Электронная спектроскопическая визуализация может отображать и отличать нуклеиновую кислоту от белка с нанометровым разрешением. Его можно комбинировать с системой miniSOG, которая способна специфически маркировать помеченные белки в образцах просвечивающей электронной микроскопии. Использование этих технологий мы проиллюстрируем на примере двухцепочечных очагов восстановления разрывов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Визуализация miniSOG меткой репарации ДНК белков в сочетании с электронной спектроскопии изображений (ESI)
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Пределы оптическим разрешением и вызов определения конкретных групп населения белка в просвечивающей электронной микроскопии было препятствий в клеточной биологии. Многие явления не может быть объяснено с помощью анализа ин витро, в упрощенных системах и необходимость дополнительной структурной информации на месте, в частности, в диапазоне от 1 нм до 0,1 мкм, для того, чтобы полностью понять. Здесь электронной спектроскопии изображений, техника микроскопия электрона передачи, который позволяет одновременное отображение распределения белков и нуклеиновых кислот, а тег выражение, miniSOG, объединяются, чтобы изучить структуру и организацию ДНК двухцепочечной ремонта перерыв очагов.
Введение
Несмотря на значительные достижения в световой микроскопии за последние годы 1, сотовые биологи до сих пор страдают от разрыва в резолюции. Это ограничивает понимание структурно-функциональных отношений в основных клеточных процессах, которые связаны согласованное взаимодействие между макромолекулярных комплексов (например, в хроматина, репарации ДНК, транскрипции РНК и ДНК) репликации. Хотя электронные микроскопы передачи (ТЕА) S обеспечивает требуемое разрешение, он был сложным определить эти процессы структурно из-за невозможности обозначения специфических белков в то же время быть в состоянии определить биохимический состав визуализированных с....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Генерация miniSOG клеточных линий
- Выращивают U2OS (остеосаркомы человека) клетки в 35 мм чашку, содержащую 2 мл низкий уровень глюкозы в модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM), который с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 Атмосфера.
- Трансфекции клеток, когда они 80% сливной липофекцией с очищенной качества трансфекции (A269 / 280 Коэффициент 1,8-2,0) плазмидные конструкции, содержащие последовательности для miniSOG и mCherry меченых белков ремонт в соответствии с протоколом производителя реагента для трансфекции 19. Выражение плазмиды miniSOG можно заказать....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
ESI
Сравнивая изображения УНИ ядра (рисунок 1) с обычными ТЭМ изображений (например, 7-1) показывает резкое увеличение анатомических структур, которые могут быть легко отличить. Хроматиновые хребты появляются в желтый и это довольно легко определить хромоцентров в клетках мыши. Ядрышки можно легко отличить от хроматина их круглой структуры и разного цвета, так как предварительно собранные рибосомы уже содержат большое количество бел.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
ESI может служить отличным инструментом для изучения различных состояний хроматина и рибонуклеопротеинов в ядре, потому что он способен специфически карту области, которые богаты фосфором. Это глубоко увеличивает количество деталей, которые могут быть получены с помощью электронного микроскопа и не зависит от неспецифических методов контрастными. Одним из недостатков ESI, что это требует более тонких секций, чем обычные ПЭМ в то же ускоряющего напряжения. Эту проблему можно решить путем работы с серийных срезов или с ис.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим доктора Роджера Тсьена за предоставление нам конструкций miniSOG. Доктора Сюэцзюня Суна за помощь с TEM. Лиза Лем и Питер Шиппл из Института рака Кросс за снабжение кислородом. Хильмар Стрикфаден является стипендиатом Фонда борьбы с раком Альберты и получил поддержку от Bayrische Forschungsallianz. Эта работа была поддержана грантами Канадского института исследований в области здравоохранения и Фонда борьбы с раком Альберты.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Посуда со стеклянным дном 35 мм | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Решетчатая посуда со стеклянным дном 35 мм | MatTek | P35G-2-14-CGRD | Не предназначен для целей погружения |
| LR White: акриловая смола | emsdiasum | 14381 | |
| LR White accelerator | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3′-Диаминобензидина тетрагидрохлорид 10 мг | таблетки Sigma | D5905 | |
| Slim Bar Grids 300 меш | SPI | 1161123 | |
| Tungsten-Point Lab Pen | emsdiasum | 41148 | |
| Тетраоксид осмия | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208 carbon | Cressington | ||
| Ultra microtome Leica EM UC6 | Leica | ||
| Photoshop CS5 | Adobe | может работать даже со старыми версиями | |
| Digital Micrograph V.2.30 | Gatan | может даже работать со старыми версиями | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| Effectene | Quiagen | ||
| miniSOG-Constructs | Tsien-Lab | tsienlab@yahoo.com | |
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
| 53BP1 miniSOG mCherry | |||
| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| цезиевый 137 источник излучения "МАРК 1" | ( J.L. Shepherd & Связанный) | ||
| ImageJ/FiJi | открытый исходный код | http://fiji.sc/Fiji | |
| 2 мл Eppendorf tubes | Fisherbrand | 05-408-146 | |
| Diamond Knife ultra 35° | Диатомный | ||
| нож для обрезки ультра | тригидрат Диатома | ||
| натрия какодилата | emsdiasum | 12300 | Осторожно, токсичный! |
| Глутаральдегид ЭМ Класс 8% | emsdiasum | 16020 | Осторожно Токсичен! |
| Фосфат натрия двухосновной | emsdiasum | 21180 | |
| Фосфат натрия одноосновной | emsdiasum | 21190 | |
| Параформальдегид | emsdiasum | 19202 | |
| Тетраоксид осмия 4% раствор | emsdiasum | 19150 | |
| Инвертированный флуоресцентный микоскоп Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Соляная кислота | Fisherbrand | A142-212 | |
| Раствор гидроксида натрия 10M | Fluka | 72068 | |
| Кислород | Medigas | ||
| 3-амино-1,2,4-триазол | Sigma | A8056 | |
| Цианистый калий | Sigma | 207810 | Осторожно, токсичный! |
| Этанол | emsdiasum | 15058 | Осторожно, токсичный! |
| Лезвие бритвы Однолезвие, углеродистая сталь | emsdiasum | 71960 | Осторожно, Острый! |
| DMEM | Sigma | D 5546 | |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | |
| G418 | Life Technologies | 11811-023 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Просвечивающий электронный микроскоп 200 кВ | JEOL | 2100 | |
| GIF Tridiem 863 Энергетический фильтр | Gatan |
Ссылки
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).
- Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. Stoichiometric analysis of protein....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
