Методическая статья

Реализация In Vitro Лекарственной устойчивости Анализы: Максимизация потенциала для раскрытия клинически значимых механизмов сопротивления

DOI:

10.3791/52879

⸱

9 декабря 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1H3 Biomedicine, 2Massachusetts General Hospital

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лекарственная устойчивость к таргетной терапии широко распространена, и необходимость выявления механизмов устойчивости - до или после клинического начала - имеет решающее значение для руководства альтернативными стратегиями клинического ведения. В данной работе мы представляем протокол сопряжения производных лекарственно-устойчивых линий in vitro с секвенированием для ускорения открытия этих механизмов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя таргетная терапия изначально эффективна, неизбежно возникает резистентность. Несколько методов, таких как генетический анализ устойчивых клинических образцов, были применены для выявления этих механизмов резистентности и облегчения последующего ухода. Несмотря на то, что эти подходы привели к клинически значимым открытиям, трудности в получении соответствующего материала пациента или в деконволюции геномных данных, собранных из этих образцов, серьезно затруднили путь к излечению. С этой целью мы описываем здесь инструмент для быстрого открытия, который может помочь в улучшении терапии первой линии и альтернативных стратегий клинического ведения. Сочетая доклинический отбор лекарств in vitro или in vivo с секвенированием нового поколения, можно идентифицировать структурные вариации генома и/или изменения экспрессии генов, которые могут служить функциональными факторами резистентности. Такой подход способствует спонтанному возникновению изменений, повышая вероятность того, что эти механизмы могут наблюдаться у пациентов. В этом протоколе мы предоставляем рекомендации по максимальному раскрытию однонуклеотидных вариантов, которые вызывают резистентность с помощью адгезивных линий.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подробное молекулярная характеристика опухолевых геномов по надежных технологий секвенирования и улучшение данных аналитических инструментов привело к открытию ключевых генетических изменений в конкретных видах рака 1,2. Разработка целевых методов лечения, направленных на этих генетических поражений, таких как HER2, BCR-ABL, EGFR и ALK, значительно улучшили качество жизни пациентов 1,2. Тем не менее, несмотря на специфичность этого подхода, клинический ответ на большинстве одиночных лечения была неоптимальной, как сопротивление, в конечном счете возникает. Недавно значительный прогресс был достигнут в понимании молекулярных основ в устойчивости целевых терапии. Интересно, это становится очевидным, что видный механизм сопротивления включает в себя постоянную цель / активность пути. В случае в точке, андроген рецептор (АР) -directed enzalutamide лечение рака простаты приводит к обогащению активирующих мутаций в самой AR, поддерживая АР сигнализации OUTPут в присутствии ингибитора 3-5. Это знание привело к агрессивной кампании: 1) разработать антагонисты третьего поколения, которые могут продолжать подавлять как WT и функцию мутантного-AR в enzalutamide устойчивостью РПЖ 3 и 2) определить потенциальные вниз по течению узлы АР сигнализации, которые могут быть направлены для терапевтического вмешательства , Аналогично, устойчивость к другим классам ингибиторов, таких как меры, нацеленные на EGFR, BRAF и ABL часто приводят к мутациям, что оживлению оригинальный употреблению киназы 1.

С осознанием того, что сопротивление неизбежно возникает у большинства пациентов, разработке подходов к оперативно довести эти механизмы на свет позволит развитие эффективной последующей терапии. Один подход, который широко используется для анализа геномики клинических резистентных опухолей по отношению к лечебно-наивных или, чувствительными опухолями по выявлению обогащения / истощения в генетических поражений, которые могут быть поддаются DОткрытие ковер. Несмотря на обещания, есть две основные обязательства такого подхода, которые препятствуют быстро открытие. Во-первых, получение своевременного доступа к опухолевого материала для геномной допроса может служить значительным препятствием в переходе от терапии для лечения. Во-вторых, деконволюции множества генетических поражений в устойчивой обстановке может быть сложным, так как опухоли могут представить существенные внутригрупповые опухолевый неоднородность 6,7.

В свете этих проблем, там был увеличен на доклинической зависимость открытия механизмов сопротивления. Этот подход может позволить идентификацию известных механизмов резистентности до клинических испытаний 1, которые могут направлять альтернативные стратегии клинической управления в тех пациентов, которые имеют эти механизмы либо до терапии или следующие начала сопротивления.

Одним из таких инструментов доклинические открытие, что в настоящее время широко используется, чтобы применить объективные функциональные экраны RNAi. Для экзаменаPLE, Уиттакер и его коллеги применили геном масштаба экрана RNAi, чтобы идентифицировать, что потеря НФ1 посредником сопротивление ВВС и MEK ингибиторов на основе устойчивого МАРК активации пути 8. Эти данные были найдены, чтобы быть клинически значимыми, как с потерей функции мутации в NF1 наблюдались в BRAF -mutant опухолевых клеток, которые неразрывно устойчивы к RAF торможения и в опухолях меланомы, устойчивых к Vemurafenib активации 8. Тем не менее, несмотря на успех такого подхода, многие клинически значимых целей, часто не определены, предположительно из-за потери от-функции смещения этого подхода.

В противоположность этому, менее предвзято инструмент для доклинической открытия механизмов резистентности включает в себя генерацию клеточных линий, устойчивых при длительном воздействии интерес соединения в сочетании с NGS основе геномной или транскриптомных профилирования. Этот подход был успешно реализован в несколько групп, чтобы определить спонтанноерецидивирующие одиночные варианты нуклеотид или выражение изменения, которые позволяют сопротивление 5,9,10. Например, рецидивирующий F876L мутация в АР было недавно обнаружено в устойчивых клонов в пробирке 3-5 и ксенотрансплантатов опухолей в естественных условиях 5 до идентификации этой мутации в клинике 4. Совсем недавно, гашиш и его коллеги (2015) 11, используемый ClonTracer в двух клинически значимых моделей, чтобы показать, что большинство устойчивых клонов, которые возникают при длительном воздействии наркотиков были частью уже существующей субпопуляции предположить, что наиболее функционально отношение мутации, скорее всего, уже существовавших ранее которые становятся выбраны для при выборе 11.

В отличие от геномной профилирования опухолей, обсуждаемых ранее, этот подход выгоды от менее неоднородности как "гомогенные" резистентные клоны используются для анализа содействия более точное генетическое рассечение потенциальных водителей. Furthermруда, возбуждающе, в дополнение к возможности для выявления механизмов резистентности, этот метод может также применяться для идентификации клеточных механизмов действия и целевые биоактивных малых молекул, для которых эта информация неизвестна 10. Учитывая явные преимущества и многократное использование этого подхода, здесь мы приводим протокол с подробным успешной реализации такого доклинических экране, чтобы максимизировать потенциал для клинически значимых открытий.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Оценка GI 50 для соединения (ы), представляющие интерес

  1. Генерирование кривой (ы) для роста клеточных линий, представляющих интерес для оценки соответствующей плотности посева. Сюжет количества клеток в различные моменты времени следующей посева (дни 2, 4, 6 и 8) по отношению к 0 день Это обеспечит относительную скорость роста клеточной линии интересов и должны быть использованы для оценки начальной плотности посева такая, что Стечение не достиг в 96-луночных планшетах в течение 7 дней.
  2. После кривые роста были определены, семена соответствующее количество клеток в непрозрачных, прозрачным дном 96-луночных планшетах в 100 мкл клеточных сред для оценки GI 50. Семенной количество элементов на основе клеточной линии, используемой и определяемую в 1,1. Как правило, семена 3х10 3 клеток для клеточных линий быстрорастущих с удвоением-времени ~ 24 ч., Например, НСТ116.
    1. Подготовка планшета для анализа (день-1). Для аналитического планшета, семенные клетки в нужной плотности в 100 мкл культуральной среды Iн скважин, окрашенные в синий (рисунок 1). Уэллс выделены белым содержать только средства массовой информации.
    2. Подготовка контрольной чашке (день-1). Для контрольной чашке, семена ту же плотность клеток, как на стадии 1.2.1 в 100 мкл культуральной среды в отдельном 96-луночном планшете. Это "день 0" чтение поможет в интерпретации цитостатическое / цитотоксическое характер соединений анализируются (рисунок 2).
  3. На следующий день (день 0), прочитать управления пластину. Равновесие люминесцентные жизнеспособность клеток реагента (Celltiter-Glo субстрат, смешанный с буфером соответствии с инструкциями изготовителя) до комнатной температуры и аккуратно перемешать путем обращения содержимое, чтобы получить гомогенный раствор. Добавить 80 мкл реагента для 100 мкл клеток / медиа микс и встряхните содержимое в течение 30 мин, чтобы вызвать лизис клеток.
    1. Запись люминесценции с установленным на фотометре выдержкой 0,1-1,0 сек и обнаружения длины волны 560 нм.
  4. Добавить тестируемых соединений (соединенийинтерес) для анализа пластин (день 0). Выполнить 1: 4 серийное разведение соединений в ДМСО 200x конечной концентрации в общей сложности 10 концентрациях (9 разведений, содержащих соединение и один только ДМСО, соединение пластин). В качестве исходного отправной точки, стремиться к 200x низкой дозе 0,03 мкм и верхний дозе 2,000 мкм (конечный объем 200 мкл).
  5. Добавить серийно разбавленных соединений в среде для получения соединения среднего смеси при конечной концентрации 10-кратным (конечный объем 100 мкл, промежуточная пластина). Хранить соединение пластины при -20 ° С для использования на 3-й день анализа. Добавить 10 мкл соединения среднего смеси с клетками в трех экземплярах, таких, что высокая доза составляет 10 мкм (например., Ряды B, C и D, день 0) (Рисунок 1). Инкубируют планшеты для анализа в течение 3 дней при 37 ° С. Откажитесь промежуточную пластину (ы) после использования.
  6. На 3 день, подготовить 400 мкл 1x соединение среднего смесь с использованием соединения пластинок, полученных в 1.4. Обратить Планшеты удалить средства массовой информации и высушите на автоclaved бумажные полотенца 2-3x, чтобы удалить остатки средств массовой информации. Добавить соединение / средства массовой информации (100 мкл / лунку) в лунки затененных синим и добавить 100 мкл СМИ периметру скважины, чтобы предотвратить испарение (рисунок 1). Повторное инкубировать планшеты для анализа при 37 ° С в течение дополнительных 3 дней.
  7. На 6 день оценки относительного числа жизнеспособных клеток, выполняя считывание люминесценции, как описано в шаге 1.3.
  8. Используйте день 0 чтение для оценки статической / токсический характер соединений. Токсичные агенты индуцировать апоптоз, тогда как цитостатики вызвать остановку клеточного цикла. Если соединение является токсичным (день 6 чтение ниже день 0 чтения), рассмотрим выборе Г.И. 50 и GI 50 х 5 концентрации для сопротивления анализов. Тем не менее, если соединение вызывает застой (равный или более высокий, чем d0 чтения), рассмотрим GI 100 GI 100 и x5 для сопротивления анализов (рисунок 2).

2. Настройка лекарственной устойчивости Анализы

  1. Если рабочий остроумиега цитостатик, семена клетки при впадении 30-40% в 150 мм 2 ткани культуры блюд (объем = 30 мл) для сопротивления анализе. При работе с токсическим агентом, семена на 70-80% слияния.
  2. Для клеточных линий, которые несут интактный несоответствие ремонт (MMR) механизм, инкубировать клетки с шага 2,1 O / N при 37 ° С с канцерогена N-этил-N-нитрозомочевины (ЕНУ). Treat клеток 30 мкл исходного раствора 50 мг / мл ЕНУ (конечная концентрация 50 мкг / мл), чтобы повысить нестабильность генома. Для клеточных линий, которые имеют дефектные MMR (таблицы 2 и 3), лечение с ЕНУ или других канцерогенов не может быть необходимым.
    1. Для других клеточных линий, определить MMR-дефицитной по критериям NCI использованием микросателлитных нестабильности 12, или на основе опубликованной характеристики с использованием микросателлитных анализов нестабильность или геномной / эпигеномном профилирование MMR генов 13-15.
  3. Treat клетки с тестируемым соединением (ами)проценты по концентрации определяется на этапе 1.8. Для высокотоксичных соединений, которые вызывают гибель клеток в типичном трехдневного жизнеспособность анализа 10, начать с лечения низкими дозами (т.е., Г.И. 50) и постепенно увеличивайте концентрацию (кратные GI 50) соединения каждые 2-3 недели, пока надежные сопротивление наблюдается. Пополнять средства массовой информации и соединение каждый 3 D.
  4. После того, как выбор был инициирован, изменение средств массовой информации / соединение смешать каждые 3-4 дня, пока резистентные клоны не появляются. Сопротивление по определению возникает тогда, когда обработанные клетки показывают больший рост / жизнеспособность во время лечения наркотиками относительно лечения острого контрольных клеток ДМСО обращению.

3. Изоляция одну ячейку клоны

  1. Исследуйте культуры блюдо использованием фазово-контрастной микроскопии (увеличение 40х) для жизнеспособных кластеров клеток.
  2. Все удовлетворительные клоны в нижней части блюдо с маркером. Выберите клонов, которые имеют средний размер (большие колонии могутпроисходят из нескольких ячеек) и хорошо изолированы от других колоний. Выберите клонов, используя один из двух подходов, изложенных в пункте 3.3.
  3. Подход 1: Использование пипетки (рис 3)
    1. Удалить СМИ роста и промыть 1x PBS, чтобы удалить любые плавающие клетки.
    2. Используйте черные метки в качестве руководства к «собирание» клонов с пипетки наконечник (прилагается к пипетки, p200 предпочтительно).
    3. Передача клонов в 48-луночных планшетах с 200 мкл свежей среды (с половинной концентрации соединения, чтобы позволить оптимальное восстановление клеток).
    4. Разрешить клетки для восстановления в течение 2-3 дней, прежде чем добавлять в 200 мкл свежей среды / идеально концентрации соединение.
    5. Продолжить, чтобы изменить медиа / соединение каждые 3-4 дня и впредь расширять клонов.
  4. Подход 2: Использование клонирования дисков (Рисунок 3)
    1. Отметить клонов, как описано в шаге 3.2.
    2. Поместите 3 мм клонирования дисков в 10 см блюдо культуры ткани, содержащей 5 мл 0,25% Trypsin-ЭДТА в течение 2 мин.
    3. Аспирируйте средств массовой информации из блюдо, содержащее устойчивые клоны и накладывать клонов с трипсина пропитанной клонирования дисков с использованием стерильных одноразовых щипцы.
    4. Оставьте на 1-2 мин, в зависимости от того, как легко клоны поднимите пластины, в 37 ° C инкубатора.
    5. Возьмите клонирования дисков, используя стерильного пинцета и передачи в 48-луночных планшетах с 200 мкл свежей среды и половинной концентрации соединения.
    6. Внесите вверх и вниз, осторожно, чтобы выбить клеток клонирования дисков и инкубировать O / N при 37 ° C (оставить клонирования дисков в скважинах).
    7. На следующее утро, удалить клонирования дисков от 48-луночных планшетах и ​​пополнить скважин с 200 мкл свежей СМИ / соединения (половина идеальным концентрации соединение).
    8. Три дня спустя, пополнить СМИ с идеальной концентрации соединения.
    9. Продолжить, чтобы изменить СМИ / соединение каждые 3-4 дня и впредь расширять клонов.

4. Оценка Степень Resistance из выделенных клонов

  1. После 10-20 колонии расширен, генерировать GI 50 кривые, как описано в шаге 1, чтобы оценить степень устойчивости.
  2. Всегда включайте населения управления обработанные ДМСО в процессе отбора. Это очень вероятно, что спектр сопротивления будет большим (некоторые показывая частичное то время как другие, показывая полный сопротивление). Собрать несколько клонов из каждого из этих классов, как механизм резистентности может варьировать между двумя группами.

5. Следующее поколение Секвенирование

  1. Спин вниз 2 миллионов клеток (контроль и устойчивых клонов) (500 мкг в течение 5 мин) в 15 мл конические пробирки для обоих гДНК и сбора РНК (поэтому 2 х 2000000).
  2. Дважды промывали PBS и 1x заморозить гранул в -80 ° С до готовности для изоляции.
  3. Использование коммерческих набора для экстракции для выделения РНК или GDNA в соответствии с протоколом производителя.
  4. Отправить образцы для следующего поколения секвенированияс использованием протокола поставщика 10.

6. Биоинформатика анализ проб (вся-секвенирование экзома)

  1. Предварительная обработка последовательности данных в соответствии с лучшей практикой ДНК-след трубопровода 16.
    1. Карта всего читает референсный геном человека, используя GRCh37 BWA 17. Преобразование несжатых SAM отформатированные выравнивания в сжатом формате БАМ с Samtools 18. Сортировать по координации выравнивания с Samtools. Добавить чтения группы, используя Пикар. (Для конкретных ВСБ, Samtools и Пикард команды, смотрите дополнительную текст 1, линии 1-4)
    2. Отметить все дубликаты читает помощью команды MarkDuplicates от инструментом Пикард установить 19. Список этот файл с Samtools. (Дополнительный текст 1, строки 5-6)
    3. Чтобы свести к минимуму несоответствие базы по всем читает, читает перестроить локально в областях, несущих небольшие вставки или удаления, используя INDEL realigner 20. (Дополнительный текст 1, строки 7-8)
    4. Для дальнейшего улучшения accuracу варианта призвания, эмпирически Recalibrate оценки качества базы с использованием базы качественный инструмент оценка калибровки. Инструмент калибровки база качества должны не только правильно начальная оценка качества, но также принимать во внимание ковариации несколько функций, в том числе чтения группы, машинный цикл, базовой позиции и контекста динуклеотида (предыдущие + текущие баз). Создание перекалиброванной БАМ с Пикара PrintReads. (Для определенных команд для этого шага, см Дополнительный текст 1, линии 9-10)
    5. Повторите шаги 6.1.1 через 6.1.4 (Дополнительный текст 1, строки 1-10) для каждого образца. Секвенированной
  2. Определить единый вариант нуклеотидной (СНВ) в каждом клоне с использованием парных вариант вызова tool19, 21-23. Для каждого клона секвенировали, запустите в паре вариант вызова с помощью родительского клона как согласованный "нормально". (Дополнительный текст 1, строка 11)
  3. Фильтр текущие, варианты высокого качества и готовиться к аннотации с аннотаций вариант инструмента 24. Исключение из числа приоритетных ваriants не на всех устойчивых клонов. (См R сценарий в дополнительном текст 2)
  4. Авторство варианты с аннотаций инструмента 25, 26. Многие инструменты вариант аннотации имеют сопроводительную веб-приложение, позволяющее данные будут загружены и обработаны с помощью удаленного сервера.
  5. Используйте функциональный инструмент прогнозирования воздействия 27-29 приоритеты те варианты, предсказанные того высокую функциональную среду. Как вариант аннотации, несколько инструменты доступны для прогнозирования функционального воздействия через веб-интерфейс.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы максимизировать потенциал для обнаружения ключевых функциональных факторов резистентности, выберите клоны одиночных клеток для экспансии, фенотипического тестирования и секвенирования. Как показано на рисунке 4А, клетки HCT116, обработанные в течение длительного периода времени цитотоксическим соединением #1, привели к спонтанному появлению резистентных клонов, которые продолжали расти во время лечения (черные круги). Эти клоны были отобраны с использованием подхода #1, выделенного на рисунке 3, и впоследствии расширены для фенотипического анализа. Как показано на рисунке 4B, все устойчивые клоны 1-3 продемонстрировали значительную устойчивость к соединению #1 и его близкому аналогу соединению #2 (большая жизнеспособность/рост), в то время как все клоны показали чувствительность к неродственному цитотоксическому соединению велкаду. После подтверждения фенотипической резистентности гДНК выделяли и отправляли на анализ полноэкзомного секвенирования. Инструменты биоинформатики были применены для сужения круга тех структурных вариантов, которые 1) являются рецидивирующими и 2) имеют потенциал функционального воздействия (рисунок 5A). Структурные варианты, которые соответствовали этим двум критериям, были подтверждены независимым инструментом секвенирования. Как показано на рисунке 5B, гетерозиготная миссенс-мутация, идентифицированная с помощью полноэкзомного секвенирования, была подтверждена с помощью метода секвенирования по Сэнгеру (верхняя панель, последовательность WT; нижняя панель, мутантная последовательность). После подтверждения последовательности родительская клеточная линия, первоначально использованная для анализа резистентности, была генетически модифицирована для экспрессии мутантной кДНК для функционального подтверждения роли мутации. Как показано на рисунке 6, в то время как сверхэкспрессия кДНК WT не приводила к резистентности, принудительная экспрессия мутантной кДНК в значительной степени придавала фенотипическую устойчивость соединению #1, подтверждая функциональную роль этой структурной вариации как фактора резистентности. Все реагенты, использованные в этом эксперименте, приведены в таблице 1.

figure-results-1
Рисунок 1. Схема расположения пробирных и контрольных пластин. Синего оттенка, составные лечебные лунки. Белый оттенок, только средний. Соединения последовательно разводятся в соотношении 1:4 и вводятся в трех количествах (B-D или E-G). На одну пластину можно наносить 2 состава.

figure-results-2
Рисунок 2. Репрезентативные кривые жизнеспособности. Красной пунктирной линией обозначены показания дня 0. Ось x указывает на возрастающие дозы соединения справа, а ось Y представляет жизнеспособность относительно контрольных скважин ДМСО. ГИ100 = доза, используемая для достижения 100% ингибирования роста; ГИ50 = доза, используемая для снижения жизнеспособности до 50% от контроля ДМСО.

figure-results-3
Рисунок 3. Два подхода к выбору устойчивых клонов для экспансии. Подход 1 - использование пипетки для захвата и переноса четко определенных клонов на 48-луночные планшеты. Подход 2 - использование пропитанных трипсином дисков для клонирования для подъема клонов и переноса на 48-луночные планшеты.

figure-results-4
Рисунок 4. Подтверждение полученной устойчивости клонов HCT116 к соединению #1 in vitro.(A) Клоны HCT116, устойчивые к соединению #1, были получены после непрерывного трехнедельного отбора. (B) Жизнеспособность контрольных и устойчивых клонов была проверена после 72-часовой обработки различными соединениями. Соединение #2 является близким аналогом соединения #1. Велкейд использовали в качестве контрольного цитотоксического средства. Данные представлены в виде среднего значения + стандартное отклонение трех биологических репликатов.

figure-results-5
Рисунок 5. Идентификация уникальной, рецидивирующей мутации (однонуклеотидные варианты, SNV) в гене A в сложных клонах HCT116, устойчивых к #1.(A) Рабочий процесс по выявлению SNV, присутствующих во всех устойчивых клонах и, по прогнозам MutationAssessor, оказывающих высокое функциональное воздействие. (B) Подтверждение мутации в гене А методом секвенирования по Сэнгеру.

figure-results-6
Рисунок 6. Повторная экспрессия мутировавшего гена А придавала устойчивость к соединению #1 in vitro. Жизнеспособность сконструированных клеточных линий HCT116 была проверена после 72-часовой обработки соединением #1. HCT116-WT или мутантные клеточные линии стабильно экспрессируют WT или мутантные кДНК гена А соответственно. Данные представлены в виде среднего значения + стандартное отклонение трех биологических репликатов.

Имя образцааминокислотаПервичная тканьЗиготность
С-33-Астр.E768fs*44шейка маткиГетерозиготный
С-33-Астр.С860*шейка маткиГетерозиготный
ХМЛ-Т1.?haematopoietic_and_lymphoid_tissueГомозиготном
КП66-МЕЛстр.C822ФskinГетерозиготный
СТВ-1.0?haematopoietic_and_lymphoid_tissueГомозиготном
ЭФО-27стр.Q130fs*2яичникГетерозиготный
ЭФО-27.?яичникГетерозиготный
HCC2218.Э467КгрудьГетерозиготный
Дж-РТ3-Т3-5стр.R711*haematopoietic_and_lymphoid_tissueГомозиготном
LNCaP.?простатаГомозиготном
LoVo.?large_intestineГомозиготном
МОЛЬТ-13стр.R711*haematopoietic_and_lymphoid_tissueГомозиготном
НАЛМ-6.?haematopoietic_and_lymphoid_tissueГомозиготном
Код NCI-H630стр.R680*large_intestineГетерозиготный
СКУТ-1стр.L787fs*11эндометрийГомозиготном
СКУТ-1Бстр.L787fs*11эндометрийГомозиготном
СУП-Т1.?haematopoietic_and_lymphoid_tissueГомозиготном

Таблица 1. MSH2-мутировавшие клеточные линии. Указывается клеточная линия (название образца), аминокислотная замена, происхождение и зиготность.

Имя образцааминокислотаПервичная тканьЗиготность
CCRF-CEMстр.R100*haematopoietic_and_lymphoid_tissueГетерозиготный
CCRF-CEM.?haematopoietic_and_lymphoid_tissueГетерозиготный
CW-2.Y130fs*6large_intestineГомозиготном
ДУ-145.?простатаГомозиготном
ГР-СТ.?haematopoietic_and_lymphoid_tissueГомозиготном
ХСТ-116стр.С252*large_intestineГомозиготном
ИГРОВ-1.С505фс*3яичникГомозиготном
МН-60.?haematopoietic_and_lymphoid_tissueГомозиготном
НЦИ-СНУ-1стр.R226*животГомозиготном
П30-ОХК.?haematopoietic_and_lymphoid_tissueГомозиготном
ПР-МЕЛ.?skinГомозиготном
РЭ.?haematopoietic_and_lymphoid_tissueГомозиготном
СК-ОВ-3.0?яичникГомозиготном
СНУ-1544.С2Лlarge_intestineГетерозиготный
СНУ-1746.Э523Кlarge_intestineГомозиготном
СНУ-324.К233Рподжелудочная железаГетерозиготный
СНУ-324.V384Dподжелудочная железаГетерозиготный
СНУ-478.V384Dподжелудочная железаГетерозиготный

Таблица 2. MLH1-мутировавшие клеточные линии. Указывается клеточная линия (название образца), аминокислотная замена, происхождение и зиготность.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Отбор клеточных линий: Характеристика генетического состояния и геномной нестабильности

Несомненно, единственным наиболее важным фактором в успешном раскрытии клинически значимых механизмов резистентности является первоначальный выбор клеточной линии. Следует учитывать два фактора. Во-первых, попытайтесь выбрать клеточные линии одной и той же линии/подтипа, несущие определяющие генетические признаки заболевания (например, BRAFV600E при меланоме). Изучение общедоступных транскриптомных и мутационных данных как для клеточных линий30-32 , так и для первичных/метастазирующих опухолей по различным показаниям33,34 облегчит процесс отбора. Несмотря на то, что идентификация клеточных линий с клинически значимыми генетическими изменениями является идеальной, в некоторых случаях это может быть невозможно из-за отсутствия доступных клеточных линий или возможно из-за таких факторов, как сложность и продолжительность процесса скрининга.

Что касается вышеупомянутого пункта, вторым фактором, который следует учитывать при выборе клеточной линии, является легкость или возможность скрининга резистентности с использованием желаемой линии. Например, такие факторы, как пролиферация и внутренняя частота мутаций, могут сильно повлиять на скорость открытия. С этой целью можно использовать клеточные линии с более быстрой кинетикой роста и дефицитом механизмов MMR ДНК в надежде на то, что возникновение спонтанной резистентности может быть ускорено. Согласно базе данных COSMIC существует несколько клеточных линий-кандидатов с дефицитом одного из двух часто мутирующих генов MMR, MSH2 или MLH1 (табл. 2 и 3). В качестве альтернативы, если не существует представляющих интерес клеточных линий, несущих дефекты в MMR, для повышения геномной нестабильности может быть использована острая обработка физическими или ДНК-реактивными химическими мутагенами, такими как алкилирующий агент N-этил-N-нитрозомочевина (ENU). Несмотря на то, что оба подхода могут значительно сократить время получения резистентных клонов и последующего секвенирования, следует проводить строгие функциональные испытания генов-кандидатов, поскольку вероятно появление большего числа нефункциональных, пассажирских мутаций. SNV могут быть ранжированы, чтобы максимизировать шансы на идентификацию функционально релевантных мутаций. Во-первых, выбор тех мутаций, которые являются повторяющимися в независимых клонах, увеличит вероятность того, что эти мутации являются движущими силами резистентности. В случае, если рецидивирующие мутации не идентифицированы, может быть целесообразным сосредоточиться на SNV, которые соответствуют механизму действия препарата (например, мишень для препарата или известный эффектор нижележащего по течению эффектора мишени для препарата). В конечном счете, золотым стандартом всегда является экспериментальная оценка резистентной активности кандидатов в SNV путем экспрессии эктопической кДНК в чувствительных к лекарствам родительских клетках.

Секвенирование ДНК и РНК

После того, как устойчивые клоны созданы, ДНК и/или РНК могут быть секвенированы в зависимости от необходимости. Секвенирование ДНК, будь то экзомное или полногеномное, позволит идентифицировать зародышевую линию и соматические варианты, такие как SNP, инделы и варианты числа копий. В то время как более экономичное секвенирование экзома сосредоточено на генерировании прочтений из известных кодирующих областей, полногеномное секвенирование позволит получить данные секвенирования для всего генома, что может облегчить идентификацию мутаций в некодирующих элементах, таких как энхансеры или микроРНК36. Однако, поскольку данные экспрессии генов не оцениваются во время секвенирования ДНК, трудно предсказать, какая мутация (мутации) может быть функциональным драйвером. В этом отношении секвенирование РНК, хотя и является более дорогостоящим, дает это преимущество. Тот факт, что вызов мутации выполняется только на экспрессированных видах РНК, повышает вероятность того, что интересующая мутация может быть функциональным драйвером. В дополнение к возможности более целенаправленного изучения мутаций для последующего функционального тестирования, секвенирование РНК также дает дополнительное преимущество, заключающееся в возможности идентификации изменений экспрессии генов, альтернативного сплайсинга и новых видов химерных РНК, включая слияния генов, которые также могут служить мощными факторами резистентности.

Пайплайн биоинформатики

Примеры команд приведены в иллюстративных целях, но более подробная документация и учебные пособия доступны в Институте Броуда16 и должны быть тщательно прочитаны перед началом анализа NGS. Следующие команды предназначены для среды оболочки UNIX в системе, в которой все инструменты и справочные данные были предварительно установлены. Эти команды также предполагают, что файлы FASTQ, содержащие считывание парных последовательностей из двух образцов, названных "parental" и "resistant", были получены от поставщика и помещены в каталог "data". В большинстве случаев эти команды должны быть адаптированы или оптимизированы для конкретного приложения с использованием дополнительных аргументов командной строки (например, добавление "-t 8" к команде bwa позволяет многопоточную работу на 8 ядрах процессора). Группы чтения (которые присваивают выравнивание биологическим образцам) часто должны добавляться в файлы BAM, даже если в файле bam только один образец, чтобы соответствовать требованиям к формату файла для определенных инструментов. Параметры группы чтения RGID, RGSM, RGPL, RGPU и RGLB могут быть произвольными строками, описывающими имя примера, платформу секвенирования и стратегию библиотеки.

Анализы in vitro и in vivo

Несмотря на то, что некоторые механизмы резистентности, выявленные в ходе отбора in vitro , были подтверждены как клинически значимые, существует вероятность того, что эти механизмы могут не служить релевантными или преобладающими механизмами клинической резистентности. Одной из причин этого может быть существенная роль микроокружения в стимулировании резистентности к терапии, компонента, который отсутствует в экспериментальном протоколе/установке, рассмотренном до сих пор. Действительно, несколько исследований показали, что противораковые агенты, способные убивать опухолевые клетки, становятся неэффективными, когда опухолевые клетки культивируются в присутствии стромальных клеток, подразумевающих врожденные механизмы резистентности, обеспечиваемые стромой37,38. Чтобы идентифицировать такие механизмы приобретенной резистентности, индуцированные стромой, можно рассмотреть возможность проведения in vitro ко-культивирования или анализа резистентности опухоли in vivo . Поскольку первый анализ является довольно сложным, многие прибегают к созданию устойчивых к лекарствам ксенотрансплантатов опухолей, чтобы изучить потенциальную роль стромы в формировании резистентности. Такие исследования выявили как идентичные5 , так и уникальные39 механизмов резистентности по отношению к отбору in vitro , подразумевая, что строма действительно может играть роль в последнем. Тем не менее, следует помнить о продолжительности времени, которое может потребоваться для создания таких резистентных опухолей, и о сложности последующего геномного анализа из-за внутриопухолевой молекулярной и клеточной гетерогенности.

Идентификация цели

В дополнение к раскрытию механизмов лекарственной устойчивости, этот подход к геномному профилированию на основе NGS также может быть применен для идентификации клеточных мишеней химических зондов. Исторически сложилось так, что для идентификации клеточных механизмов действия и мишеней низкомолекулярных химических веществ с биологической активностью использовались множественные непредвзятые методы, включая аффинную очистку в сочетании с количественной протеомикой, геномными методами дрожжей, скринингом РНК-интерференции и подходами к вычислительному выводу40. В качестве расширения для выяснения механизмов лекарственной устойчивости с использованием геномного или транскриптомного профилирования фенотипически резистентных клеточных популяций на основе NGS, идентификация уникальных повторяющихся однонуклеотидных вариаций (SNV) или изменений экспрессии, которые обеспечивают резистентность, может дать представление о функциональных клеточных мишенях соединений. Это основано на идее о том, что подмножество наблюдаемых механизмов резистентности может включать в себя повторяющиеся мутации в генах, которые кодируют прямые белковые мишени малой молекулы. В последнее время в нескольких отчетах подтверждается полезность этого подхода, в частности, в сочетании с другими подходами, включая профилирование чувствительности к крупномасштабным раковым клеткам, для выявления клеточных мишеней низкомолекулярных зондов9,10.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Организационный взнос за публикацию данной статьи оплачивает компания H3 Biomedicine.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают признательность нашим коллегам из H3 Biomedicine за их отзывы во время подготовки рукописи.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
48-луночные планшетыFisher Scientific07-200-86 Расширение клонов
96-луночные планшетыFisher Scientific07-200-588Генерация кривых GI50
CellTiter-GloPromega G7572Тестирование жизнеспособности
Клонирование дисков (3 мм)SigmaZ374431Picking клонов
Стерильные щипцыUnomedicalDF8088SPicking
clones набор для экстракции РНК RNeasy PlusQiagen74134Набор для выделения РНК
крови и тканей DNeasy Extraction kitQiagen69581Изолирующая
гДНК GATKThe Broad InstituteIndel realigner
MuTectThe Broad InstituteИнструмент для вызова парных вариантов
OncotatorThe Broad InstituteИнструмент для аннотации вариантов
MutationAccessorThe Broad ИнститутИнструмент прогнозирования функционального воздействия

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sellers, W. R. A blueprint for advancing genetics-based cancer therapy. Cell. 147 (1), 26-31 (2011).
  2. Housman, G., et al. Drug resistance in cancer: an overview. Cancers (Basel). 6 (3), 1769-1792 (2014).
  3. Balbas, M. D., et al. Overcoming mutation-based resistance to antiandrogens with rational drug design. Elife. 2, e00499(2013).
  4. Joseph, J. D., et al. A clinically relevant androgen receptor mutation confers resistance to second-generation antiandrogens enzalutamide and ARN-509. Cancer Discov. 3 (9), 1020-1029 (2013).
  5. Korpal, M., et al. An F876L mutation in androgen receptor confers genetic and phenotypic resistance to MDV3100 (enzalutamide). Cancer Discov. 3 (9), 1030-1043 (2013).
  6. Lawrence, M. S., et al. Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes. Nature. 499 (7457), 214-218 (2013).
  7. Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).
  8. Whittaker, S. R., et al. A genome-scale RNA interference screen implicates NF1 loss in resistance to RAF inhibition. Cancer Discov. 3 (3), 350-362 (2013).
  9. Wacker, S. A., Houghtaling, B. R., Elemento, O., Kapoor, T. M. Using transcriptome sequencing to identify mechanisms of drug action and resistance. Nat Chem Biol. 8 (3), 235-237 (2012).
  10. Adams, D. J., et al. NAMPT Is the Cellular Target of STF-31-Like Small-Molecule Probes. ACS Chem Biol. 9 (10), 2247-2254 (2014).
  11. Bhang, H. E., et al. Studying clonal dynamics in response to cancer therapy using high-complexity barcoding. Nat Med. 21 (5), 440-448 (2015).
  12. Boland, C. R., et al. A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res. 58 (22), 5248-5257 (1998).
  13. Heinen, C. D., Richardson, D., White, R., Groden, J. Microsatellite instability in colorectal adenocarcinoma cell lines that have full-length adenomatous polyposis coli protein. Cancer Res. 55 (21), 4797-4799 (1995).
  14. Yamada, N. A., Castro, A., Farber, R. A. Variation in the extent of microsatellite instability in human cell lines with defects in different mismatch repair genes. Mutagenesis. 18 (3), 277-282 (2003).
  15. Ahmed, D., et al. Epigenetic and genetic features of 24 colon cancer cell lines. Oncogenesis. 2, e71(2013).
  16. GATK. , The Broad Institute. Cambridge, Massachusetts, USA. Available from: https://www.broadinstitute.org/gatk/guide (2015).
  17. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  18. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  19. Picard. , The Broad Institute. Cambridge, Massachusetts, USA. Available from: http://broadinstitute.github.io/picard (2015).
  20. McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20 (9), 1297-1303 (2010).
  21. Cibulskis, K., et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).
  22. Larson, D. E., et al. SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data. Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).
  23. Koboldt, D. C., et al. VarScan 2: somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing. Genome Res. 22 (3), 568-576 (2012).
  24. Oncotator. , The Broad Institute. Cambridge, Massachusetts, USA. Available from: https://www.broadinstitute.org/oncotator (2015).
  25. Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Res. 38 (16), e164(2010).
  26. Cingolani, P., et al. A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3. Fly. 6 (2), 80-92 (2012).
  27. Reva, B., Antipin, Y., Sander, C. Predicting the functional impact of protein mutations: application to cancer genomics. Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).
  28. Ng, P. C., Henikoff, S. SIFT: Predicting amino acid changes that affect protein function. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3812-3814 (2003).
  29. Adzhubei, I., Jordan, D. M., Sunyaev, S. R. Predicting functional effect of human missense mutations using PolyPhen-2. Curr Protoc Hum Genet. Chapter 7, Unit 7.20(2013).
  30. Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).
  31. Abaan, O. D., et al. The exomes of the NCI-60 panel: a genomic resource for cancer biology and systems pharmacology. Cancer Res. 73 (14), 4372-4382 (2013).
  32. Forbes, S., et al. Cosmic 2005. Br J Cancer. 94 (2), 318-322 (2006).
  33. Shah, S. P., et al. The clonal and mutational evolution spectrum of primary triple-negative breast cancers. Nature. 486 (7403), 395-399 (2012).
  34. Behjati, S., et al. Recurrent PTPRB and PLCG1 mutations in angiosarcoma. Nat Genet. 46 (4), 376-379 (2014).
  35. de las Alas, M. M., Aebi, S., Fink, D., Howell, S. B., Los, G. Loss of DNA mismatch repair: effects on the rate of mutation to drug resistance. J Natl Cancer Inst. 89 (20), 1537-1541 (1997).
  36. Kotani, A., et al. A novel mutation in the miR-128b gene reduces miRNA processing and leads to glucocorticoid resistance of MLL-AF4 acute lymphocytic leukemia cells. Cell Cycle. 9 (6), 1037-1042 (2010).
  37. Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487 (7408), 500-504 (2012).
  38. Yang, X., Sexauer, A., Levis, M. Bone marrow stroma-mediated resistance to FLT3 inhibitors in FLT3-ITD AML is mediated by persistent activation of extracellular regulated kinase. Br J Haematol. 164 (1), 61-72 (2014).
  39. Arora, V. K., et al. Glucocorticoid receptor confers resistance to antiandrogens by bypassing androgen receptor blockade. Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).
  40. Schenone, M., Dancik, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vitroGI 50

Похожие статьи