Method Article

Высокодоходные и экономически эффективной системы Выражение человека Гранзимы в клетках млекопитающих

DOI:

10.3791/52911

⸱

June 10th, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Medicine Program, Boston Children’s Hospital and Harvard Medical School, 2Department of Medicine, University of Fribourg, 3Centre Médical Universitaire, University of Geneva

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем здесь экономически эффективную систему экспрессии granzyme с использованием HEK293T клеток, которая производит высокие выходы чистой, полностью гликозилированной и ферментативно активной протеазы.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Когда цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) или естественные киллеры (NK) узнают опухолевые клетки или клетки, инфицированные внутриклеточными патогенами, они высвобождают содержимое своих цитотоксических гранул для уничтожения клеток-мишеней и внутриклеточного патогена. Гибель клеток хозяина и внутриклеточных патогенов вызывается гранулированными сериновыми протеазами, гранзимами (Gzms), доставляемыми в цитозоль клетки-хозяина с помощью белка перфорина, образующего поры (PFN), и в бактериальные патогены с помощью прокариотической мембраны, разрушающей белок гранулизин (GNLY). Для исследования молекулярных механизмов гибели клеток-мишеней, опосредованной Gzms в экспериментальных условиях in vitro, необходимы системы экспрессии и очистки белков, которые производят большое количество активных ферментов. Системы экспрессии секретируемых белков млекопитающих подразумевают потенциал для производства правильно свернутого, полностью функционального белка, который несет посттрансляционную модификацию, такую как гликозилирование. Поэтому мы использовали экономически эффективный метод осаждения кальция для транзиторной трансфекции HEK293T клеток с человеческими Gzms, клонированными в экспрессирующую плазмиду pHLsec. Выделение Gzm из надосадочной жидкости культуры достигали путем иммобилизованной аффинной хроматографии никеля с использованием С-концевой полигистидиновой метки, предоставленной вектором. Вставка энтерокиназного сайта на N-конце белка позволила получить активную протеазу, которая в конечном итоге была очищена с помощью катионообменной хроматографии. Система была протестирована путем производства высоких уровней цитотоксических человеческих Gzm A, B и M и должна быть способна производить практически все ферменты в организме человека с высокой производительностью.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В Gzms являются линейку гомологичных серинпротеаз локализованных в специализированных лизосомах CTL и NK клеток 1. Цитотоксические гранулы этих клеток-киллеров также содержат мембранные белки, разрушающие PFN и GNLY, которые выделяются одновременно с Gzms при обнаружении клетке-мишени, предназначенного для устранения 2,3. Есть пять Gzms в организме человека (GzmA, B, H, K и М) и 10 Gzms у мышей (GzmA - G, K, M и N). GzmA и GzmB являются наиболее распространенным и широко изучается в людях и мышах 1. Однако более поздние исследования начали исследовать клетки-смерти путей, а также дополнительные биологические эффекты, опосредованные другими, так называемыми сирот Gzms в здоровье и болезни 4.

Самый известный функция Gzms, в частности GzmA и GzmB, является индукция запрограммированной клеточной гибели в клетках млекопитающих при доставке в клетки-мишени с PFN 5,6. Однако, Более поздние исследования также показали, внеклеточные эффекты Gzms с глубоким воздействием на иммунную регулирования и воспаления, независимо от цитозольной доставки по PFN 7,8. Спектр клеток, которые убивают эффективно после вступления в цитозоле из Gzms был недавно расширен из клеток млекопитающих к бактериям 9,10 и даже некоторых паразитов 11. Эти недавние открытия открыли совершенно новую область для GZM исследователей. Таким образом, экономически эффективной, высокой текучести система экспрессии млекопитающих значительно облегчить путь для тех будущих исследований.

Родные человека, мыши и крысы Gzms успешно очищают от фракции гранул из CTL и NK клеток линий 12-14. Тем не менее, в наших руках выход из таких приемов очистки находится в диапазоне от менее чем 0,1 мг / л клеточной культуры (неопубликованной наблюдения и 12). Кроме того, хроматографический разрешение одной GZM без загрязнения флористикуR Gzms и / или белки, которые также присутствуют в гранулах является сложной задачей (неопубликованные данные и 12,14). Рекомбинантные Gzms были произведены в 15 бактерий, дрожжей, 16 клеток насекомых 17 и в даже в клетках млекопитающих, таких как НЕК 293 18,19. Только млекопитающих системы экспрессии несут потенциал для производства рекомбинантных ферментов с пост-трансляционных модификаций, идентичных родной цитотоксического белка. Посттрансляционных модификаций были вовлечены с конкретным поглощением эндоцитоза и внутриклеточной локализации протеазы в клетках-мишенях 20-22. Таким образом, с помощью pHLsec 23 (вид подарок Раду Aricescu и Ивонн Джонс Оксфордского университета, Великобритания) в качестве плазмиды для экспрессии позвоночника GZM, мы создали простую, времени и экономичное систему производства белка с высоким выходом в HEK293T клетки. pHLsec сочетает в себе ЦМВ усилитель с куриным Β-актина; Все вместе эти элементы ДЕМОНСТРАТед сильный промотор деятельность в различных клеточных линиях 24. Кроме того, плазмида содержит кролика Β-глобина интрон, оптимизированные Козак и сигналы секреции, а Lys-6xHis-тег и поли-сигнала. Вставки могут быть клонированы удобно между сигналом секреции и Lys-6xHis-тега (рис 1) обеспечение оптимальной экспрессии и секреции эффективности для белков, лишенных соответствующие N-концевые домены. Для экспрессии Gzms, мы заменили эндогенного последовательность секреции сигнала с сигналом секреции, предоставленной вектора с последующим энтерокиназа (ЕК) на сайте (DDDDK), так что лечение ЕК активировала выделяемые Gzms (активные Gzms начать с N-терминал аминокислотная последовательность IIGG 25). Кроме того, в пользу для этого метода HEK293T клетки быстро растут в цене низкой среде, такой как модифицированной Игла среде Игла (DMEM), и хорошо подходит для экономичного кальция фосфата методом трансфекции.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Производство плазмиды экспрессии pHLsec-GZM

  1. Подготовка общей РНК из человеческих клеток NK (первичные клетки, полученные, как в 26 или клеточной линии NK NK-92, экспрессирующих все пять человека Gzms) с использованием подходящего способа выделения РНК и обратной Расшифруйте использованием первого набора нитей-кДНК синтезировать следующие за manufacturer` S рекомендации. Amplify GZM кДНК с использованием ПЦР и клон в pHLsec, как описано в 23 (вида дар Раду Aricescu и Ивонн Джонс Оксфордского университета, Великобритания), используя сайты AgeI и KpnI (рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте следующие праймеры, указанные в таблице 1.
  2. Подтверждение правильности вставки путем секвенирования. Развернуть экспрессии плазмиды в DH5 & alpha клеток и очистить с использованием набора изоляции плазмиды эндотоксина и следуйте инструкциям изготовителя.
  3. Ресуспендируют очищенные плазмиды в эндотоксинов стерильной воде, при концентрации 2 мг / мл и хранят при -20 ° C Unti• использование.

2. Выражение Gzms в клетках HEK293T

  1. Приготовление реагентов
    1. Приготовьте стандартную культуральную среду. Чтобы Игла в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей высоким содержанием глюкозы (25 мм), GlutaMAX (4 мм), пируват натрия (1 мМ) добавляют 10% от стандартной фетальной телячьей сыворотки (FCS), пенициллин (100 единиц / мл), стрептомицин ( 100 мкг / мл).
    2. Подготовка трансфекции среду. Для культуральной среде без пенициллина-стрептомицина добавить 25 мкг / мл хлорохина (добавить свежий в день трансфекции с 1,000x запасов в PBS, хранили при -20 ° C).
    3. Подготовьте бессывороточной культуральной среды: К бессывороточной среде для НЕК293 добавить глутамина (4 мм), пенициллин (100 единиц / мл), стрептомицин (100 мкг / мл), и 2,5 мг / л амфотерицин В.
    4. Подготовка растворов, описанных в таблице 2 и фильтр с размером пор 0,45 мкм фильтр перед использованием:
  2. Расширение клетки HEK293T
    1. Растут HEK293T клеток в 20 мл культаЮр средней используя 150 х 25 мм культуры тканей блюда.
    2. Разбить ячейки на 80% слияния (сплит-соотношении 1: 4, как правило, каждый 3-й день). Клетки свободно закрепить, они могут быть механически снимается без трипсинизации по строго пипетки вверх и вниз.
    3. Пластина клеток ночь до трансфекции, чтобы дать 60-70% слияния в день трансфекции (посев плотности ~ 2 х 10 5 клеток / мл). Обычный размер подготовка состоит из 20 до 25 чашек для культивирования.
  3. Кальций-фосфатный трансфекции
    1. 1 ч до трансфекции, изменение стандартного культуральной среде до 20 мл трансфекции среду. Ближе к концу этого 1 ч инкубации шаг, смешать 400 мкг плазмидной ДНК с 10,95 мл DDH 2 0 и 1,55 мл 2М CaCl 2 в 50 мл пробирки (1 пробирка / 5 блюд).
    2. От 1 до 2 мин до трансфекции добавляют 12,5 мл 2x HBS с 12,5 мл раствора ДНК-кальций, смешать с инверсией трубок и инкубировать в течение 30 сек при комнатной температуре.
    3. Добавить ее смесь, полученную в 2.3.2 непосредственно к клеткам (5 мл на чашку), по каплям в среду. Опрыскивание равномерно по всей площади, превращая среды в слегка оранжевого цвета.
    4. Инкубируйте чашки для культивирования в течение от 7 до 11 ч в инкубаторе тканевых культур (37 ° С, 5% СО 2 в увлажненном воздухе). После инкубации в порядке осадок видна. Удалить трансфекции среду, затем тщательно промыть подогретого PBS и добавляют 20 мл бессывороточной культуральной среде, приготовленной в 2.1.3. Инкубируют в течение 72 ч в инкубаторе тканевых культур.
    5. Анализ трансфекции и экспрессии эффективность путем запуска образца (~ 20 мкл) клеточной надосадочной на SDS-PAGE и окрашивания кумасси бриллиантовым синим визуализировать гранзим группу.
  4. Очистка Gzms из супернатанта культуры с помощью никель-IMAC
    1. После инкубации переливать супернатантах клеточных культур в 250 мл пробирки и ясно, центрифугированием. Провести первый спин (400 мкг, 10 мин, 4 °С), что очистит среды из отдельных клеток. Перенести супернатант в свежих 250 мл пробирки и спина при 4000 мкг, 30 мин при 4 ° С для удаления остатков мусора клеток.
    2. Добавьте 5 мл 5 М NaCl, 6,25 мл 2 М Трис-основание (рН 8) и 1 мл 0,25 М NiSO 4 на 250 мл очищенной надосадочной жидкости. Фильтр супернатант использованием 500 мл вакуум-фильтра блока (0,45 мм).
    3. Равновесие столбец никель-IMAC с Его связывание буфера А (10 объемов колонки, CV), используя подходящую систему FPLC.
    4. Применение очищенную надосадочную жидкость в уравновешенную колонку при скорости потока 0,5 мл / мин при 4 ° С.
    5. После супернатант наносили, колонки промыть Его-связывающем буфере до тех пор, УФ-поглощение базовая линия не будет достигнута (обычно 10 CV).
    6. Элюции Gzms с линейной 20 мл градиента (от 0 до 250 мМ имидазола) при скорости потока 0,5 мл / мин, собирая 2 мл-вые фракции. Анализируют элюированных фракций в ДСН-ПААГ и окрашивания Кумасси.
  5. Энтерокиназой (ЕК)обработку и окончательное очистки катионообменной хроматографией
    1. Бассейн GZM фракции, содержащие в диализа трубки с ≤10 MWCO. Хранить небольшой образец при -20 ° С в качестве контроля предварительно EK.
    2. Добавить EK на 0,02 единицы / 50 мл исходного супернатанта непосредственно к объединенной фракции в диализной трубке и диализ O / N (по крайней мере, 16 ч) при комнатной температуре в EK-буфера (4 л, изменения буфера один раз).
    3. На следующий день, анализировать EK обрабатывают Gzms по сравнению с предварительной EK контроля в ДСН-ПААГ и окрашивания Кумасси.
    4. Если N-концевого обработка завершена, изменить буфера для диализа в буфер А S (4 л) и диализ еще в течение 4 ч при комнатной температуре. Фильтр диализирующего (0,45 мкм).
    5. Равновесие в S-колонку с S буфером А. загрузить образец в колонку с расходом 0,5 мл / мин при 4 ° С.
    6. После загрузки образца, колонку промывают буфером А S до УФ-поглощение базовая линия не будет достигнута (около 10 CV). Элюируйте Gzms с 30 мл линейным градиентом (от 150 до 1000 мм NaCl). GzmA электроннойлютни на ~ 650 мм NaCl, GzmB на ~ 700 мм NaCl и GzmM на ~ 750 мм NaCl.
    7. Анализ элюированных фракций в ДСН-ПААГ и колориметрических анализов (см ниже). Фракции, содержащие бассейн Gzms и концентрат (около 30 раз, до концентрации приблизительно 100 мкМ) в спиновых фильтров (15 мл, 10 MWCO). Алиготе концентрированные препараты GZM и хранить при температуре -80 ° C.

3. Тестирование GZM деятельность

  1. Приготовление реагентов
    1. Подготовка колориметрического буфера для анализа: 50 мМ Трис-основание, рН 7.
      1. Для измерения GzmA, добавить Na-CBZ-L-лизин thiobenzyl эфир (S-Bzl) (BLT) в буфере для анализа до конечной концентрации 0,2 мМ и 5,5'-дитио-бис (2-нитробензойной кислоты) (ДТНБ) до концентрации 0,22 мМ. Для GzmB, включают в себя 0,2 мм Вос-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) и 0,22 мм DTNB. Для GzmM, включают 0,2 мм SUC-Ala-Ala-Pro-Leu-п-нитроанилид (PNA) (AAPL). Синтетические пептиды добавлены из соответствующих растворов (в ДМСО, Storред при -20 ° C) в буфер свеже перед анализом.
    2. Подготовьте расщепления буфере для анализа: 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-Base, рН 7,5
  2. Колориметрические анализы
    1. Распространение небольших образцов GZM (<5 мкл) из элюированных фракций или концентрированные запасы в 96-луночные плоскодонные пластин. Включите положительный контроль (тестируемых препаратов GZM или сырой клеточных лизатов NK) и отрицательный контроль (только буфер).
    2. Добавить 100 мкл буфера для анализа в каждую лунку (с помощью пипетки многоканальный). Инкубируют в течение 10 мин при 37 ° С. Измерение оптической плотности при 405 нм в микропланшет-ридера.
  3. Расщепление анализ
    1. Для расщепления анализов с использованием очищенных подложек, совместно инкубировать белкового субстрата (нативный или рекомбинантный, 100 - 400 нм; несколько примеров эффективных субстратов GZM представлены в разделе результатов и в записке в конце этого раздела) с серийными разведениями из GZM (начиная с 400 нМ) в буфере для анализа в течение различного времени.Анализ с помощью ДСН-ПААГ и Кумасси или окрашиванием серебром; или с помощью Вестерн-блоттинга с использованием специфических антител.
    2. Для отщепления анализов с использованием клеточных лизатов, приостановить 10 6 клеток HeLa (или любой доступный линии опухолевых клеток) в 1 мл буфера для анализа и лизировать путем замораживания в смеси этанол / сухой лед и оттаивания при 37 ° С в три раза. Удалить клеточного дебриса путем центрифугирования (15000 х г в течение 10 мин при 4 ° С).
    3. Совместное инкубирование очищенного лизата с Gzms при различных концентрациях и времени, как описано выше. Расщепление обнаружен с помощью иммуноблоттинга, используя подходящие антитела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько примеров добросовестных субстратов, для которых коммерческие антитела имеются: Ставка (ВН3 взаимодействующих смерти домена агонист) и каспазы 3 расщепляется GzmB 27,28; несколько гетерогенных ядерных рибонуклеопротеиды (hnRNPA1, А2 и U) расщепляется GzmA 29; цитомегаловирус фосфопротеин 71 по 30 GzmM.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В следующем разделе мы представим полную документацию препарата GzmA осветить метод. Мы также успешно очищают GzmB и GzmM, аналогичных результатов в отношении эффективности очистки и деятельности. Тем не менее, из этих более поздних препаратов мы покажем только несколько выбранных частей данных. GzmB препараты из клеток 293Т следующие текущего протокола были использованы в нескольких опубликованных исследований, подчеркивая свою деятельность в различных биологических системах анализа 9,29,31-34.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Классической и широко изучается роль GzmA и GzmB является индукция апоптоза в клетках млекопитающих после их доставки по цитозольном порообразующего белка PFN 1. Недавно цитотоксический спектр Gzms была существенно расширена из клеток млекопитающих к бактериям 9,10, а также в некоторых паразитов 11. Кроме того, неклассические, внеклеточные функции GzmA и GzmB а также биологическое значение различных сирот Gzms еще неясным. Таким образом, надежная времени и экономически эффективным экспре...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами от Фонда медико-биологических исследований Novartis и от Исследовательского пула Университета Фрибурга (до MW). Мы благодарим Ли Чжао, Чжань Сюй и Соланж Харуби Хесс за техническую поддержку, а также Раду Арисеску и Ивонн Джонс (Оксфордский университет, Великобритания) за предоставление плазмиды pHLsec и Томаса Шюрпфа (Гарвардская медицинская школа) за полезные дискуссии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
TRIzol РеагентInvitrogen15596-026Набор для выделения общей РНК
SuperScript II Обратная транскриптазаInvitrogen18064-014
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseNEBM0530L
EndoFree Plasmid Maxi KitQIAGEN12362
EX-CELL 293 Бессывороточная среда для клеток HEK 293Sigma14571C
DMEM, высокий уровень глюкозы, добавка GlutaMAX, пируватGibco31966-021
Трубка для диализа SnakeSkin, 10K MWCOThermo Scientific68100
Энтерокиназа из бычьего кишечникаSigmaE4906рекомбинантная, > 20  ед/мг белок
HisTrap Excel 5 мл колонкаGE Healthcare17-3712-06 Никель IMAC
HiTrap SP HP 5 мл колонкаGE Healthcare17-1152-01 Столбец S
N-α-Cbz-L-лизин тиобензилестер (BLT)SigmaC3647GzmA субстрат
Boc-Ala-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD)MP Biomedicals2193608 _10mgсубстрат GzmB
Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL)BachemGzmM субстрат
5,5′-дитио-бис (2-нитробензойная кислота) (DTNB)SigmaD8130реагент Эллмана

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chowdhury, D., Lieberman, J. Death by a thousand cuts: granzyme pathways of programmed cell death. Annu Rev Immunol. 26, 389-420 (2008).
  2. Thiery, J., Lieberman, J. Perforin: a key pore-forming protein for immune control of viruses and cancer. Subcell Biochem. 80, 197-220 (2014).
  3. Krensky, A. M., Clayberger, C. Biology and clinical relevance of granulysin. Tissue Antigens. 73, 193-198 (2009).
  4. Bovenschen, N., Kummer, J. A. Orphan granzymes find a home. Immunol Rev. 235, 117-127 (2010).
  5. Lieberman, J. Granzyme A activates another way to die. Immunol Rev. 235, 93-104 (2010).
  6. Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. A quarter century of granzymes. Cell death and differentiation. 19, 28-35 (2012).
  7. Hiebert, P. R., Granville, D. J. Granzyme B in injury, inflammation, and repair. Trends Mol Med. 18, 732-741 (2012).
  8. Afonina, I. S., Cullen, S. P., Martin, S. J. Cytotoxic and non-cytotoxic roles of the CTL/NK protease granzyme. B. Immunol Rev. 235, 105-116 (2010).
  9. Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157, 1309-1323 (2014).
  10. Lee, W. Y., et al. Invariant natural killer T cells act as an extravascular cytotoxic barrier for joint-invading Lyme Borrelia. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
  11. Kapelski, S., de Almeida, M., Fischer, R., Barth, S., Fendel, R. Antimalarial activity of granzyme B and its targeted delivery by a granzyme B-scFv fusion protein. Antimicrob Agents Chemother. , (2014).
  12. Thiery, J., Walch, M., Jensen, D. K., Martinvalet, D., Lieberman, J. Isolation of cytotoxic T cell and NK granules and purification of their effector proteins. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit3 37), (2010).
  13. Shi, L., Yang, X., Froelich, C. J., Greenberg, A. H. Purification and use of granzyme B. Methods Enzymol. 322, 125-143 (2000).
  14. Masson, D., Tschopp, J. A family of serine esterases in lytic granules of cytolytic T lymphocytes. Cell. 49, 679-685 (1987).
  15. Lorentsen, R. H., Fynbo, C. H., Thogersen, H. C., Etzerodt, M., Holtet, T. L. Expression, refolding, and purification of recombinant human granzyme B. Protein Expr Purif. 39, 18-26 (2005).
  16. Sun, J., et al. Expression and purification of recombinant human granzyme B from Pichia pastoris. Biochem Biophys Res Commun. 261, 251-255 (1999).
  17. Xia, Z., et al. Expression and purification of enzymatically active recombinant granzyme B in a baculovirus system. Biochem Biophys Res Commun. 243, 384-389 (1998).
  18. Stahnke, B., et al. Granzyme B-H22(scFv), a human immunotoxin targeting CD64 in acute myeloid leukemia of monocytic subtypes. Mol Cancer Ther. 7, 2924-2932 (2008).
  19. Gehrmann, M., et al. A novel expression and purification system for the production of enzymatic and biologically active human granzyme. B. J Immunol Methods. 371, 8-17 (2011).
  20. Metkar, S. S., et al. Cytotoxic cell granule-mediated apoptosis: perforin delivers granzyme B-serglycin complexes into target cells without plasma membrane pore formation. Immunity. 16, 417-428 (2002).
  21. Motyka, B., et al. Mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor is a death receptor for granzyme B during cytotoxic T cell-induced apoptosis. Cell. 103, 491-500 (2000).
  22. Pinkoski, M. J., et al. Entry and trafficking of granzyme B in target cells during granzyme B-perforin-mediated apoptosis. Blood. 92, 1044-1054 (1998).
  23. Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
  24. Fukuchi, K., et al. Activity assays of nine heterogeneous promoters in neural and other cultured cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30 A, 300-305 (1994).
  25. Tran, T. V., Ellis, K. A., Kam, C. M., Hudig, D., Powers, J. C. Dipeptidyl peptidase I: importance of progranzyme activation sequences, other dipeptide sequences, and the N-terminal amino group of synthetic substrates for enzyme activity. Arch Biochem Biophys. 403, 160-170 (2002).
  26. Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  27. Barry, M., et al. Granzyme B short-circuits the need for caspase 8 activity during granule-mediated cytotoxic T-lymphocyte killing by directly cleaving Bid. Mol Cell Biol. 20, 3781-3794 (2000).
  28. Darmon, A. J., Nicholson, D. W., Bleackley, R. C. Activation of the apoptotic protease CPP32 by cytotoxic T-cell-derived granzyme B. Nature. 377, 446-448 (1995).
  29. Rajani, D. K., Walch, M., Martinvalet, D., Thomas, M. P., Lieberman, J. Alterations in RNA processing during immune-mediated programmed cell death. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8688-8693 (2012).
  30. Domselaar, R., et al. Noncytotoxic inhibition of cytomegalovirus replication through NK cell protease granzyme M-mediated cleavage of viral phosphoprotein 71. J Immunol. 185, 7605-7613 (2010).
  31. Thiery, J., et al. Perforin activates clathrin- and dynamin-dependent endocytosis, which is required for plasma membrane repair and delivery of granzyme B for granzyme-mediated apoptosis. Blood. 115, 1582-1593 (2010).
  32. Thiery, J., et al. Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells. Nat Immunol. 12, 770-777 (2011).
  33. Thomas, M. P., et al. Leukocyte protease binding to nucleic acids promotes nuclear localization and cleavage of nucleic acid binding proteins. J Immunol. 192, 5390-5397 (2014).
  34. Jacquemin, G., et al. Granzyme B-induced mitochondrial ROS are required for apoptosis. Cell death and differentiation. , (2014).
  35. Kummer, J. A., Kamp, A. M., Citarella, F., Horrevoets, A. J., Hack, C. E. Expression of human recombinant granzyme A zymogen and its activation by the cysteine proteinase cathepsin C. The Journal of biological chemistry. 271, 9281-9286 (1996).
  36. Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A colorimetric assay that specifically measures Granzyme B proteolytic activity: hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. Journal of visualized experiments : JoVE. , e52419(2014).
  37. Huang, M. T., Gorman, C. M. Intervening sequences increase efficiency of RNA 3' processing and accumulation of cytoplasmic RNA. Nucleic Acids Res. 18, 937-947 (1990).
  38. Luthman, H., Magnusson, G. High efficiency polyoma DNA transfection of chloroquine treated cells. Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308 (1983).
  39. Magee, A. I., Grant, D. A., Hermon-Taylor, J., Offord, R. E. Specific one-stage method for assay of enterokinase activity by release of radiolabelled activation peptides from alpha-N-[3H]acetyl-trypsinogen and the effect of calcium ions on the enzyme activity. Biochem J. 197, 239-244 (1981).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Granzyme ExpressionMammalian Cell TransfectionCalcium Phosphate MethodImmobilized Metal Affinity ChromatographyCation Exchange ChromatographyEnterokinase ActivationHEK293T CellsProtein PurificationEnzymatic Activity AssayGlycosylated Protease

Related Articles