Применяя INDUCIBLE системы экспрессии для изучения помех бактериальных факторов вирулентности с внутриклеточной сигнализации

Вирулентность многих грамотрицательных бактериальных патогенов зависит от специализированных систем секреции угнать эукариотических клеток-хозяев. Бактерии используют эти системы секреции вводить бактериальные белки вирулентности (эффекторов) в клетки-хозяина, чтобы модулировать различные клеточные и биохимические деятельности. Изучение эффекторных белков не только при условии, замечательный понимание фундаментальных аспектов принимающих / патогенных взаимодействий, но и в фундаментальной биологии эукариотических клеток ^1. Модуляция апоптоза клетки-хозяина, как было показано, является важным механизмом вирулентности в течение многих внутриклеточных патогенов, а также ряд эффекторных белков, модулирующих апоптоз были идентифицированы ^2-9. Тем не менее, их точные молекулярные механизмы остаются неизвестными активности во многих случаях.

Апоптоз, форма запрограммированной клеточной смерти, играет важную роль в иммунных реакций на инфекции ^10. Два основных пути, ведущие к апоптозу естьбыли определены: таргетинг митохондрий (внутренняя апоптоз) или прямой трансдукции сигнала через гибель клеток рецепторов на мембране (внешняя апоптоза). Внутренняя или митохондрии-опосредованной клеточной смерти путь инициируется внутриклеточных сигналов, и включает в себя активацию Bax и Bak, двух про-апоптотических членов семьи Bcl-2. Это семейство состоит из про- и анти-апоптотических белков регулятора, которые контролируют клеточную гибель ^11-14. Активация апоптоза приводит к олигомеризации Bax и Бак с последующей проницаемости митохондриальной наружной мембраны, в результате чего цитохрома C высвобождения в цитоплазму. Цитохром С релиз инициирует активацию эффекторных каспаз 3 и 7 через активацию каспазы 9 в апоптосома ^15. Это приводит к протеолиза отдельных подложек, которые, среди прочего, приводит к воздействию фосфатидилсерина на поверхности клеток ¹⁶ и освобождает выделенный ДНКазы, что фрагменты чromatin ^17,18.

Для того чтобы определить, где в каскаде апоптоза индивидуальный белок эффектор мешает, индуцируемый система экспрессии был использован ^19. Регулирующие системы условного выражения трансгенов было бесценным инструментом в анализе функции белка в клетке или его значение для ткани, органа и развития организма, а также при инициации, прогрессировании и поддержание болезни ^20-23. Как правило, индуцируемые системы управления, такие как системы Tet ^24, используемое здесь, образуют искусственное транскрипционной единицы (рисунок 1). Один компонент представляет собой искусственно сконструированную транскрипционный фактор, называемый TTA (тетрациклин-зависимой транскрипции активатор), образованный слиянием бактериальной транскрипции репрессором TetR ²⁵ до млекопитающих домена белка, который опосредует активацию транскрипции или глушителей ^24,26. Второй компонент представляет собой гибридпромоутер, называется TRE (тетрациклин проблематику элемент), состоящий из эукариотической минимального промотора, содержащего, по меньшей мере, ТАТА-бокс и сайт инициации транскрипции, присоединился к нескольким повторами родственного ДНК-связывающего сайта для тетр, Teto ^24,25. Третьим компонентом является естественным лигандом TetR, тетрациклина или одного из его производных, таких как anhydrotetracycline или доксициклин ^25. При лиганда дополнение к культуральной среде, TetR теряет сродство к Teto и отделяется от TRE. В результате транскрипции гена-мишени отменена. Экспрессии трансгена могут, таким образом, строго контролироваться в времени и зависимым от дозы образом как в культуре клеток и животных ^20,23,24. С TTA, трансгенная экспрессия происходит конститутивно, за исключением того, в присутствии тетрациклина. Это может быть недостатком в исследовании цитотоксических или онкогенных белков, поскольку тетрациклин сначала должен быть удален из системы, перед тем трансгенной expressioп происходит и эффекты белка-мишени на клетке можно контролировать. Это может быть трудоемким и не всегда бывает полным, особенно в трансгенных животных ^27. Для решения это ограничение, TetR мутант с обратной ответ на присутствие доксициклина был использован для создания нового фактора транскрипции, rtTA (обратный TTA) ^28. Это связывается только с TRE и, одновременно, активирует транскрипцию в присутствии доксициклина. Остаточный неплотности системы, т.е.., Трансген выражение в отсутствии TRE-связанного фактора транскрипции, происходящий либо (I) от эффектов положения в геномной сайта интеграции, (II) от самого TRE ^29, или (III) от не -специфический связывающий ТТА / rtTA ^28, был адресован введением дополнительного транскрипции глушитель, называют TTS (тетрациклин-зависимой транскрипции глушитель) ³⁰ к системе. Он образует двойную сеть регулятор вместе с rtTA (рисунок 1).При отсутствии доксициклин, ТЦ связывается с TRE и активно выключается оставшуюся транскрипции. В присутствии доксициклина, TTS диссоциирует от TRE и rtTA связывает одновременно индукции экспрессии гена-мишени. Этот дополнительный слой жесткости часто необходимо, чтобы выразить высокоактивные цитотоксические белки ^31-34.

Используя этот жестко контролируется система двойного регулятора, апоптическая каскад может быть начато при определенной стадии, позволяющей анализ может ли данный белок эффектор мешать индукции апоптоза. Этот метод не может быть использован только для изучения антиапоптозную активности бактериальных эффекторных белков, но и для индуцируемой экспрессии про-апоптотических или токсичных белков или для рассечения помех других сигнальных путей.

1. Генерирование стабильных клеточных линий, экспрессирующих белок, представляющий интерес

1. Подготовка СМИ, добавив тепла инактивированной ФТС и 1% пенициллина / стрептомицина в продаже Dulbecco's модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением Glutamax-I, пирувата и 4,5 г / л D-глюкозы.
2. Выращивают клетки HEK293 в среде при 37 ° С в 5% СО _2. Суб-культивировать клетки каждый третий день. Удалить СМИ и ресуспендирования клеток в 15 мл свежей среды. Внесите 1 мл в новом 75 см ² клеточной культуры колбу и добавить 14 мл средства массовой информации.
3. Анализ количества клеток с помощью гемоцитометра.
4. Семенной клетки HEK293 в 6-луночный планшет при плотности 2 × 10 ⁵ клеток на лунку и инкубируют в течение 24 ч.
5. Для трансфекции используют протокол предоставленную изготовителем реагента для трансфекции. Трансфекции клеток с pEGFP-C2 или pEGFP-C2-CAEB помощью реагента для трансфекции. Перед использованием нагреть до трансфекции КГНЛОР и СМИ, необходимые для РТ. Использование 3: соотношение реагента для трансфекции 1 с ДНК.
   1. Более подробно, пипетки 1,5 мкл реагента для трансфекции непосредственно в 50 мкл бессывороточной DMEM среде. Для образования комплекса, пипетки 0,5 мкг ДНК, кодирующей GFP или GFP-CAEB трансфекции реагента, содержащего смеси и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре.
   2. Трансфекции клеток путем добавления реакционной смеси в каплям образом и инкубируют при 37 ° С в 5% СО ₂ в течение 24 ч.
6. Добавить 1 мг / мл генетицина При выборе GFP-положительных клонов при 37 ° С в 5% СО _2.
7. Через 6 дней изолировать отдельные клетки с помощью проточной цитометрии сортировки в 96-луночный планшет, несущего среду и HEK293 супернатант в соотношении 1: 1. Генерация HEK293 супернатант из культивируемых клеток НЕК293 сливной что центрифугировали в течение 15 мин при 4966 х г.
8. На следующий день, заменить культуральной среды на среду, содержащую 1,50 мг / мл генетицина. Изменить СМИ один раз в неделю. Если клетки образуют сливающийся монослой, передать их в 24-луночный планшет. Суб-клетки культивируют два раза в неделю в соотношении 1: 5 в среде, содержащей 1,5 мг / мл генетицина. Наконец, анализ процент GFP-положительных клеток с помощью иммуноблот-анализа и проточной цитометрии.

2. Анализ стабильных клеточных линий, иммуноблот-анализа

1. Удалить супернатант и мыть прилипшие клетки сразу с теплой PBS. Ресуспендируют клеток в 100 мкл 2x буфера Лэммли образца, тепла в течение 5 мин при 95 ° С и хранить при -20 ° С.
2. Загрузить около 4 х 10 ⁴ клеток на образец на 12% SDS-PAGE гель. Кроме того, нагрузка 6 мкл коммерческой белка лестницы как маркер молекулярной массы. Запуск гели в системе гель-электрофореза при постоянном напряжении 180 В в течение 45-60 мин с 1x Laemmli подвижном буфере.
3. BLOT белков на мембраны ПВДФ (размер пор. 045 мкм) при постоянном напряжении 16 В в течение 60 мин с использованием транс-Клякса SD полусухое Cell Transfer.
4. Блок мембраны в 10 мл 5% обезжиренного сухого молока в PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) в течение 1 ч при комнатной температуре.
5. Развести 4 мкл анти-GFP антитела в 4 мл MPT и инкубировать мембраны O / N при 4 ° С.
6. Выполнение три стадии промывки 10 мин с 10 мл PBS / 0,05% Tween 20.
7. Инкубируйте мембраны с 0,8 мкл конъюгированного с пероксидазой хрена вторичного антитела в 4 мл MPT.
8. После 1 ч инкубации при комнатной температуре, промыть мембран три раза PBS / 0,05% Tween 20 (как описано в 2.6) и обнаруживать активность пероксидазы хрена с коммерческого набора в соответствии с протоколом производителя. Применить стандартное оборудование для проявки для визуализации белковых полос.

3. Анализ клеток с использованием цитометра потока.

1. Ресуспендируют клеток в PBS. Используйте HEK293 клетки в качестве отрицательного контроля, чтобы настроить вперед подкожноAtter (FSC) и боковое рассеивание (SSC), так что клетки находятся на шкале. Нарисуйте ворота на живые клетки путем исключения клеток дублеты, агрегаты и клеточных обломков.
2. Отрегулируйте ФЭУ (ФЭУ) усиление, так что неокрашенные клетки находятся на дальнем левом углу гистограммы для канала FL1 (аргонового лазера 488 нм).
3. Для анализа интенсивности флуоресценции HEK293-GFP и HEK293-GFP-CAEB клеток открыть гистограмму канала FL1 и приобрести 10000 событий на закрытом населения.
4. Анализ данных с помощью программного обеспечения для анализа коммерческие FACS.

4. Трансфекция Стабильный клеточной линии с индуцируемой вектор экспрессии системы

1. Семенной НЕК293, стабильно экспрессирующих GFP или GFP-CAEB в 12-луночный планшет при плотности 1 х 10 ⁵ клеток / лунку.
2. 19 ч после посева, со-трансфекции клеток с регулятором плазмиды и плазмиды ответ или кодирующей Вах или активированный каспазы 3.
   1. Со-трансфекции клеток HEK293 стабильные100 нг pWHE125-P регулятора плазмиды (рис 2) и 100 нг плазмиды реагирования pWHE655-hBax или pWHE655-revCasp3 (Рисунок 3) и 0,4 мкл полиэтиленимина.
   2. Подготовка ДНК и полиэтиленимином трансфекции реагента каждый в 75 мкл Opti-MEM среде и инкубировать точно 5 мин при комнатной температуре. Для образования комплекса, инкубируют обе смеси вместе в течение 15 мин при комнатной температуре.
3. Добавьте полиэтиленимин / ДНК раствор по каплям к клеткам и инкубируют при 37 ° С в 5% СО _2.

5. Индукция апоптоза

1. 5 ч после трансфекции, индуцируют экспрессию про-апоптотических белков путем добавления 1 мкг / мл доксициклина в культуральную среду. Инкубируйте клетки в течение 18 ч при 37 ° С в 5% СО _2.

6. Анализ клетка-хозяин апоптоза иммуноблот-анализа

1. Осмотрите клетки до чarvesting под световым микроскопом, чтобы проверить индукции клеточной смерти. Апоптотических клеток в детектируемый в присутствии апоптозных тел, окружающих клетки умирает.
2. Удалить супернатант и мыть прилипшие клетки сразу с теплой PBS. Ресуспендируют клеток в 100 мкл 2x буфера Лэммли образца, тепла в течение 5 мин при 95 ° С и хранить при -20 ° С.
3. Загрузить около 4 х 10 ⁴ клеток на образец на 12% SDS-PAGE гель. Кроме того, нагрузка 6 мкл коммерческой белка лестницы как маркер молекулярной массы. Запуск гели в системе гель-электрофореза при постоянном напряжении 180 В в течение 45-60 мин с 1x Laemmli подвижном буфере.
4. BLOT белков на мембраны ПВДФ (размер пор 0,45 мкм) при постоянном напряжении 16 В в течение 60 мин с использованием транс-Клякса SD полусухое Cell Transfer.
5. Блок мембраны в 10 мл 5% обезжиренного сухого молока в PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) в течение 1 ч при комнатной температуре.
6. Развести 4 μл анти-расщепляется поли АДФ-рибозы полимеразы (PARP) антитела в 4 мл и инкубируют MPT O / N при 4 ° С.
7. Выполнение три стадии промывки 10 мин с 10 мл PBS / 0,05% Tween 20.
8. Инкубируйте мембраны с 0,8 мкл конъюгированного с пероксидазой хрена вторичного антитела разводят в 4 мл MPT.
9. После 1 ч инкубации при комнатной температуре, промыть мембран три раза PBS / 0,05% Tween 20 (как описано в 6.7) и обнаруживать активность пероксидазы хрена с коммерческого набора в соответствии с протоколом производителя. Применить стандартное оборудование для проявки для визуализации белковых полос.
10. Удалить связанных антител на 30-минутной инкубации при комнатной температуре 7 мл вестерн-блот инверсионной буфера.
11. После трех промывок PBS / 0,05% Tween 20 (как описано в 6.7), зондировать мембраны с 4 мкл анти-актина антител в 4 мл MPT O / N при 4 ° С.
12. После трех стадий промывки с MPT (как описано в 6.7), инкубировать мембраны с 0,8 мкл хоrseradish конъюгированного с пероксидазой вторичных антител разводили в 4 мл MPT.
13. После 1 ч инкубации при комнатной температуре, промыть мембран три раза PBS / 0,05% Tween 20 (как описано в 6.7, и обнаружить активность пероксидазы хрена с коммерческого набора в соответствии с протоколом производителя. Применение стандартного оборудования для проявки для визуализации белковых полос.
    Примечание: Все стадии инкубации проводили на шейкере в течение указанного времени и температуры.

Во-первых, были созданы клеточные линии НЕК293, стабильно экспрессирующие белок, представляющий интерес (CAEB) в качестве белка GFP-синтеза. В качестве контроля также были получены клеточные линии НЕК293, стабильно экспрессирующие GFP. Выражение GFP и GFP-CAEB была проверена с помощью анализа иммуноблот. Представитель иммуноблот (4А) демонстрирует стабильный и ясно обнаруживаемый выражение GFP и GFP-CAEB. Тем не менее, этот анализ не может определить все клетки выразить ли GFP или GFP-CAEB. Таким образом, стабильно трансфицированные клеточные линии HEK293 были также проанализированы с помощью проточной цитометрии. Как показано на фиг.4В, более 90% клеток в обеих клеточных линий выражена GFP. Таким образом, эти стабильные клеточные линии могут быть использованы для дальнейшего анализа функции CAEB. На следующем этапе, Антиапоптозный активность CAEB анализировали с использованием антитела против расщепленного PARP с иммуноблот-анализа. Протеолитического расщепления PARP ядерного инактивирует репарации ДНК активность и является типичным маркером TERMINAL стадиях апоптоза. Расщепление PARP не обнаруживается в HEK293-GFP или HEK293-GFP-CAEB клеток, демонстрируя, что ни выражение GFP, ни GFP-CAEB токсичен для клеток. Однако, когда клетки обрабатывали стауроспорина, мощным индуктором апоптоза внутренней, расщепление PARP была обнаружена (рисунок 5). Важно отметить, что HEK293-GFP-клетки обладают CAEB уменьшается расщепление PARP, что указывает на антиапоптозную активность Coxiella burnetii типа IV система секреции белка эффекторной CAEB 7.

Для анализа, при котором шаг CAEB мешает пути апоптоза, работал система Тет-On. В деталях, HEK293-GFP или НЕК293-GFP-CAEB клетки трансфицировали плазмидой регулятор конструктивно выражать доксициклин управлением двойного репрессора / настройка активатора (рисунок 2) и кодировку pTRE ответ плазмиды либо полную длину человеческой Bax или активированную форму человек каспазы 3, называется revCasp 3 (Рисунок 3). Эта система жестко регулируется, как показано отсутствием PARP расщепления под неиндуцирующей условия (рис 6). Добавление доксициклина в трансфицированных клетках в результате экспрессии Bax или revCasp 3. Если CAEB мешает пути апоптоза вниз по течению от Bax, то апоптическая сигнал, генерируемый путем экспрессии и последующей активации Bax должны быть заблокированы путем экспрессии CAEB. Действительно, НЕК293, стабильно экспрессирующих GFP-CAEB глубоко ингибируют индукции апоптоза доксициклина управлением Вах выражения, в то время как НЕК293-GFP клетки отображается очевидную PARP расщепления. Этот результат показывает, что CAEB блоки индукции апоптоза ниже Вах активации. Далее, было проанализировано, можно ли CAEB мешать активации каспазы 3 - поздний событие в пути апоптоза. НЕК293-GFP клетки, а также НЕК293-GFP-CAEB клетки, выставляется ППА расщепления (Рисунок 6), указывая, что когда-то эффекторной каспазы 3, Activованные, CAEB не может предотвратить апоптоз возникновения. Взятые вместе, эти данные показывают, что CAEB действует между Bax и каспазы 3 активации.

Рисунок 1. Схема обзор тетрациклиновой регулятивной системы. Система Тет-On состоит из двух различных плазмид, нормативных и реагирования плазмид. Нормативно-плазмиды кодирует Тет-отзывчивый transsilencer (TTS; кружком) и Тет-отзывчивый обратный трансактиватор (rtTA, открытый круг). Оба белка экспрессирован под контролем сильного конститутивного, фактор элонгации 1-альфа промотор (Р EF-1a). ТТС и rtTA собой химерные транскрипционные факторы, состоящие из эукариотической транскрипции регуляторной области (глушителем или активатором, соответственно) и бактериальные тетрациклина репрессор (TetR). TetR посредником связывание ДНК до семи тет </EM> оператор (Teto) последовательности в плазмиде отклика. Teto расположен выше по течению от индуцируемого промотора цитомегаловируса минимальной (Р CMV), вместе образующие Tet-реагирующий элемент (TRE). Под неактивирующую условия, ТЦ связан с TRE предотвращения выражение. После того доксициклина (Dox; заполнено алмаз), rtTA взаимодействует с Dox приводит к конформационных изменений и активации. Активированный rtTA заменяет TTS на плазмиды отклика, что позволяет транскрипцию соответствующих целевых генов Bax и каспазы 3, что приводит к индукции апоптоза и гибели клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. Схема обзор нормативной плазмиды pWHE125. Элементы важное значение для распространения в бактерийрии, в том числе инициации репликации (Ori PBR) и антибиотик кластера резистентности против ампициллин (Amp R), и для экспрессии Tet-transregulators, таких как сильный конститутивный, немедленного раннего промотора / энхансера человеческого цитомегаловируса (P / E ЦМВ), внутренний сайт связывания рибосомы от полиомиелита-вируса (PV-IRES) и поли-сайт из обезьяньего вируса 40 (SV40 поли) отображаются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3. Схематический обзор плазмиды отклика. Элементы важное значение для распространения бактерий, в том числе инициации репликации (Ori PBR) и устойчивости к антибиотику кассеты (Amp R), и индуцибельной экспрессии у эукариот, таких как трансгена Expressiна кассете с Tet-зависимой минимального промотора TREtight (Р TREtight), представляющего интерес гена человеческого Bax (hBax) и сайта поли из обезьяний вирус 40 (SV40 поли), изображены. Кассета экспрессии трансгенов в окружении тандемных повторов прямых двух экземплярах куриного HS4 изолятор основной последовательности (основной HS4). Кроме того, сопротивление G418 кассета, состоящая из мышиного фосфоглицераткиназы 1 промоутера (Р mPGK), неомицин ген устойчивости (G418 R) и человеческого тимидинкиназы сайт поли (ТК поли) присутствует. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этот показатель.

Рисунок 4. НЕК293-GFP и НЕК293-GFP-CAEB стабильно выразить зеленые флуоресцентные белки. () Всего-клеточные лизаты HEK293-GFP иНЕК293-GFP-CAEB клетки иммуноблоттингу для GFP, чтобы показать стабильную экспрессию. (B), представитель цитометрии потока (FACS) анализ HEK293-GFP и НЕК293-GFP-CAEB клеток показано, чтобы продемонстрировать интенсивность выражения GFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5. Влияние на экспрессию GFP-CAEB на стауроспорином-индуцированного апоптоза. HEK293-GFP и НЕК293-GFP-CAEB клетки обрабатывали 4 мкМ стауроспорина в течение 6 ч, чтобы вызвать внутреннюю апоптоз. Апоптоз анализируют методом расщепленного PARP анализа иммуноблоттинга. ППА расщепление уменьшается в НЕК293-GFP-CAEB клеток по сравнению с НЕК293-GFP клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версиюиз этой фигуры.

Рисунок 6. Использование системы Титон, чтобы сузить точку действия CAEB. () Апоптоз индуцируется экспрессия Вах в HEK293-GFP и НЕК293-GFP-CAEB клеток. Апоптоз анализируют методом расщепленного PARP анализа иммуноблоттинга. PARP расщепления была снижена в НЕК293-GFP-CAEB клеток в сравнении с HEK293-GFP клеток. (Б) Апоптоз индуцировали экспрессию revCasp 3 в HEK293-GFP и НЕК293-GFP-CAEB клеток. Апоптоз анализируют методом расщепленного PARP анализа иммуноблоттинга. ППА расщепления сравнима в НЕК293-GFP-CAEB и НЕК293-GFP клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторам нечего раскрывать.