Методическая статья

Создание клинически значимых

6.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52886

⸱

5 июня 2015 г.

 ,  ,  , 
1Pathology, Anatomy and Cell Biology, Thomas Jefferson University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь описано создание клинически значимой модели имитации хирургии катаракты ex vivo, которая может быть использована для исследования механизмов реакции эпителиальных тканей на повреждение в их естественном микроокружении.

Аннотация

Основным препятствием для понимания того, как эпителиальная ткань выполняет восстановление раны, является ограниченная доступность моделей, в которых можно отслеживать и манипулировать реакцией раны ex vivo в среде, которая близко имитирует повреждение эпителиальной ткани in vivo. Проблема была решена путем создания клинически значимой модели восстановления эпителия ex vivo на основе хирургии катаракты. В этой культуральной модели реакцию эпителия хрусталика на рану можно проследить в реальном времени в нативном микроокружении клеток, а молекулярные медиаторы восстановления раны легко манипулируются в процессе восстановления. Для приготовления культур из глаза удаляют хрусталики и делают небольшой разрез в передней части хрусталика, из которого удаляют внутреннюю массу клеток волокон хрусталика. В результате этой процедуры создается круглая рана на задней капсуле хрусталика, толстой базальной мембране, которая окружает хрусталик. Эта область раны, где были прикреплены волоконные клетки, расположена в непосредственной близости от непрерывного монослоя эпителиальных клеток хрусталика, который остается связанным с капсулой хрусталика во время хирургической процедуры. Поврежденный эпителий, тип клеток, из которых в процессе развития происходят волокнистые клетки, реагирует на повреждение при удалении волоконных клеток, коллективно перемещаясь по области раны, во главе с популяцией богатых виментином репарирующих клеток, мезенхимальные предшественники которых являются эндогенными по отношению к хрусталику1. Эти свойства типичны для нормальной реакции заживления эпителиальной раны. В этой модели, как и in vivo, восстановление раны зависит от сигналов, поступающих из эндогенной среды, которая уникально поддерживается в этой культуральной системе ex vivo, что дает идеальную возможность для открытия механизмов, регулирующих восстановление эпителия после ранения.

Введение

Клинически значимых, макет хирургии катаракты, экс естественных эпителиальных ранозаживляющее модель, описанная здесь была разработана, чтобы предоставить инструмент для исследования механизмов, которые регулируют ремонт эпителиальных тканей в ответ на повреждение. Основные функции, которые были направлены на создание в этой модели включены 1) обеспечение условий, которые тесно повторены ответ в естественных условиях на ранив в условиях культуры, 2) простота модуляции регуляторные элементы ремонта, и 3) способность к изображению процесс ремонта, в полном объеме, в режиме реального времени. Таким образом, задача в том, чтобы создать модель культуры, в которой можно было учиться, и манипулировать, эпителиальных ремонт раны в родном микросреды клеток. Наличие этой раны ремонта модели открывает новые возможности для идентификации эндогенных реплики сигнализации от матричных белков, цитокинов и хемокинов, которые регулируют процесс восстановления. Кроме того, модель идеально подходит для изучения того, какп эпителий способен двигаться как коллективная листа повторно epithelialize рану площадь 2,3, а для определения происхождение лидера мезенхимальных клеток в края раны, что функционировать в управлении коллективной миграции потерпевшей эпителия 4. Эта модель также предоставляет платформу, с которой, чтобы определить терапевтические средства, которые могли бы способствовать эффективному заживлению ран и предотвращению аномальным раны ремонт 5.

Есть уже ряд доступных моделей раны ремонт, и в культуре, и в естественных условиях, которые предоставили большую часть того, что известно о процессе заживления раны сегодня. В моделях на животных травмы, такие как роговицы и кожи 6-12 13-17, есть возможность изучать реакцию ткани ранив в контексте всех ремонтных посредников, которые могли бы быть вовлечены в процесс, в том числе взносов сосудистая и нервная система. Тем не менее, существуют ограничения на манипуляции экспериментовпсихические состояния в естественных условиях, и это пока не представляется возможным провести исследования изображений отклика ремонт в естественных условиях, непрерывно в течение времени. В противоположность этому, большинство в пробирке с раной ремонт модели культуры, такие как царапины раны, можно легко манипулировать, и последующим течением времени, но не хватает на окружающую контексте изучения заживления ран в ткани в естественных условиях. В то время как исключая виво модели имеют преимущество в изучении процесса ремонта повреждений непрерывно в течение времени в контексте микроокружения клеток в сочетании со способностью модулировать регуляторов молекулярной ремонта в любой момент времени в процессе, есть несколько моделей, которые соответствуют этим Параметры.

Здесь описан порядок генерировать высоко воспроизводимое Экс Vivo эпителиальных ранозаживляющее культур, которые воспроизводят ответ эпителиального ткани в к физиологической ранения. Использование куриных эмбрионов объектив в качестве источника ткани, экс естественных MOCК хирургии катаракты проводится. Объектив идеально подходит ткань использовать для этих исследований, так как он является самодостаточным в толстой базальной мембраны капсулы, асептический, не иннервируются, и без каких-либо связанного стромы 18,19. В болезни человека, хирургия катаракты обращается к потере зрения из-за помутнение хрусталика, и включает в себя удаление клеточной массы линзы волокна, который включает большую часть объектива. После хирургии катаракты зрение восстанавливается путем включения искусственного хрусталика. Процедура хирургии катаракты, за счет удаления волокон клеток, индуцирует ответ травмы в соседнем линзы эпителия, который отвечает реэпителизацию заднего области капсулы хрусталика, которые были заняты клеток волокон. В хирургии катаракты, как и в большинстве ответов заживления ран, там иногда происходит аберрантный фиброзной исход в заживления ран ответ, связанный с появлением миофибробластов, что в объектив известного как Posterior Capsuле Помутнение 20-22. Для создания хирургии катаракты заживление ран модель, процедура хирургии катаракты имитируется в линзах удалены из куриного эмбриона глаза, чтобы произвести физиологическое травмы. Микрохирургические удаление объектива волоконно клеток приводит в очень состоятельной зоне круговой раны в окружении объектив эпителиальных клеток. Это популяция клеток остается прочно прикреплены к мембраны капсулы линзы подвал и пострадал от хирургического вмешательства. Эпителиальные клетки мигрируют на обнаженную область эндогенного базальной мембраны, чтобы залечить раны, во главе с населением виментина богатых мезенхимальных клеток, известных в процессе ремонта, как лидер клеток 1. С помощью этой модели реакция эпителия на повреждение можно легко визуализировать и последующим со временем в контексте микроокружения клеток. Клетки были легко доступны для модификации экспрессии или активации молекул ожидается, будет играть роль в заживлении ран. Мощная функция гоэто модель способность изолировать и изучать миграции конкретных изменений в рамках заживления ран. Возможность подготовки большого числа в возрасте подобранных бывших естественных условиях заживления ран культур для исследований является еще одним преимуществом этой модели. Таким образом, эта модель системы дает уникальную возможность дразнить друг от друга механизмы заживления ран и тестирования терапии для их влияния на процесс заживления ран. Экс естественных макет модель хирургии катаракты, как ожидается, широкое применение, обеспечивая критический ресурс для изучения механизмов ремонта повреждений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Следующий протокол соответствует руководящим принципам Уходу за животными и использование комитета Университете Томаса Джефферсона и заявления ARVO для использования животных в Vision Research.

1. Установка и подготовка Объективы для экс Vivo ран культуры

  1. Поместите три 100 мм чашки Петри в стерильной, ламинарного потока капотом. Заполните два из чашек Петри с полпути Трис / декстроза буфера (TD буфера; 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 0,7 мМ Na 2 PO 4, 5 мМ D-глюкозы, 8,25 мМ трис-основани, рН до 7,4 с помощью HCl) при комнатной температуре , в результате чего третий пустым. Предварительно теплой культура СМИ (Media 199 дополнена, 1% L-глутамина и 1% пенициллина / стрептомицина) до 37 о С.
    Примечание: стандарт заживления питательных сред без сыворотки, как это происходит в естественных условиях; Однако раны-ремонтные культуры можно с успехом выращивать в определенных условиях медиа, которые включают сыворотку или другие факторы.
  2. Удалить благодатную эмбриональных Dай 15 белый леггорн куриных яиц из инкубатора (проводится в 37,7 ° С с нежным покачиванием)
  3. Поместите выбранный яйцо в ламинарный и чистой внешней оболочки с 70% этанола из промывочной бутылки. Провести все процедуры, приведенные ниже в асептических условиях в капюшоне ламинарного потока, используя стерильные растворы и инструменты.
  4. Crack яйцо и место содержание в пустую 100 мм чашки Петри. Обезглавьте эмбриона с использованием стандартных щипцов и тонкие ножницы. Поместите куриного эмбриона голову в чашку Петри, содержащую буфер TD и правильно распоряжаться оставшейся части эмбриона. При желании сохранить не куриного эмбриона головы в TD буфере в течение короткого периода времени, не дольше, чем 15 мин.
  5. Поместите куриного эмбриона голову на чашке крышкой блюдо. Использование высокоточных пинцета, снять объектив вместе с прикрепленной стекловидного тела из глаза в следующей последовательности. Зажмите заднюю часть глаза с помощью пинцета, чтобы создать небольшое отверстие в задней части глаза.
  6. Затем, возьмитесь стекловидного тела шIth щипцы и осторожно потянуть на стекловидное тело с качения, стекловидное тело с объективом будет смещена от глаза. Место линзы / стекловидного в оставшейся чашку Петри, содержащую буфер TD. Разрешить линзы, чтобы остаться в TD буфера не более чем на 30 мин.
  7. Перемещение объектива в новой крышкой чашки Петри при вскрытии микроскопом. С этого момента выполнения всех шагов при вскрытии микроскопом. С высокой точностью щипцы тщательно чистить от любой цилиарного тела (пигментные клетки), которые были выбиты с объективом, используя лезвие пинцетом, принимая осторожность, чтобы не повредить объектив ткани.
    Примечание: Удаление цилиарное тело гарантирует, что типы клеток, которые не эндогенным для объектива не включены в заживлении ран культуры.
  8. Отделите объектив от стекловидного тела с высокой точностью щипцов, зажимая от стекловидного тела от его ассоциации с задней капсулы хрусталика.
  9. Использование высокой точности щипцы передать объектив в маленькой каплиТД буфера (около 200 мкл) в 35-мм блюдо культуры ткани.

2. Выполнение Якобы хирургии катаракты

  1. Расположите объектив в капле TD буфера в 35 мм блюдо с передней поверхности объектива вверх.
    Примечание: передней линзы легко идентифицированы по наличию плотным кольцом в ткани, что отмечает границу между передней и экваториальной области хрусталика эпителия. В отличие от этого, есть отсутствие маркировки на задней капсулы хрусталика, в которой клетки линзы волокна присоединены.
  2. Использование двух Высокоточные пинцеты сделать небольшой разрез (примерно 850 мкм) в центре передней капсулы хрусталика, толстой базальной мембраны, которая окружает линзы ткани, и связанного с ним передней линзы эпителия, путем захвата ткани с одной щипцов в каждой руке и мягко дергая в противоположных направлениях.
  3. Снимите массу волокна клеток, что составляет основную часть линзы ткани, dislodПеренять его от вложений в объектив эпителия и окружающих капсулы хрусталика гидро-элюции (подход, используемый в классическом хирургии катаракты, смоделированной на рисунке 1А).
  4. Заполните 1 мл шприц с кончика иглы в 27,5 г с 300 мкл буфера TD. Вставьте кончик иглы в разрез, сделанный в передней капсуле хрусталика, и примерно на полпути в объектив.
  5. Аккуратно нажмите на шприц для инъекций в TD буфер в массы линзы волокна клеток. Вводите между 50 и 200 мкл TD, и не более чем 300 мкл. Соблюдайте массу волокна клеток ослабив себя от эпителия и капсулы хрусталика.
  6. Использование высокоточных пинцета, удалить остатков массы волокна клеток от объектива через переднюю сайта разреза.
    Примечание: Эта процедура оставляет задняя объектива базальной мембраны капсулы, в которой клетки волокна были присоединены лишена клеток и травмированного объектива эпителий просто, смежную с этого сайта.

3. Preparinг Раненый объектив для Ex Vivo культуры

  1. Сведение объектива капсульный мешок, который образуется при хирургии катаракты, описанной выше на культуральную чашку, боковой клеток вверх, сделав пять разрезы в передней поверхности капсульного мешка.
  2. Сокращение перпендикулярно к исходному разреза до экватора линзы. Свести результирующие пять "закрылки" по капсуле хрусталика с прикрепленным эпителия на стороне культура блюдо капсулы вниз, мобильный стороной вверх. Примечание экс естественных условиях раненого объектив должен теперь взять на звезды или flowerlike формы (рис 1B).
  3. Для обеспечения капсулу на блюдо, нажмите мягко вниз с пинцетом в каждой точке звезды. Это позволит сделать небольшое углубление в пяти наиболее внешних концах эксплантата и привести к длительной привязанности к блюду.
    Примечание: Это можно повредить капсулу во время этой процедуры, и поэтому важно обеспечить капсулу на блюдо как можно ближе к кончикам FLAPS это возможно, а также сделать наименьшее количество точек крепления, насколько это возможно (как правило, два, максимум три за клапаном).
  4. Снимите буфер TD от 35 мм блюдо и заменить его 1,5 мл подогретого СМИ. Накройте блюдо 35мм с крышкой и место в инкубаторе (37 ° С, 5% СО 2).

4. Разделение Центральной миграционной зоны (CMZ), где реэпителизацию раненых Площадь задней капсулы происходит, от оригинала Приложении зона (Oaz) объектива эпителиальных клеток, для количественного анализа.

Примечание: клетки начинают двигаться в область CMZ сразу в ответ на повреждение. По дня в культуре достаточное количество клеток мигрируют через CMZ для молекулярной и биохимического анализа, после разделения CMZ и Oaz по микро-рассечение 23. Этот протокол включает в себя удаление одной створки (Oaz) одновременно с раненой области капсулы.

  1. Соблюдайте Demarкатион, четко видны под микроскопом рассекает, между Oaz и CMZ (рис 2А). Использование двух высокоточных пинцета, захватить с обеих щипцов на краю OAZ / CMZ линии, один раз, прилегающей к другу, по обе стороны от линии (рис 2A, B, стрелка).
  2. Использование одной рукой / один щипцы на стороне CMZ продолжать держаться раненого культуры, в то время как с другой стороны / щипцы, осторожно потяните Oaz по линии OAZ / CMZ. CMZ легко отделяется от Oaz вдоль этой линии. Продолжить вдоль этой линии вокруг всей культуре до двух регионах не полностью разделены.
  3. Изучите разделенных Oaz и CMZ фракции для молекулярного анализа, такие как РНК-Seq 24 или биохимического анализа, такие как вестерн-блоттинга или совместного иммунопреципитацией 23,25.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Создано Экс Vivo Модель для изучения процесса заживления ран на родном микросреды клеток

Чтобы исследовать механизмы, участвующие в регуляции заживления эпителия в родном микросреды клеток, клинически значимых экс естественных макет модель хирургии катаракты была создана. Эта модель создана из ткани хрусталика, который предлагает множество преимуществ благодаря своим внутренним свойствам: 1) объектив автономный орган окружен густым базальной мембраны под названием капсулы х...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь описана методика подготовки культуральной модели восстановления раны, которая включает в себя проведение ex vivo операции по удалению катаракты на хрусталиках куриного эмбриона после их удаления из глаза. Эпителий хрусталика реагирует на эту клинически значимую рану процессом восстановления, который близко имитирует тот, который происходит in vivo, и имеет общие черты с восстановлением ран в других эпителиальных тканях2,4. Несмотря на то, что протокол прост и понятен, выполнение операци...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Национальных институтов здравоохранения для A.S.M. (EY021784).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Хлорид натрия (NaCl)Использованиепри 140 мМ в буфере
TD хлорида калия (KCl)Использованиепри 5 мМ в буфере натрия
фосфата натрия (Na2HPO4)SigmaS0876при 0,7 мМ в буфере
TD D-глюкозы (декстрозы)Fisher ScientificD16-500Использование при 0,5 мМ в буфере TD
Tris BaseFisher ScientificBP152-1Использование при 8,25 мМ в буфере TD
Соляная кислотаFisher ScientificA144-500Использование при pH TD буфере до 7,4
среды 199GIBCO11150-059
L-глутаминCorning/CellGro25-005-CIИспользование при 1% в среде 199
Пенициллин/стрептомицинCorning/ CellGro30-002-CIИспользование при концентрации 1% в среде 199
100 мм чашкиПетри Fisher ScientificFB0875711Z
Stericup Фильтрующий блокMilliporeSCGPU01REИспользование для фильтрации стерилизуемых сред
Щипцы Dumont #5 (потребность 2)Fine Science Tools11251-20
35 мм Чашка для клеточных культурCorning430165
27 г 1 мл SlipTip с прецизионная игла для скольженияBD309623
Тонкие ножницыFine Science Tools14058-11
Стандартные щипцыFine Science Tools91100-12
Другие необходимые предметы: Общие инструменты для препарирования,   плодородные белые яйца леггорн, инкубатор для проверки яиц (увлажненный, 37,7 °; C), ламинарный проточный капюшон, бинокулярный стереовизионный препарирующий микроскоп

Ссылки

  1. Walker, J. L., et al. Unique precursors for the mesenchymal cells involved in injury response and fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 13730-13735 (2010).
  2. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature reviews. Molecular cell biology. 10, 445-457 (2009).
  3. Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of laboratory automation. 17, 59-65 (2012).
  4. Khalil, A. A., Friedl, P. Determinants of leader cells in collective cell migration. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 2, 568-574 (2010).
  5. Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification. Investigative ophthalmology & visual science. 48, 2214-2223 (2007).
  6. Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. Disruption of the basement membrane after corneal debridement. Investigative ophthalmology & visual science. 41, 1045-1053 (2000).
  7. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease. Investigative ophthalmology & visual science. 45, 1775-1788 (2004).
  8. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental eye research. 93, 927-936 (2011).
  9. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental eye research. 121, 178-193 (2014).
  10. Kuwabara, T., Perkins, D. G., Cogan, D. G. Sliding of the epithelium in experimental corneal wounds. Investigative ophthalmology. 15, 4-14 (1976).
  11. Sherrard, E. S. The corneal endothelium in vivo: its response to mild trauma. Experimental eye research. 22, 347-357 (1976).
  12. Stramer, B. M., Zieske, J. D., Jung, J. C., Austin, J. S., Fini, M. E. Molecular mechanisms controlling the fibrotic repair phenotype in cornea: implications for surgical outcomes. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 4237-4246 (2003).
  13. Escamez, M. J., et al. An in vivo model of wound healing in genetically modified skin-humanized mice. The Journal of investigative dermatology. 123, 1182-1191 (2004).
  14. Werner, S., Breeden, M., Hubner, G., Greenhalgh, D. G., Longaker, M. T. Induction of keratinocyte growth factor expression is reduced and delayed during wound healing in the genetically diabetic mouse. The Journal of investigative dermatology. 103, 469-473 (1994).
  15. Tarin, D., Croft, C. B. Ultrastructural studies of wound healing in mouse skin. II. Dermo-epidermal interrelationships. Journal of anatomy. 106, 79-91 (1970).
  16. Croft, C. B., Tarin, D. Ultrastructural studies of wound healing in mouse skin I. Epithelial behaviour. Journal of anatomy. 106, 63-77 (1970).
  17. Winstanley, E. W. The epithelial reaction in the healing of excised cutaneous wounds in the dog. Journal of comparative pathology. 85, 61-75 (1975).
  18. Wormstone, I. M., Wride, M. A. The ocular lens: a classic model for development, physiology and disease. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 366, 1190-1192 (2011).
  19. Danysh, B. P., Duncan, M. K. The lens capsule. Experimental eye research. 88, 151-164 (2009).
  20. Awasthi, N., Guo, S., Wagner, B. J. Posterior capsular opacification: a problem reduced but not yet eradicated. Archives of ophthalmology. 127, 555-562 (2009).
  21. Walker, T. D. Pharmacological attempts to reduce posterior capsule opacification after cataract surgery--a review. Clinical & experimental ophthalmology. 36, 883-890 (2008).
  22. Schmidbauer, J. M., et al. Posterior capsule opacification. International ophthalmology clinics. 41, 109-131 (2001).
  23. Menko, A. S., et al. A central role for vimentin in regulating repair function during healing of the lens epithelium. Molecular biology of the cell. 25, 776-790 (2014).
  24. Chauss, D., et al. Differentiation state-specific mitochondrial dynamic regulatory networks are revealed by global transcriptional analysis of the developing chicken lens. G3 (Bethesda). 4, 1515-1527 (2014).
  25. Leonard, M., Zhang, L., Bleaken, B. M., Menko, A. S. Distinct roles for N-Cadherin linked c-Src and fyn kinases in lens development. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 242, 469-484 (2013).
  26. Sieg, D. J., et al. FAK integrates growth-factor and integrin signals to promote cell migration. Nature cell biology. 2, 249-256 (2000).
  27. Sieg, D. J., Hauck, C. R., Schlaepfer, D. D. Required role of focal adhesion kinase (FAK) for integrin-stimulated cell migration. Journal of cell science. 112 (Pt 16), 2677-2691 (1999).
  28. Hauck, C. R., Hsia, D. A., Schlaepfer, D. D. The focal adhesion kinase--a regulator of cell migration and invasion). IUBMB life. 53, 115-119 (2002).
  29. Zhao, X., Guan, J. L. Focal adhesion kinase and its signaling pathways in cell migration and angiogenesis. Advanced drug delivery reviews. 63, 610-615 (2011).
  30. Menko, A. S., Bleaken, B. M., Walker, J. L. Regional-specific alterations in cell-cell junctions, cytoskeletal networks and myosin-mediated mechanical cues coordinate collectivity of movement of epithelial cells in response to injury. Experimental cell research. 322, 133-148 (2014).
  31. Martin, P. Wound healing--aiming for perfect skin regeneration. Science. 276, 75-81 (1997).
  32. Ferguson, M. W., O'Kane, S. Scar-free healing: from embryonic mechanisms to adult therapeutic intervention. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359, 839-850 (2004).
  33. Redd, M. J., Cooper, L., Wood, W., Stramer, B., Martin, P. Wound healing and inflammation: embryos reveal the way to perfect repair. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359, 777-784 (2004).
  34. Nodder, S., Martin, P. Wound healing in embryos: a review. Anatomy and embryology. 195, 215-228 (1997).
  35. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ex vivo

Похожие статьи