Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Прямая мыши Травма / Запись Модель гетеротопической окостенения

10K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52880

⸱

6 августа 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Michigan Medical School, 2Department of Biologic and Materials Sciences, University of Michigan School of Dentistry

В этой статье

Краткое содержание

Модель гетеротопической оссификации тенотомии ахиллова сухожилия и ожоговой травмы позволяет надежно изучить образование эктопической кости, вызванное травмой, без применения экзогенных факторов.

Аннотация

Гетеротопическая оссификация (ГО) — это образование кости за пределами скелета, которое образуется после серьезных травм, ожоговых травм и ортопедических хирургических процедур. Большинство животных моделей, используемых для изучения НО, основаны на применении экзогенных веществ, таких как костный морфогенетический белок (BMP), экзогенные клеточные конструкции или генетические мутации в передаче сигналов BMP. Хотя эти модели полезны, они не точно воспроизводят воспалительные состояния, которые вызывают большинство случаев ГО. Здесь мы опишем модель ожога/тенотомии у мышей, которая надежно производит сфокусированную ГО. Этот протокол включает в себя создание 30% общей площади поверхности тела, частичную толщину контактного ожога на тыльной стороне кожи, а также разделение ахиллова сухожилия в его средней точке. Полагаясь исключительно на травматическое повреждение для индуцирования ОГ в предсказуемом месте, можно с точностью до времени изучать эндохондральное гетеротопическое формирование костной ткани только из внутренних физиологических процессов и окружающей среды. Этот метод может оказаться полезным в понимании воспалительных и остеогенных путей, участвующих в травматической ГО. Кроме того, поскольку в этой модели НО развивается в предсказуемом месте и во времени, это позволяет проводить исследования для улучшения стратегий ранней визуализации и методов лечения для предотвращения образования НО.

Введение

Гетеротопическая оссификация (ГО) — это образование эктопической кости, при котором остеопотентные клетки аберрантно индуцируются для формирования эндохондральной кости вне скелета. В то время как детали пути формирования ГК до сих пор в значительной степени неизвестны, принятая парадигма включает три ключевых фактора: провоцирующий воспалительный инцидент, разрешающая ниша и мезенхимальные стволовые клетки, способные формировать кость. 1-3 HO является распространенным сопутствующим заболеванием, осложняющим более 60% серьезных ожоговых травм, 65% травм, связанных с боевыми действиями, и 10% случаев инвазивной ортопедической хирургии. 4,5 Тем не менее, часто бывает трудно предсказать, где будет формироваться ГО, потому что она может возникнуть в местах локальной травмы или в отдаленных местах, которые в противном случае могут остаться неповрежденными. Такая изменчивость локализации затрудняет профилактическое вмешательство для предотвращения реактивного формирования костной ткани локально направленным образом. Существуют также врожденные формы ГО, такие как фибродисплазия оссифицирующих прогрессирующих заболеваний (ПОФ), при которых пациенты склонны к развитию устойчивой НО в ответ на незначительную травму или воспалительное повреждение. Мощные животные модели с использованием трансгенных мышей воспроизвели этот фенотип и дали представление о молекулярных путях, которые также могут быть важны при травматической ГО.6-9 В трансляционных исследованиях патогенеза неврожденной НО использовался широкий спектр конструкций, начиная от одной только травмы и заканчивая имплантацией экзогенных остеоиндуктивных материалов и/или клеток. 10-13

В нашей предыдущей работе мы проверили простую и надежную модель формирования HO у мышей, которая не требует введения какого-либо экзогенного материала. 14-17 Эта модель создала два ключевых условия для инициации ГО: локальную травму и глобальное воспаление. Это было достигнуто за счет использования тенотомии ахиллова сухожилия (локальная травма) в сочетании с отдаленной ожоговой травмой (глобальное воспаление). Мыши получали оба метода лечения одновременно, и было обнаружено, что у них вырабатывается достаточное количество ГО, которое может быть проанализировано гистологическими, радиологическими и молекулярными средствами. Интересно, что сопутствующая ожоговая травма значительно увеличивала количество НО, которая формировалась, и ускоряла ее развитие. 14-16 ОГ развивались в предсказуемых участках вокруг пяточной кости, голеностопного сустава и большеберцовой/малоберцовой кости конечности, на которой была проведена тенотомия. Достоверность развития ГОО в известном месте позволила целенаправленно изучить молекулярные и гистологические особенности на ранних стадиях эктопической оссификации. 14,17 На сегодняшний день у 100% мышей (более 50 животных) с тенотомией и сопутствующей ожоговой травмой развилась ГО. Кроме того, были проведены продольные 2D и 3D визуализации и спектроскопический анализ для изучения характера роста и биохимического состава HO.15,16

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Заявление по этике: Все процедуры на животных были проведены в строгом соответствии с надлежащей практикой животных, как определено в руководящих принципах, предусмотренных в Руководстве по использованию и уходу за лабораторными животными: восьмой редакции от Института лабораторных животных исследований (ILAR, 2011 г.) и были утвержден уходу и использованию комитета Институциональная животных университета штата Мичиган (PRO0001553) по.

1. Хирургические процедуры мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 8-10 неделя C57BL / 6 мышей. Другие возраст, фоны, и штаммы мышей также может быть использован для тестирования различных условий или генетический состав. Для тенотомии части процедуры, поддерживать стерильные условия, используя маску, волосы капота и стерильные халат, перчатки и инструменты. Хирургические сайты должны быть стерильно подготовлен с повидон-йодом и стерильной драпировки. Избегайте переохлаждения с помощью ветеринарного грелку и нагревания реанимации решения до 37 ° С до администрания.

  1. Обезболить мыши, используя 2,5% вдыхаемого изофлурана. Используйте носовой конус, чтобы оставить тыльную и задние конечности-легко доступны. Отрегулируйте скорость введения ИФ поддерживать соответствующую скорость дыхания и окраску слизистых оболочек и обеспечить анестезию путем проверки мышечный тонус, ног щепотку, и роговицы рефлекс. Применить мягкий глазной мази для глаз мыши, чтобы предотвратить сухость глаз травмы во время процедуры. Поддержание адекватной температуры тела с помощью ветеринарного грелку или теплую воду циркуляционного под операционного поля.
  2. Администрирование бупренорфин, 0,1 мг / кг, подкожно непосредственно перед операцией для обезболивания.
  3. Внимательно брить хирургического сайта на левой задней лапы, используя ножницы от пятки до колена.
  4. Внимательно брить спинку мыши, начиная над позвоночника и расширение бритая область слева от средней линии спины, очищая площадь по крайней мере, 2 см х 3 см, чтобы приспособить ожогов.
  5. Подготовка операционного поля, в том числе задней лапы до колена с использованием 3 чередующихся повидон-йод скрабы.
  6. Выполните продольный разрез вдоль медиальной части левой ахиллова сухожилия. Расширьте разрез, так ахиллово сухожилие может быть легко визуализировать; примерно 0,5 см.
  7. Выполните тенотомию ахиллова острым рассечение сухожилия в середине с острыми ножницами ткани. Вставьте одно лезвие ножниц ткани в ткани плоскости под сухожилия и анализировать вдоль плоскости, пока лезвие не находится в середине сухожилия. Закрыть лезвия ножниц, чтобы разъединить сухожилия резко.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, включение всех задних сухожилий в том числе икроножных, камбаловидной и подошвенный сухожилий.
  8. Достижения гемостаза путем применения давления стерильной марли (не должно быть минимальное кровотечение) и закрыть разрез кожи с 5-0 викрил стежка.
  9. Выполните спинной частичное ожог толщина с алюминиевым блоком весом 35 г с приближенными проводились измеренияTS 2 см х 2 см х 3 см нагревают до 60 ° С на водяной бане, приложенного к бритой спины мыши в течение 17 сек.
    Примечание: достижения соответствующего глубину ожога должен поместить блок в верхней части наркозом мыши, гарантируя, что вся площадь поверхности блока находится в контакте с мышью, однако избегать применения какого-либо дополнительного давления к блоку, то есть, позволяют тяжести будет только сила, удерживающая блок на месте. Тонкая пластиковая ручка прикреплена к одной стороне блока удобен для манипулирования, стабилизации и извлечения из горячей водяной бане. Это создаст поверхность всего тела примерно 30% гореть в 8-10-недельных C57BL / 6 мыши. Этот контакт ожог был выбран по сравнению с другими методами (пламя или ошпаривают Burn) из-за однородности глубины выгорания на рану и воспроизводимости между животными.
  10. Высушите ожога сайт марлей и применять Tegaderm повязку.
  11. Администрирование согретые реанимации жидкости: раствор 1 мл лактата Рингеравнутрибрюшинной инъекции 0,5 мл подкожно. Это один раз администрация реанимации является достаточным для восстановления от ожогов и тенотомии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не вернуться наркотизированных мышей жилищных клетках с другими мышами, дом индивидуально в клетках чистых под контролем до тех пор, мышей не полностью выздоровел. Типичный восстановление происходит в течение 1-6 часов. Прожига сайты, как правило заживают в течение 2-4 недель, и редко осложняется раневой инфекции, если хранится в чистых жилищных условий.
  12. Администрирование бупренорфина 0,1 мг / кг подкожной инъекции каждые 12 ч в течение 3 дней после процедуры. Монитор рост HO с серийными μCT сканирования в определенные промежутки времени. Внематочная рост костей является первым очевидным около 3 недель после операции по μCT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство развития HO завершения на 9 недель послеоперационных. Мы не наблюдали различие в объеме HO или местоположения с повторным μCT сканирует два раза в неделю в течение 15 недель по сравнению с одной конечной точки μCT сканирования в 15 недель.В конце экспериментов, усыпить все мышей СО 2 ингаляции в соответствии с ведомственным руководящим принципам и проверить смерть с шейных позвонков после 10 мин.

2. μCT сбора и анализа

  1. Закрепите наркозом мыши на планшете сканера в положении лежа. Лента задние конечности надежно к кровати, чтобы предотвратить дыхание артефакт движения. Включите воздух, воду и гидроксиапатит, содержащий фантом под мышкой для калибровки изображения.
  2. Откройте программное обеспечение анализа костей и определить области интереса (ROI), который охватывает обе задние конечности от тазобедренного сустава проксимальнее кончика задней лапы дистально. Получить изображение, используя следующие параметры:. 80 кВ, 500 мкА и 1300 мс экспозиции, размер воксела 48 мкм 14,15
  3. Калибровка изображения на Хаунсфилда единиц (HU), опираясь на ROI в каждой из трех камер, и фантомных ввода среднюю плотность в соответствующие поля впрограммного обеспечения.
  4. Использование "граббер" инструмент в программном обеспечении, переориентировать изображение так, голени левой задней конечности параллельно вдоль оси Z, чтобы позволить ясное представление анатомические для разграничения ортотопических корковых костных структур и HO.
  5. Начиная с колена, выделите дистально через ломтиками изображения до HO не встречается. Использование ручного инструмента сплайна, сделать ROI вокруг внематочной кости на каждом 5-м срезе продолжающейся в дистальном направлении лапы или до HO был превзойден. Используйте инструмент экстраполировать расширить и сшейте трансформирования в одну ROI, который содержит все HO.
  6. Сделайте 3D ROI и выберите в меню анализа. Рассчитать объем костной ткани, установив нижний и верхний порог значения, которые лучше всего открыть окно кости. Используйте те же фиксированные пороговые значения для всех сканов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом настоящем исследовании, протокол описан ранее опубликованной модели мыши травмы / ожог индуцированной HO. 14-17 Это предполагает создание одновременно локализованной травмы опорно-двигательного аппарата с тенотомии ахиллова и глобальной воспалительного оскорбление с частичным толщиной ожог. Это приводит к образованию надежного реактивной кости в месте тенотомии, которые могут быть далее с последовательным изображений. На сегодняшний день, все мыши (более 50), которые понесли как Ахиллес тенотомию и ожо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Гетеротопическая оссификация представляет собой серьезное функциональное нарушение, с которым сталкиваются пациенты, перенесшие травмы, ожоги и инвазивные операции на опорно-двигательном аппарате. В современных конфликтах наибольшему риску подвергаются солдаты с серьезными взрывными ранениями от таких механизмов, как самодельные взрывные устройства (СВУ). 18 Улучшенные бронежилеты и расположенные вперед медицинские подразделения позволяют улучшить выживаемость при серьезных травмах конечностей. После первон...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать

Благодарности

Мы благодарим Аманду Фэйр, CMI, а также Кэти Свит и ORL в UM за помощь в визуализации и анализе μКТ. Финансирование: BL финансируется 1K08GM109105-01 и Национальной премией Фонда пластической хирургии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
C57BL/6 мышейJackson Laboratory6648-10 недель
Изофлуран – FlurisoVET one, Boise, IDV1 501017
Бупренорфин – BuprenexReckitt Benckiser HealthcareNDC 12496-0757-10,3 мг/мл раствор
BetadineOwens and Minor, Mechanicsville, VA2047PVP202
5-0 Vicryl шовные материалыEthicon, Summerville, NJJ493
Tegaderm Film, 6 см x 7 см3M1624WРазрезать пополам, чтобы правильно покрыть место ожога
&микро; КТ - GE eXplore Locus SPGE Healthcare Pre-Clinical Imaging, Лондон, Онтарио, Канада
Microview 2.2 Advanced Bone Analysis ApplicationHealthcare Pre-Clinical Imaging, Лондон, Онтарио, Канада
GE

Ссылки

  1. Leblanc, E., et al. BMP-9-induced muscle heterotopic ossification requires changes to the skeletal muscle microenvironment. J Bone Miner Res. 26 (6), 1166-1177 (2011).
  2. Shore, E. M. Osteoinductive signals and heterotopic ossification. J Bone Miner Res. 26 (6), 1163-1165 (2011).
  3. Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. J Bone Miner Res. 27 (5), 1004-1017 (2012).
  4. Potter, B. K., et al. Heterotopic ossification following combat-related trauma. J Bone Joint Surg Am. 92, Suppl 2. 74-89 (2010).
  5. Van den Bossche, L., Vanderstraeten, G. Heterotopic ossification: a review. J Rehabil Med. 37 (3), 129-136 (2005).
  6. Chakkalakal, S. A., et al. An Acvr1 R206H knock-in mouse has fibrodysplasia ossificans progressiva. J Bone Miner Res. 27 (8), 1746-1756 (2012).
  7. Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic [corrected] ossification. Nat Med. 14 (12), 1363-1369 (2008).
  8. Culbert, A. L., et al. Alk2 regulates early chondrogenic fate in fibrodysplasia ossificans progressiva heterotopic endochondral ossification. Stem Cells. 32 (5), 1289-1300 (2014).
  9. Dinther, M., et al. ALK2 R206H mutation linked to fibrodysplasia ossificans progressiva confers constitutive activity to the BMP type I receptor and sensitizes mesenchymal cells to BMP-induced osteoblast differentiation and bone formation. J Bone Miner Res. 25 (6), 1208-1215 (1359).
  10. Peterson, J. R., et al. Burn injury enhances bone formation in heterotopic ossification model. Ann Surg. 259 (5), 993-998 (2014).
  11. Scott, M. A., et al. Brief review of models of ectopic bone formation. Stem Cells Dev. 21 (5), 655-667 (2012).
  12. Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model. J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).
  13. Tannous, O., et al. Heterotopic bone formation about the hip undergoes endochondral ossification: a rabbit model. Clin Orthop Relat Res. 471 (5), 1584-1592 (2013).
  14. Peterson, J. R., et al. Treatment of heterotopic ossification through remote ATP hydrolysis. Sci Transl Med. 6 (255), 255ra132(2014).
  15. Peterson, J. R., et al. Early detection of burn induced heterotopic ossification using transcutaneous Raman spectroscopy. Bone. 54 (1), 28-34 (2013).
  16. Perosky, J. E., et al. Early detection of heterotopic ossification using near-infrared optical imaging reveals dynamic turnover and progression of mineralization following Achilles tenotomy and burn injury. J Orthop Res. 32 (11), 1416-1423 (2014).
  17. Peterson, J. R., et al. Effects of Aging on Osteogenic Response and Heterotopic Ossification Following Burn Injury in Mice. Stem Cells Dev. , (2014).
  18. Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. Blast injuries and heterotopic ossification. Bone and Joint Research. 1 (8), 174-179 (2012).
  19. Hunt, J. L., Arnoldo, B. D., Kowalske, K., Helm, P., Purdue, G. F. Heterotopic ossification revisited: a 21-year surgical experience. J Burn Care Res. 27 (4), 535-540 (2006).
  20. Ring, D., Jupiter, J. B. Operative release of ankylosis of the elbow due to heterotopic ossification. Surgical technique. J Bone Joint Surg Am. 86-A, Suppl 1. 2-10 (2004).
  21. Crane, N. J., Polfer, E., Elster, E. A., Potter, B. K., Forsberg, J. A. Raman spectroscopic analysis of combat-related heterotopic ossification. Bone. 57 (2), 335-342 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Прямая мыши Травма / Запись Модель гетеротопической окостенения
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.