Методическая статья

Генерация масштабируемой, металлик высоких-Aspect Ratio нанокомпозитов в биологическом жидкой среде

8.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52901

⸱

8 июля 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1Biophysics Department, Centenary College of Louisiana, 2Department of Chemistry, Louisiana Tech University, 3Department of Integrative Physiology, University of North Texas Health Sciences Center, 4Biomedical Engineering, Louisiana Tech University, 5Institute for Micromanufacturing, Louisiana Tech University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы приводим протокол к синтезу новых, высоких соотношение сторон биокомпозитов в биологических условиях и в жидких средах. В биокомпозиты шкале от нанометров до микрометров в диаметре и длиной, соответственно. Наночастицы меди (ЧАЭС) и сульфата меди в сочетании с цистина являются ключевыми компонентами для синтеза.

Аннотация

Цель этого протокола заключается в описании синтез двух новых биокомпозитов с высокой соотношением сторон структур. В биокомпозиты состоят из меди и цистина, либо с наночастицами меди (ЧАЭС) или медного купороса, способствующего металлический компонент. Синтез проводят в жидкости в биологических условиях (37 ° C) и самоорганизующихся композитов форме после 24 часов. После образования эти композиты обладают высокой стабильностью в обоих жидких сред и в сухом виде. Композиты масштабироваться от нано- до микро- диапазон в длину, и от нескольких микрон до 25 нм в диаметре. Выбросов поле сканирующей электронной микроскопии с энергетической дисперсии рентгеновской спектроскопии (EDX) показал, что сера присутствует в НП-производных линейных структур, в то время как она отсутствовала из исходного материала CNP, таким образом подтверждая цистина в качестве источника серы в конечных нанокомпозитов , Во время синтеза этих линейных нано- и микро-композитов, разнообразных длин улuctures формируется в синтез судна. Ультразвуком жидкую смесь после синтеза был продемонстрирован, чтобы помочь в контроле средний размер структур путем уменьшения средней длины с увеличением времени обработки ультразвуком. Поскольку образованные структуры обладают высокой стабильностью, не агломерации, и образуются в жидкой фазе, центрифугирование также может быть использован для помощи в концентрации и сегрегации, образованные композитов.

Введение

Медь является высокореакционноспособным металлом, который в биологическом мире необходим для некоторых ферментных функций 1,2, но в более высоких концентрациях очень токсичен, в том числе в форме наночастиц 3,4. Обеспокоенность по поводу токсичности меди стала более актуальной по мере использования ЧПУ и других наноматериалов на основе меди из-за увеличенной площади поверхности/массы наноструктур. Таким образом, даже небольшая масса меди в форме наночастиц может вызвать местную токсичность из-за ее способности проникать в клетку и расщепляться на реактивные формы. Некоторые биологические виды могут вступать в комплекс с ионами металлов и хелатировать их, и даже включать их в биологические структуры, как это было описано у морских мидий. При изучении потенциальных токсических эффектов наноматериалов 4 было обнаружено, что со временем и в биологических условиях, используемых для типичного культивирования клеток (37 °C и 5%CO2), могут образовываться стабильные медные биокомпозиты с высокой аспектной (линейной) структурой.

В результате процесса исключения первоначальное открытие этих линейных биокомпозитов, которое произошло в полной среде для клеточных культур, было упрощено до определенного протокола основных элементов, необходимых для самосборки биокомпозитов. Было обнаружено, что самосборка двух типов высоколинейных биокомпозитов возможна с двумя исходными металлическими компонентами: 1) ЧПУ и 2) сульфатом меди, при этом общим биологическим компонентом является цистин. Хотя ранее сообщалось о более сложных, так называемых «ежовых» и «наноцветочных» медьсодержащих структурах с наноразмерными и микроразмерными свойствами, они были получены в небиологических условиях, таких как температура 100 °C или выше 6-8. Насколько нам известно, синтез отдельных, линейных медьсодержащих наноструктур, масштабируемых в жидкой фазе в биологических условиях, ранее не описывался.

Один из исходных материалов, используемых для синтеза нанокомпозитов, а именно CNP, как сообщалось ранее, очень токсичен для клеток 4. Недавно сообщалось, что после образования нанокомпозитов эти структуры менее токсичны в расчете на массу, чем исходные НЧ9. Таким образом, описанный здесь синтез может быть получен в результате биологической и биохимической реакции, которая имеет значение для стабилизации реакционноспособных форм меди, как в смысле преобразования формы NP в более крупные структуры, так и в плане получения композитов, менее токсичных для клеток.

В отличие от многих других форм наноматериалов, которые, как известно, агрегируются или слипаются при взаимодействии с биологическими жидкими средами 10,11, после образования высоколинейные композиты, описанные здесь, избегают агрегации, возможно, из-за перераспределения заряда, о котором ранее сообщалось 9. Как подробно описано в настоящей работе, такое избегание агрегации удобно для целей работы с однажды сформированными структурами, по крайней мере, по 3 причинам: 1) сформированные композитные структуры могут быть сконцентрированы с помощью центрифугирования, а затем легко диспергированы снова с помощью вихревого перемешивания; 2) сформированные структуры могут уменьшаться в среднем по размеру за разные периоды времени; и 3) образованные линейные структуры могут обеспечить дополнительный инструмент для предотвращения недавно описанного «эффекта кофейного кольца» 12 и, таким образом, обеспечить легирующую примесь для создания более равномерно распределенных покрытий материалов, особенно содержащих сферические частицы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Планирование экспериментов

  1. Определить объем медных нанокомпозитов, необходимых для синтеза. На этой основе, выбрать количество мелких флаконах объемом 25 см (2), или больших колбах, как указано ниже, в подготовке материалов.
  2. Для этого синтеза, использовать 37 ° C инкубатор с 5% СО 2 и по меньшей мере 40% влажности. Убедитесь, что такое инкубатор доступен и что она не будет повторно нарушена в течение периода синтеза (примерно 24 ч).
    ВНИМАНИЕ: Повторное открытие и закрытие инкубатора, безусловно, вызывают колебания температуры, которые могут привести к изменению синтеза нанокомпозитных структур.

2. Подготовка материалов

  1. Подготовьте все материалы свежие до начала эксперимента, путем добавления твердых материалов к действию растворителей перед синтез чтобы начать. Ведение исходных растворов цистина и медь исходных материалов в жидкости в течение долгого времени бEfore эксперимент не рекомендуется и может привести к переменным успехом. После вскрытия от поставщика, продолжают исходных материалов сухих обертыванием верхней части контейнера с парафильмом.
    Примечание: следующий протокол используется в качестве примера для реакции в 25 см колбы культуры 2 клеток с использованием 7 мкл цистина, 6643 мкл стерильной воды, и 350 мкл ЧАЭС.
  2. Приготовьте 2 мг / мл раствора наночастиц меди путем взвешивания, по меньшей мере 2 мг CNPS. Одноразовые перчатки во время этого шага, чтобы предотвратить возможный контакт с ЧАЭС с кожей. Поместите наночастиц в пустой стерильной 16 мл стеклянный флакон.
    1. Во флакон, содержащий CNPS, добавить стерильной деионизированной воды в соответствующем объеме, чтобы сделать 2 мг / мл раствора, и вихрь решение в течение 20 сек, чтобы обеспечить дисперсию наночастиц перед началом синтеза (по крайней мере, 1 мл общего объема рекомендуется). Не заполняйте флакон более половины пути с водой, так как это будет препятствовать смешивания встряхиванием. ЧАЭС Вильл быстро оседают на дне флакона и темным цветом (серый до черного).
    2. Разрушать ультразвуком решение для CNP 17 мин при комнатной температуре, чтобы обеспечить максимальную дисперсию ЧАЭС до начала синтеза. Периодически проверяйте, чтобы убедиться, что ЧАЭС смешиваете в связи с ультразвуком. После успешного ультразвуком, ЧАЭС остаются взвешенными в растворе в течение по крайней мере 30 мин и решение будет темного цвета.
  3. Взвесить достаточную массу цистина, чтобы сделать 72,9 мг Раствор / мл для синтеза. Так цистина непосредственно не растворим в воде, поместить взвешенное цистина в антистатический весом судна.
    1. Для взвешивания сосуд, содержащий цистин, добавить достаточный объем стерильной, 1 М NaOH, так что цистин полностью растворяется. Например, растворите 7,29 мг цистин полностью в 100 мкл 1 М NaOH, чтобы 72.9 мг / мл раствора.
    2. Для поддержания стерильных условий, осуществлять этот шаг в стерильной поток тканевой культуры капот.
      ВНИМАНИЕ: NaOHна 1 М концентрации каустической, так что носить одноразовые перчатки во время этого шага, чтобы предотвратить контакт концентрированного NaOH с кожей
  4. Работа в стерильной капот культуры ткани, добавить 7 мкл цистина с 6643 мкл стерильной воды в стерильной колбе сначала синтеза, и пусть инкубировать в течение 30 мин в термостате при 37 ° С с крышкой флакона вентилируемые (свободные), чтобы обеспечить эффективное смешивание. Ресуспендируют 2 мг / мл раствора CNP встряхиванием в течение 30 сек, так CNPS будет решен после стадии обработки ультразвуком.
    1. Добавьте достаточное решение CNP в синтез колбу (с использованием стерильных), чтобы сохранить следующие соотношения компонентов: 1 объединить части цистин, 50 частей ЧАЭС и 949 части стерильной воды в 25 см 2 колбу клеток культуры, чтобы начать синтез. Например, для синтеза объема 7 мл, сочетают 7 мкл исходного раствора цистина, 350 мкл CNPS и 6643 мкл стерильной воды. Установите крышку на колбу и затянуть так, чтобы она SECURе.
    2. После объединения всех компонентов для синтеза, осторожно перемешать в колбе, вращая 4-5 раз. Поместите колбу в CO 2, инкубаторе и вентиляционные колбу, ослабив крышку так, что будет газообмен и из колбы в процессе синтеза.
  5. Разрешить синтеза работать в инкубаторе в течение приблизительно 24 часов. Во время синтеза, можно наблюдать, с микроскопией и на глаз, формирование высокой линейных композитов.
    Примечание: процесс формирования структур может произойти внезапно в том смысле, что структуры первоначально трудно обнаружить, а затем появление быстро переходит к увеличению плотности. Поэтому формирование может происходить до 24 часов. Процесс также может наблюдаться на глаз сразу структуры становятся больше и их плотность увеличивается. В то время как поколение структур можно наблюдать в течение долгого времени под микроскопом и на глаз в более поздние моменты времени, постоянно прерывая условий синтеза и температуры приведет к беднымРезультаты синтеза.
  6. Завершить синтез биокомпозитов от плотно укупорки синтез колбу и хранения судна в холодильнике (4 ° С). Структуры, порожденные однажды, остаются стабильными в этом виде, по крайней мере год. Этикетка колбу с условиями синтеза, в том числе компонентов, используемых, дата синтеза и времени инкубации синтеза до расторжения.

3. Синтез Использование медного купороса

  1. Провести синтез самосборки заменой ЧАЭС с медной сульфатной соли. Использование метода стерилизации, растворяются по меньшей мере, 2 мг меди сульфата в достаточном объеме стерильной деионизированной воды, чтобы сделать 2 мг / мл раствора. Кристаллы сульфата меди легко переходят в раствор при этой концентрации, но вихрь флакон, если это необходимо, и проверить на глаз, чтобы гарантировать, что все кристаллы растворяют.
  2. После подготовки сульфата меди, осуществить синтез, как описано выше, но с заменой CNPS с сульфатом меди.
    Примечание: Самоорганизующиеся нанокомпозитов с использованием сульфата меди в качестве исходного материала, оказались гораздо более последовательным в окончательной форме, чем для структур, синтезированных из CNPS.
  3. Завершить синтез сульфата меди биокомпозитов за CNP композитов (шаг 2.6) и хранить их долгосрочные при 4 ° С.

4. Характеристика и обращение биокомпозитов после синтеза

  1. Охарактеризовать биокомпозитов полученные от ЧАЭС и от медного купороса белым световой микроскопии 9 и с помощью электронной микроскопии 9.
    1. Для определения характеристик и проверки биокомпозитов после синтеза белым световой микроскопии, использовать инвертированный микроскоп, как композитов будет располагаться на нижней поверхности колбы в течение нескольких минут укладки колбу плоской, а затем могут быть введены в фокусе. Используйте параметр светлого поля на микроскопе, чтобы максимизировать контраст между биокомпозитов и жидкой среде. Композиты, полученные из ЧАЭС и КСза купороса и появляются ясно непрозрачными в цвете, но не вступившие в реакцию агрегаты CNP появится очень темный цвет.
      1. Используйте цифровой камерой, подключенной к микроскопу для захвата изображений из композитов. Будет наблюдаться диапазон длин для отдельных структур.
    2. Для характеристики и осмотра биокомпозитов после синтеза и после хранения при 4 ° С, позволяют колбы прийти к комнатной температуре в течение не менее 15 мин, как колбы образуют конденсат изначально при удалении от холодильника, который будет затруднять эффективное фокусировки при проведении томографии микроскопии. После выдерживания уравновешивание до комнатной температуры, протереть верхнюю и нижнюю поверхности колбы с чистым бумажным полотенцем, чтобы максимизировать качество изображения микроскопии.
    3. При работе или изображений композитов, которые были сохранены в долгосрочной перспективе, вихревые колбы в течение 30 сек отделить скопления композитов, которые образуют в то время как в холодильнике. После встряхивания, осмотрите структуры с перевернутой микрофономroscope чтобы гарантировать, что агрегаты диссоциируют, и повторить вортексе по мере необходимости.
    4. Используйте перевернутую белый световой микроскопии, чтобы оценить эффективность синтеза для данного эксперимента с использованием ЧАЭС. Например, документ на наличие или отсутствие непрореагировавшего CNPS в синтезе колбах, используемых для CNP-производных биокомпозитов из колбы с различными параметрами, такими как время синтеза.
      Примечание: Индивидуальные ЧАЭС слишком малы, чтобы наблюдать с помощью оптического микроскопа, но не вступивший в реакцию CNP агрегатов появится в круглом виде и темных объектов, в отличие от синтезированных успешно CNP-композитов, которые будут иметь высокую соотношение, линейную форму, и будет иметь ряд различных длин. Избегайте проведения синтеза слишком долго из период времени до окончания, так как это приведет к сильно разветвленных "ежа" структур типа, которые трудно диспергировать в отдельных структурах, образованных раз.
    5. Используйте перевернутую белый световой микроскопии для оценки эффективностисинтеза для данного эксперимента с использованием сульфата меди. Так, сульфат меди идет полностью в раствор, используя этот протокол, решение будет казаться менее темные, чем решение от синтеза с использованием ЧАЭС. Документ размер и степень медного купороса композитов путем сравнения колбы с разными условиями синтеза, такие как время синтеза до расторжения.
      Примечание: Успешно синтезированные композиционные покажет спектр различных длин. Избегайте проведения синтеза слишком долго из период времени до окончания, так как это приведет к сильно разветвленных агрегатов из композиционных материалов, некоторые из которых будут "ежа, как" по своей структуре, и которые трудно диспергировать в отдельных структурах, образованных раз ,
  2. Сосредоточить биокомпозитов пост-синтез, центрифуг решения композитов в центрифужную пробирку. Добавить 6 мл либо CNP-производных структур или сульфат меди, полученных структур в 15 мл центрифужную пробирку. Центрифуга в течение 10 минпри 500 х г при комнатной температуре с образованием гранул. Для небольших объемов, добавьте 500 мкл структур в растворе 0,6 мл размера трубы. Центрифуга на 2000 мкг при комнатной температуре в течение по крайней мере 10 минут для получения гранул.
    1. После центрифугирования в течение достаточного времени (по крайней мере, 10 мин) для microfuges, сохранить наблюдаемый осадок на дне пробирки, где структуры концентрируют путем тщательного удаления надосадочной жидкости над осадком. Биокомпозита структуры, полученные из сульфата меди появляются синего цвета и структуры, полученных от ЧАЭС темнее (серый до черного).
    2. Добавить еще композитов для этой трубки и повторите процесс в той же трубе, чтобы сконцентрироваться структуры, если это необходимо. Для разгона концентрированных гранул, добавление нужного объема раствора к трубке, и вихрь в течение 10-30 сек.
  3. Соникатные структуры после формирования, чтобы переместить средний размер популяции (длины) структур к меньшим значениям. Место структур в стерильной деионизированной воды и разрушать ультразвуком в течение по крайней леАСТ 10 мин. Используя этот процесс, в течение долгого времени, структуры становятся фрагментированным и меньше средней длины (рисунок 6 текста). Изменения документов в композитных размеров с различными временами ультразвуком с использованием перевернутый белый световой микроскоп и цифровую камеру.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 показана блок-схема Схема стадий синтеза с образованием линейных биокомпозитов, описанные в данной работе. CNPS или сульфат меди в качестве исходных материалов в сочетании с стерильной водой, чтобы образовать 2 мг / мл раствора в этот раствор смешивают и обрабатывают ультразвуком, чтобы обеспечить равномерное смеси, и этот медный раствор затем смешивают в следующем соотношении синтеза: 949 частей стерильной вода: 50 частей меди смесь: 1 часть цистина раствор. Фактические объемы могут быть у...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

При оценке потенциальных токсических эффектов наноматериалов, включая ЧАЭС, было отмечено, что в течение длительного срока, ЧАЭС были преобразованы из первоначально более дисперсной распределения частиц в большей, агрегированной форме (рисунок 2). В некоторых случаях, эти высоко агрегированные образования, которые были произведены в клеточной культуре блюдо, в биологических условиях, формируется очень линейные прогнозы от центрального агрегата, напоминающие описанному ранее медью, содержащие "ежей&...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы выражают признательность за техническую помощь Альфреду Гунасекарану в исследованиях электронной микроскопии в Институте микропроизводства Технологического университета Луизианы, а также доктору Джиму Макнамаре за помощь в дополнительных исследованиях микроскопии. Описанная работа была частично поддержана Луизианским советом регентов PKSFI Контракт No. LEQSF (2007-12)-ENH-PKSFI-PRS-04 и профессорская должность Джеймса Э. Уайча III от Технологического университета Луизианы (до доктора медицины).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Мини-вортексерVWR (https://us.vwr.com)58816-121
CO2 Инкубатор Модель # 2425-2VWR (https://us.vwr.com)Связаться с поставщикомТекущая модель calalog # 98000-360
Центрифуга Eppendorf (охлаждаемая микроцентрифуга)Labnet (http://labnetinternational.com/)C2500-RМодель Prism
R Центрифуга для клеточных культур Модель Z323KLabnet (http://labnetinternational.com/)Связаться с продавцомТекущая модель Z206A каталог # C0206-A
Ультразвуковой аппарат (ультразвуковой очиститель)Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/)1510R-MTH
BalanceSartorius (http://dataweigh.com)Модель CP225D аналогичная модель CPA225D
Olympus IX51 Микроскоп с инвертированным светомOlympus ( http://olympusamerica.comСвязаться с продавцом
микроскопа Olympus DP71 цифровая фотоаппаратOlympus (http://olympusamerica.comСвязаться с производителем
внешнего блока питания - белый свет для микроскопа OlympusOlympus (http://olympusamerica.comобъективы микроскопа TH4-100
10X, 20X и 40XOlympus (http://olympusamerica.comСвязаться с поставщиком
Сканирующий электронный микроскопHitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html)модель S-4800
Просвечивающий электронный микроскопZeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html)модель Libra 120
Настольная рабочая станция Однонаправленный поток Clean BenchEnvirco (http://envirco-hvac.com)модель PNG62675Используется для стерильных клеточных культур техника

Ссылки

  1. Klinman, J. P. The copper-enzyme family of dopamine beta-monooxygenase and peptidylglycine alpha-hydroxylating monooxygenase: resolving the chemical pathway for substrate hydroxylation. The Journal of biological chemistry. 281, 3013-3016 (2006).
  2. Uauy, R., Olivares, M., Gonzalez, M. Essentiality of copper in humans. The American journal of clinical nutrition. 67, 952S-959S (1998).
  3. Karlsson, H. L., Cronholm, P., Gustafsson, J., Copper Moller, L. oxide nanoparticles are highly toxic: a comparison between metal oxide nanoparticles and carbon nanotubes. Chemical research in toxicology. 21, 1726-1732 (2008).
  4. Parekh, G., et al. Layer-by-layer nanoencapsulation of camptothecin with improved activity. International journal of pharmaceutics. 465, 218-227 (2014).
  5. Harrington, M. J., Masic, A., Holten-Andersen, N., Waite, J. H., Fratzl, P. Iron-clad fibers: a metal-based biological strategy for hard flexible coatings. Science. 328, 216-220 (2010).
  6. Keyson, D., et al. CuO urchin-nanostructures synthesized from a domestic hydrothermal microwave method. Materials Research Bulletin. 43, 771-775 (2008).
  7. Liu, B., Zeng, H. C. Mesoscale organization of CuO nanoribbons: formation of 'dandelions'. J Am Chem Soc. 126, 8124-8125 (2004).
  8. Peng, M., et al. Controllable synthesis of self-assembled Cu2S nanostructures through a template-free polyol process for the degradation of organic pollutant under visible light. Materials Research Bulletin. 44, 1834-1841 (2009).
  9. Deodhar, S., Huckaby, J., Delahoussaye, M., DeCoster, M. A. High-Aspect Ratio Bio-Metallic Nanocomposites for Cellular Interactions. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 64, 012014(2014).
  10. Montes-Burgos, I., et al. Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies. Journal of Nanoparticle Research. 12, 47-53 (2010).
  11. Wiogo, H. T., Lim, M., Bulmus, V., Yun, J., Amal, R. Stabilization of magnetic iron oxide nanoparticles in biological media by fetal bovine serum (FBS). Langmuir. 27, 843-850 (2011).
  12. Yunker, P. J., Still, T., Lohr, M. A., Yodh, A. G. Suppression of the coffee-ring effect by shape-dependent capillary interactions. Nature. 476, 308-311 (2011).
  13. Kahler, H., Lloyd Jr, B., Eden, M. Electron Microscopic and Other Studies on a Copper–Cystine Complex. The Journal of Physical Chemistry. 56, 768-770 (1952).
  14. Furia, E., Sindona, G. Complexation of L-cystine with metal cations. Journal of Chemical & Engineering Data. 55, 2985-2989 (2010).
  15. Hawkins, C., Perrin, D. Polynuclear Complex Formation. II. Copper (II) with Cystine and Related Ligands. Inorganic Chemistry. 2, 843-849 (1963).
  16. Hallman, P., Perrin, D., Watt, A. E. The computed distribution of copper (II) and zinc (II) ions among seventeen amino acids present in human blood plasma. Biochem. J. 121, 549-555 (1971).
  17. Jensen, L. S., Maurice, D. V. Influence of sulfur amino acids on copper toxicity in chicks. The Journal of nutrition. 109, 91-97 (1979).
  18. Lee, Y., Choi, J. R., Lee, K. J., Stott, N. E., Kim, D. Large-scale synthesis of copper nanoparticles by chemically controlled reduction for applications of inkjet-printed electronics. Nanotechnology. 19, 415604(2008).
  19. Hume, J., et al. Engineered coiled-coil protein microfibers. Biomacromolecules. 15, 3503-3510 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи