводить полученные результаты.

При работе с трансгенными животными, которые имеют диабет или другие метаболическиезаболевания, обратить пристальное внимание на потребление корма и воды, чтобы гарантировать, что животные не закончились еда и вода. Если животные имеют диабет, они мочеиспускании больше, так постельные корпуса EE возможно, должны быть проверены и местом очищать чаще. Места в корпусе EE, что нужно постельное белье удалены наиболее часто углы. Запомнить для регулировки колес и другие игрушки, так что они могут быть использованы животных. Животные способны работать блюдце колеса в постельных принадлежностей и стучать ходовые колеса более. Если животные молодые, от 3 до 5 недель от роду, они могли бы копать под клетками в EE и скрыть вместе под там, оставив исследователь невежественный, где животные. При удалении загрязненную постельные принадлежности, игрушки замены или чистки клетки, он предложил поставить животных в чистой стандартной клетке так, чтобы не подчеркнуть их, регулируя их окружающую среду. Это проще получить все животные в одной клетке, если они имеют меньше места, чтобы скрыть в окрironment. Таким образом, устранение игрушки до секвестрации животных в клетке делает процесс легче. Кроме того, не ставьте больше, чем 5-6 животных в одном стандартном клетке в ожидании очистки или регулировки их среды EE. Мужские животные EE могут быть агрессивными, особенно, когда ЕЕ начато в зрелом возрасте. Таким образом, важно соблюдать условия для любых раненых или убитых животных.

Кроме того, типичное количество животных мы дом в EE для этого большого размера контейнера составляет 10-20 мышей. Другие исследователи используют ЭЭ варьировать количество животных, используя около 10 или меньше мышей, и размер клетки или бункера должны быть приняты во внимание при определении числа животных в дом в ЭЭ. Слишком много животных в живом окружающей среды может привести к агрессии у самцов мышей. Мышей мы расположены в EE был из C57BL / 6 происхождения. Мыши из других штаммов могут быть более или менее агрессивны, или более склонны к проблемам со здоровьем вэта установка EE. Это должно быть принято во внимание при определении плана сельскохозяйственные методы для мышей и обогащенного среды.

Четыре недели EE Корпус достаточно, чтобы вызвать снижение ожирения, снижение уровня лептина, и ингибирование роста меланомы В16. Более EE может привести к более сильным действием на метаболизм и торможения рака. Если мышей подвергаются хирургических процедур во время или перед воздействием ЭЭ, они могут быть размещены со швами интактных. Будь или не животные реагируют на данном установки EE с хирургическими скобками или катетеров интактных не изучен. Кроме того, в настоящее время мы исследуем, как это влияет на особенности ЕЕ продолжительность жизни или сохранении здоровья стареющих животных. Предварительные данные показывают, что женщины C57BL / 6 мышей, 10 месяцев от роду, реагировать на EE аналогично молодых мышей. Одним из ограничений корпуса ЭЭ размещения такой большой бункер в пространстве за животными, и предпочтительно в определенный пол комнаты. Таким образом, будущие исследования на эфECTS ЭЭ в меньшем масштабе, а также нахождение игрушки, которые легко моются, выдерживать высокие температуры очистки и безопасны для здоровья животных, улучшит применение ЭЭ в метаболических и онкологических исследований.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Большой контейнер для обогащения (120 см x 90 см x 76 см)	Изготовлен на заказ.	На заказ.	Изготовлен из полипропилена. Края бункера имеют толщину 1,5 см.
Альтернативный большой бункер для обогащения (120 см x 110 см x 76 см)	Global Industrial	155202	При необходимости этот контейнер может быть альтернативой вышеуказанному.
Habitrail Mini tubes	Habitrail	62720; 62705; 62725; 62715; 62054-Пластиковые
иглу с колесами-блюдцами	Bio Serv	K3327; K3250-Металлические
беговые колеса	Super Pet	61392; 61394; 61396-Палочки
для грызения древесины Manzanita, 3"	Bio Serv	W0016
Туннели для мышей	Bio Serv	K3322-Клетки
для мышей, которые помещаются в большой контейнер EE.	Lab Products Inc	10027 Мышиная клетка-клетка
Klenz 180 Щелочное средство для мытья клеток, Клетка Klenz 250 Кислотное моющее средство	Steris Life Sciences	1K1802; 1K2502	Эти моющие средства используются при мытье клеток для игрушек, больших контейнеров для обогащения и клеток.
Sporklenz	Steris Life Sciences	6526Q8	Альтернативное спорицидное/дезинфицирующее средство для мытья игрушек, мусорных ведра и клеток в клетках.
Постельное белье Bed-O-Cobs 1/4"	The Andersons, Inc.	4B	Подстилка из кукурузных початков имеет диаметр 1/4 дюйма.
Гнезда для борьбы с содержащимися мышами	Ancare		Cotton squares