Генерация местных СА1 γ колебаний тетанических стимуляции

Мозг сети колебания происходят в пределах отдельных частотных диапазонах, которые коррелируют с поведенческими государств. У грызунов, гиппокампа θ колебания (5 - 10 Гц) наблюдается во время разведочных поведения ^1,2, в то время как γ колебания (20 - 80 Гц) ассоциируются с различными когнитивными процессами, в том числе восприятия и внимания ^3,4. Синхронный γ сетевую активность также вовлечен в патологии расстройств, таких как эпилепсия, шизофрения ^5,6. Например, γ колебания думал соответствуют областям коркового эпилептического очага ^5,7,8 и могут быть использованы в качестве маркеров pharmacosensitivity или сопротивления, два важных областей исследования в эпилепсии исследованиях ^9.

Гиппокампа ломтик мозг модель, которая была широко используется для исследования сетевой активности ^10-12. Различные протоколы были разработаны для создания γ колебания в срезах мозга, что, как правило, яnvolve фармакологическая модуляция таких, как низкая Mg ^2+, 4-аминопиридин (4AP), бикукуллина и каиновой кислоты ^12-17. Недостатки фармакологически вызвали колебаний в том, что они происходят случайным после применения препарата и не надежно генерируется или стабильным во времени. Электрически срабатывает γ колебания преодолеть многие из этих проблем, а также имеют то преимущество, что временно заблокированы стимулирующего случае позволяет эпизодической записи и анализа. Вот протокол описывается для генерации СА1 γ колебания, предоставляя тетаническое стимуляции рогового ORIENS в гиппокампе срез.

Все эксперименты на мышах были утверждены этики животных комитета Флори институт.

1. Установка для резки Brain фрагменты

1. Подготовка режущей раствора, содержащего (мм) 125 холин-Cl, 2,5 KCl, CaCl _2, 0,4, 6 MgCl _2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, 20 D-глюкозы, насыщенный карбогена газа (95% O ₂ -5 % искусственный спинномозговой жидкости СО ₂₎ и (ACSF) записи раствора, содержащего (мм) 125 NaCl, 2,5 KCl, CaCl _2, 2, 2 MgCl _2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, 10 D-глюкозы, насыщают карбогена. Поместите режущий решение на льду держать его холодно.
2. Замораживание около 400 мл раствора режущего и смешать вместе с 100 мл размороженной режущего раствора для создания суспензии льда. Пузырь с карбогена (95% O _2, 5% CO ₂₎ при скорости потока приблизительно 0,5 л / мин через небольшой Cтрубки алибер или спеченного стекла, чтобы произвести устойчивый, но мягкий поток пузырьков.
3. Приготовьте 250 мл химический стакан с повышенной вставкой нейлон сетки, на которой срезах мозга будет размещена. Залейте ACSF, чтобы покрыть сетку примерно на 2 см и пузырь с карбогена, убедившись, что пузыри не непосредственно нарушить область ломтик холдинга. Важно также, что нет пузырьков воздуха в нейлоновую сетку, так что, если они присутствуют удалить их. Это будет удерживающей камеры и выдерживают при комнатной температуре (20 - 25 ° C).
4. Макет рассекает инструменты в том числе большой ножницами, небольшой ножницами, малых и больших микро шпателей, и больших и малых пар щипцов и охладить их на льду. Поместите vibratome ткани резки блока на льду на площади алюминиевой фольги. Получить 2 части 6 см фильтровальной бумаги, одним лезвием бритвы края, и стакан 25 мл, наполненный суспензии резки решения, а также.
5. Заполните второй контейнер со льдом, и лежал кусок ткани папэ на льду и поместить 12 см культуры блюдо на вершине. Заполните культуры блюдо с режущим решение суспензии льда и пузырь с карбогена. Это контейнер, в котором осуществляется с рассечение мозга.
6. Подготовка vibratome. Удалить свежий обоюдоострым лезвием бритвы (использовать свежие лезвия каждый раз) из упаковки и спрей с 80% этанола, затем деионизированной воды. Вырезать 3 мл пластиковой пипетки передачи в точке, где она начинает сужаться. Это будет использоваться для передачи срезах мозга. Изгиб иглы 27 G у основания примерно 45 ° и прикрепить к 1 мл шприца. Это будет использоваться, чтобы управлять во время резки ломтиками.

2. Резка Мозговые фрагменты

1. Обезболить мышь (P16 - P18) с 2% изофлуран или локально утвержденного метода. После индукции обезглавить животное с большим ножницами и падение головой в 12 см культуры блюдо, которое содержит ыми суспензии резки решение. Суспензия должна полностью погрузиться в головубыстрое охлаждение.
2. Держите переднюю часть головы с одной стороны пилинг кожи и соединительной ткани вперед к носу. Использование маленькие ножницы сократить соединительной ткани, чтобы выявить основную череп. Затем снимите мышцы вышележащих спинной части черепа и шеи.
3. Удалить мозг от черепа сначала обеспечить переднюю часть черепа с большими щипцами, а затем сделать две боковые разрезы через кость обе стороны от затылочного отверстия, используя маленькие ножницы (фиг.1, порезы, обозначенные A1 и A2).
   1. Сделайте еще ​​один разрез между глазами (только передняя часть темени) (рис 1, вырезать помечены В) затем тщательно вырезать вдоль стреловидного шва вперед и отражают сокращение черепа разделы, раскрывающие мозг (рисунок 1, вырезать помечены C).
   2. Используйте маленькую лопаточку, чтобы выкопать мозг и место на культуральной чашке. Будьте в курсе CRANМВЛ нервы на нижней аспекте мозга, которые будут должны быть разорваны, это может быть сделано с помощью меньшего размера микро шпателя. Использование больших шпателя передачи мозг в стакан 25 мл, наполненную суспензии резки раствора.
4. Подготовка полушарие мозга для нарезки.
   1. Поместите один кусок фильтровальной бумаги диаметром 6 см в нижней части свежей культуральной чашке затем заполнить со свежим раствором суспензии резки и пузырь. Использование большего шпателем в положение мозг, вентральной стороной вниз, на фильтровальную бумагу. Возьмите новый и очищенный одного края лезвия бритвы и сократить мозг, чтобы удалить мозжечок, а затем сделать разрез по средней линии, чтобы отделить мозг в двух полушариях.
5. Подготовка блока vibratome ткани.
   1. Возьмите охлажденную блок vibratome ткани, высушить поверхность, и поместите каплю клея цианакрилатного в середине и равномерно на приблизительный размер мозга. Используйте маленькую лопаточку, чтобы манипулировать одним измозговые полушария на большой микро шпателем так медиальной стороне мозга вниз.
   2. Сенсорный край шпателем на границе головного мозга на второй лист фильтровальной бумаги, чтобы удалить как можно больше раствора, как это возможно. Слайд мозг от крупных шпателем с использованием меньшего шпателя, чтобы направлять его на клей.
   3. Безопасный режущий блок в vibratome камеры и заполнить камеру с режущей раствора суспензии и пузырь, обеспечивая мозг полностью погружен. Поверните режущий блок так, брюшная сторона мозга сталкивается лезвие.
6. Нарезка мозг.
   Примечание: Каждый vibratome является уникальным, так следуйте инструкциям производителя.
   1. Установите толщину среза до 450 мкм, и обеспечить лезвие вибрирует, как она движется через мозг со скоростью примерно 0,3 мм / с. Вырезать полностью через мозг от брюшной стороны к поверхности коры, это будет производить весь мозг сагиттальных, которые могут бе используется для электрофизиологических записей. Ломтики будет выпускаться в поперечном направлении медиально и, как правило, 3 - 4 ломтики могут быть вырезаны из каждого полушария.
   2. Если база ломтик лифтов использовать согнутую 27 G иглу нежным прессы ломтик вниз. Поскольку каждый ломтик разрезать, используйте пипетки передачи, чтобы переместить его на платформу в удерживающей камере, где они жизнеспособны до 8 часов.

3. Внеклеточные электрофизиологии Записи

1. Монтаж кусочек в записи камеры.
   1. Использование передачи пипетки, поместите кусочек мозга в погруженном записи камеры перфузии ACSF течет по 1 - 2 мл / мин и нагревали до 32 ° С. ACSF используется для записей отличается от того, в холдинг камеры, как ²⁺ концентрация Mg увеличивается от 2 до 4 мм.
   2. Закрепите кусок с арфой "" (полукруглой нержавеющей стали с нейлоновыми нитями растянутых по крайней 2 - 3 мм пробелами). Местоарфа, так что пряди идут параллельно СА1. Увеличение скорости перфузии до 8 - 10 мл / мин при 32 ° С.
2. Под микроскопом рассекает месте стимулирующий электрод и записи электрода (стеклянный электрод заполнен раствором записи ACSF) на поверхности рогового radiatum в СА1 (фиг.2А). Поместите стимулирующий электрод сначала поместите записи электрода.
3. Стимулировать Шаффер залогов с 120 - 150 мкА амплитуды и 0,1 мс тестового импульса длительностью и наблюдать результирующее поле возбуждающим сообщению синаптическую потенциал (fEPSP) сигнала, чтобы определить здоровье ломтик (рис 2B). Стимулирующее и записи электроды могут должны быть перемещены в часть около 50 - 100 мкм от поверхности среза, чтобы получить fEPSP записи с мелких волокон волейбол и большой амплитудой. Шаффер залога вызвал fEPSPs являются стереотипными и обеспечить хороший показатель здоровья среза. Нealthy ломтики обычно показывают волокна ударом с fEPSP отношение амплитуд менее 0,3.
4. Перемещение электродов.
   1. Использование рассекает микроскоп, переместить стимулирующий электрод к середине рогового ORIENS и перемещать записи электрод к пирамидальной слоя клеток как можно ближе к регистрирующего электрода, насколько это возможно, как показано на фигуре 3А. Стимулирующее и записи электроды, возможно, потребуется толкнул в срезе примерно 50 - 100 мкм, так что амплитуда ответа fEPSP в 120 - тест мкА импульса 150 составляет примерно 1 мВ.
5. Создание γ колебания.
   1. Для создания γ колебания стимулируют ткани с поездом 20 х 0,1 мс импульсов поставляемых на 200 Гц. Это тетаническое стимулом может дать ответов воспроизводимых при доставке каждые 5 мин.
6. Используйте следующие параметры записи.
   1. Масштаб усиления выходного сигнала, чтобы соответствовать диапазон входного напряженияаналого-цифровой преобразователь. Убедитесь, что максимальный ожидаемый экскурсия сигнал использует минимум 30% от диапазона входного напряжения. Будьте осторожны при установке выгоды для высоко, как сигналы могут обрезать. Необходимы для полевых записей типичный пропускная способность составляет 500 Гц с AC связи на 0,1 Гц, чтобы удалить базовой линии.
   2. Оцифровка по крайней мере 4 - 5 раз быстрее, чем угловой частоты фильтра низких частот, чтобы избежать наложения сигнала.
7. Анализ данных.
   1. Данные фильтр высоких частот на 5 Гц, чтобы удалить любые базовые изменения. Определить шипы, используя порог производной, с минимальным отрывом событий 10 мс, характерное время событий в пике, и регрессия интервалом 7 мс, порог ~ 100 мВ / мс, и разделяющей долины 100%. Рассчитать задержки, как время, необходимое для первого идентифицированного шип происходить после окончания стимуляции артефакт. Этот анализ позволяет для характеристики числа пиков, задержки интервала между событий, и продолжительность рассчитывается какследующим образом:
   2. Рассчитать количество шипов, как общее количество шипов на колебания на каждой развертки определяется.
   3. Рассчитайте задержку колебаний. Для каждого колебания, вычесть время первого идентифицированного шипа от конца стимуляции артефакта.
   4. Рассчитайте средний интервал между событий (ISI). Определите период времени между несколькими обнаруженных шипами и среднего.
   5. Рассчитать продолжительность колебаний. Измерьте время между первым и последним обнаруженным шип в каждом колебании.

Тетанических стимуляция пластовых ORIENS генерируется надежные и воспроизводимые γ колебания (35,4 ± 2,2 Гц), рис 3B. Чтобы продемонстрировать, что колебания были получены в локальной сети СА1 входы от СА3 были разорваны путем разрезания срез в области CA2 с помощью изогнутого 32 G иглу. Свойства колебаний в нарезать кусочками не отличаются от необработанных срезов (р = 0,85; нарезать кусочками 6.16 ± 1.1 шипами, N = 6; необработанных ломтиков 5,89 ± 0,8 шипы, п = 6), указывая, что колебания локально.

Важным преимуществом этого метода является стабильность записи. Когда столбняк был доставлен в 5-минутными интервалами колебания были стабильны в течение, по крайней мере 30 мин для любого данного среза (р = 0,26 для числа шипов на 15 мин против 30 мин). Существует вариабельность между фрагментами в общем количестве шипов в пределах колебаний и других параметров. Для Dковер исследования парные эксперименты можно сделать так, что различия в исходных свойств незначительные факторы. Для изменчивости сравнений внутри ломтик может быть проблемой и может быть преодолена путем достаточно питания сравнений.

Далее, были исследованы ионные каналы и рецепторы, которые необходимы для генерации этих tetanically стимулированных СА1 γ колебаний. Фармакологическое блокада α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты (АМРА) рецепторов с 20 мкМ 6-циано-7-нитрохиноксалин-2,3-дион (CNQX) (фиг.4А, В), ГАМК Через рецепторы с 20 мкМ бикукуллина (фиг.4С), я ч тока с 20 мкМ 4- (N-этил-N-фениламино) -1,2-диметил-6- (метиламино) хлорида пиримидиний (ZD7288) (рис 4D), и Т-типа Са 2+ каналы с 100 мкМ Ni 2+ (рис 4E) были независимо друг от друга в состоянии уменьшить количество шипов, генерируемых(Р <0,05; CNQX N = 6; бикукуллин п = 7; ZD7288 N = 6; Ni 2+ N = 6). Применение (2R) -амино-5-phosphonopentanoate (AP5, 20 мкМ) не влияет на количество шипов (р = 0,22; N = 5; АР5 5,9 ± 3,1 шипы, контроль, 8.3 ± 2.2 шипов), предполагая, что рецепторы NMDA не участвует в γ поколения колебаний в данном препарате.

Этот препарат является идеальным для определения сети масштаба действие лекарств. Ретигабин является клинически используется анти-эпилептик лекарства, которые открывает калиевые каналы и снижает возбудимость мембраны 18-20. Ванна применение ретигабина производится снижение дозы зависит от числа шипов в и продолжительность колебаний (рисунок 5).

Рисунок 1. Схема черепа и прилегающая кожа показывая расположение разрезов, чтобы повторно телятины мозг. А1, А2, В и С отмечают местоположения сокращений, которые должны быть сделаны, чтобы открыть череп для удаления мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. Размещение стимулирующих и регистрирующих электродов в СА1 Шаффер залогов здоровья тест среза. () Показывает размещение стимулирующего электрода (Stim) и регистрирующего электрода (Rec). (Б) типичный пример fEPSP вызвали на 120 мкА стимуляции (волокна залп отмечены *). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы смотреть больше Версия этой фигуры.

Рисунок 4. Фармакологическая характеристика tetanically Generованные γ колебания. (A) представитель след демонстрируя эффект CNQX. Графики, показывающие эффект (B) CNQX (20 мкм, N = 6), (С) бикукуллин (20 мкМ; п = 7), (D) ZD7288 (20 мкМ; N = 6) и (Е) Ni 2+ (100 мкМ; N = 6) по количеству шипов. Данные представлены в виде парных сравнений. * Р <0,05, ** р <0,01 и *** р <0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5. ретигабина воздействие на свойства сети. Типичные примеры, показывающие снижение сетевую активность индуцированных колебаний (А) в контрольных условиях и (В) и <сильный> (С) ретигабина. Краткое изложение эффектов, показанных в (D) Количество шип, (Е) Продолжительность колебаний, (F), чтобы задержки начала колебаний, и (G) интервала между шип (ISI). Данные представлены в виде парных сравнений. * Р <0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторы не имеют ничего раскрывать.