Нейтрофилы играют важную роль не только в защите хозяина от вторжения микроорганизмов, но и участвуют в иммунном надзоре за опухолевыми клетками. В данной статье описаны методы, связанные с выделением нейтрофилов с противоопухолевыми свойствами, и методы мониторинга противоопухолевой функции нейтрофилов in vitro и in vivo.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение и характеристика нейтрофилов с Противоопухолевые свойства
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Нейтрофилы, наиболее распространенным из всех белых кровяных клеток в кровотоке человека, играют важную роль в защите хозяина против вторжения микроорганизмов. Кроме того, нейтрофилы играют центральную роль в иммунной наблюдения опухолевых клеток. Они обладают способностью распознавать опухолевые клетки и индуцировать гибель клеток опухоли или через контакт-зависимого механизма клеток с участием перекиси водорода или через антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC). Нейтрофилы с противоопухолевой активностью, могут быть выделены из периферической крови больных раком и опухоли мышей. Эти нейтрофилы называются опухолевых захваченных нейтрофилов (ДЕСЯТЬ), чтобы отличить их от нейтрофилов здоровых субъектов или наивного мышей, которые не показывают никакого существенного опухоли цитотоксическую активность. По сравнению с другими лейкоцитов, нейтрофилов показывают другую плавучесть делает возможным получение> 98% населения чистый нейтрофилов при воздействии на градиенте плотности. Однако, в дополнениек нормальной высокой плотности нейтрофилов населения (ГДН), у больных раком, в опухоли мышей, а также при хронических воспалительных состояний, отдельные популяции низкой плотности нейтрофилов (LDN) появляются в обращении. LDN совместно очищают с мононуклеарных фракции и может быть отделена от мононуклеарных клеток, используя положительный или отрицательный алгоритмов выбора. После того, как чистота выделенных нейтрофилов определяется с помощью проточной цитометрии, они могут быть использованы для ин витро и ин виво функциональных анализов. Мы опишем методы для мониторинга противоопухолевую активность нейтрофилов, их способность мигрировать и продуцировать активные формы кислорода, а также мониторинг их фагоцитарную способность экс VIVO. Мы также описать методы, чтобы пометить нейтрофилов для отслеживания в естественных условиях, и определить их антиметастатическую потенциала в естественных условиях. Все эти методы имеют важное значение для понимания того, как получить и охарактеризовать нейтрофилов с анти-опухолифункция.
Введение
Нейтрофилы вначале были охарактеризованы как врожденных иммунных клеток, которые служат в качестве первого линия обороны против вторжения микроорганизмов. Сегодня известно, что нейтрофилы имеют более далеко идущие функции, будучи вовлеченным в монтаже адаптивного иммунного ответа против чужеродных антигенов 1,2, регулирующих кроветворение 3, 4 и ангиогенез ранозаживляющее 5. Кроме того, нейтрофилы могут повлиять на рост опухоли и метастазов прогрессирование в силу своих сторонников и противоопухолевых деятельности 6,7. Нейтрофилы характеризуются полиморфной сегментированные ядра (следовательно, называют полиморфно (PMN лейк....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Животные: 5-7 недель BALB / C мышей приобрести Харлан (Израиль). Все эксперименты с участием животных были одобрены Институциональные уходу и использованию комитета животных Еврейского университета (IACUC) по. Человека образцы: Коллекция крови от пациентов рака и здоровых добровольцев было одобрено Медицинский центр Хадасса Institutional Review Board (IRB).
1. Индукционная нейтрофилов с анти-опухолевых Недвижимость в естественных условиях, используя рака молочной железы мыши Модель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги должны быть выполнены с использованием стерильных растворов в ламинарный воздушный поток шкафа (LAF) ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В недавнем исследовании мы определили антиметастатическую функцию нейтрофилов 6. Нейтрофилы от опухоли мышей приобрести фенотип цитотоксическое и имеют потенциал, чтобы убить опухолевые клетки 6. Это в отличие от нейтрофилов из наивного мышей, которые не имеют существенного влияния анти-опухоли 6. Несколько из методов, описанных в разделе протокола были использованы для изучения функции нейтрофилов противоопухолевую в пробирке и в естественных условиях 6.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Нейтрофилы являются наиболее распространенными из всех белых кровяных клеток и первыми отвечают в случаях инфекции и воспаления. Как таковые, они очень чувствительны к внешним сигналам и легко активированы. Кроме того, нейтрофилы имеют очень короткий период полураспада и быстрый оборот. Вместе, эти характеристики вызывают ряд трудностей в работе с нейтрофилов, таких, что уникальные экспериментальные стратегии требуется. Например, есть несколько нейтрофилов стратегии очистки, каждый со своими плюсами и минусами.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
З. поддерживается грантами от I-CORE программу Израиля научного фонда (грант № 41/11), Abisch-Френкеля Фонд Rosetrees Доверие, Фонд исследований рака Израиль (ICRF - Исследование Карьера премии развития) и КОНЦЕРН фундамент. ZGF поддерживается грантами от Cancer Research Foundation Израиля (ICRF - Исследование Карьера Award развития), главный научный сотрудник Израильского Министерства здравоохранения и Израильской ассоциации легких.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ | |||
| Мышь 4T1 клетки карциномы молочной железы | ADCC | CRL-2539 | Питательная среда: DMEM + 10 % термоинактивированные FBS |
| ПЛАСТИКОВЫЕ ИЗДЕЛИЯ И ОБОРУДОВАНИЕ | |||
| 24-луночный планшет для культуры тканей | Falcon | 353047 | Стерильный |
| планшет для культуры тканей 100 мм | Corning | 430167 | Стерильный |
| 25 см<суп>2 Колба для культуры тканей | Nunc | 156340 | Стерильная |
| 90 мм Чашка для культуры бактерий | Miniplast, Ein Shemer, Израиль | 20090-01-017 | Стерильная |
| коническая центрифуга 15 мл Стерильная коническая центрифуга | Miniplast, Ein Shemer, Израиль | 835015-40-111 | Стерильная |
| 50 мл Стерильная коническая центрифужная пробирка | Miniplast, Эйн-Шемер, Израиль | 835050-21-111 | Стерильный |
| сокол 12 x 75 мм Полистирольная трубка с круглым дном | Becton Dickinson | 352058 | Sterile |
| Millicell 24 Migration Plate с размером пор 5&мкм; М | Merck Millipore | PSMT010R1 | Стерильный |
| белый 96-луночный планшет с плоским дном | Costar | 3917 | Стерильный |
| клеточный фильтр (40 мм) | BD Falcon | 352340 | Стерильный |
| 20G x 1.5" Игла | BD Microlance 3 | 301300 | Стерильная |
| игла 23G x 1" | BD Microlance 4 | 300800 | Стерильный |
| 25G x 5/8" Игла | BD Microlance 5 | 300600 | Стерильный |
| 0,3 мл Шприц с иглой 30Г x 8 мм | BD Micro-Fine Plus Demi | 320829 | Стерильный |
| 9 мм Зажимы | BD, AutoClip | 427631 | Стерильный |
| магнит EasySep | STEMCELL Technologies | 18000 | |
| MACS LS Разделительная колонна | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | Стерильный |
| MidiMACS Сепаратор Магнит | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Микроскоп Предметное стекло | Menzel-Glä ser Superfrost Plus Термо | J1800AMNZ | |
| орбитальный встряхиватель | Sky line, | S-3.02.10L | |
| TECAN | InfiniteF200Pro | ||
| POWDER | |||
| Бычья сыворотка альбумин (БСА), фракция V | Sigma | A7906 | |
| Бромодоксиуридин (BrdU) | BD Pharmingen | 550891 | Sterile |
| CFSE (5-(и 6-)-Карбоксифлуоресцеин диацетат, сукцинимидиловый эфир) | Молекулярные зонды | C1157 | |
| Dextan T500 | Sigma | 31392 | |
| Гепарин натриевая соль из слизистой оболочки кишечника свиньи | Sigma | H3149 | |
| Азид натрия (NaN3) | Sigma | S8032 | Высокотоксичный, обращайтесь с осторожностью |
| Порошок тиогликоллата | Difco | 225650 | |
| Zymosan A | Sigma | Z4250 | |
| МЕДИА И ДОБАВКИ | |||
| Модифицированная среда Eagle от Dulbecco (DMEM) | Sigma | D5796 | Sterile |
| Opti-MEM® Я уменьшил уровень сыворотки СМИ | Life Technologies | 31985062 | Sterile |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | Sterile |
| Foetal bovaine serum (FBS), термоинактивированная | Sigma | F9665 | Стерильная |
| L-глютамин | Biological Industries, Бет ха-Эмек, Израиль | 03-020-1A | Стерильный |
| пируват натрия | Biological Industries, Бет ха-Эмек, Израиль | 03-042-1B | Стерильный |
| пенициллин стрептомицин x 1000 раствор | Biological Industries, Бет ха-Эмек, Израиль | 03-031-5 | Стерильный |
| фосфатный буферный раствор (PBS) без Mg2+ и Ca2+ | Biological Industries, Бет ха-Эмек, Израиль | 02-023-1 | Стерильный |
| PBS x 10 без Ca2+ и Mg2+ | Biological Industries, Бет ха-Эмек, Израиль | 02-023-5A | Стерильная |
| вода класса ВЭЖХ | J.T. Baker | 4218-03 | Автоклав |
| РЕШЕНИЯ | |||
| ACK – Технологии Аммония-Хлорид-Калий | nbsp; | A10492-01 | |
| Раствор брмодеоксиуридина (BrdU) (10 мг/мл) в PBS | Растворить 10 мг BrdU в 1 мл PBS и стерильным фильтром. | ||
| CFSE, 5 мМ в ДМСО | Растворите 2,8 мг CFSE в 1 мл ДМСО. Разделите на 10 мл аликвоты в стерильных пробирках объемом 200 мл и храните в темноте при температуре -20oC. | ||
| Эозин Y раствор | Sigma | HT110-2-32 | |
| Сбалансированный раствор соли Хэнкса | Biological Industries, Бет ха-Эмек, Израиль | 02-016-1A | Стерильный |
| гепарин, 20 мг/мл в PBS | Растворить 100 мг гепарина в 5 мл стерильного PBS, и стерильный фильтр через фильтр 0,2 мм. | ||
| Histopaque-1119 | Sigma | 11191 | Стерильный фильтр через фильтр 0,2 мм. |
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | Стерильный фильтр через светофильтр 0,2 мм. |
| Буфер для лизиса клеточной культуры люциферазы x5 | Promega | E153A | развести 1:5 в стерильной воде непосредственно перед применением. |
| Раствор для анализа люциферазы | Promega | E1501 | Содержит порошок субстрата для анализа люциферазы (E151A) и буфер для анализа люциферазы (E152A) |
| Раствор гематоксилина Майера | Sigma | MHS-32 | |
| PBS + 0,5% BSA | Растворите 2,5 г BSA в 500 мл PBS, а стерильные фильтруйте через фильтр 0,2 мм. | ||
| PBS + 1% BSA | Растворите 1 г BSA в 100 мл PBS, а стерильные фильтруйте через фильтр 0,2 мм. | ||
| 5x PBS с 2,5% BSA | Растворите 12,5 г BSA в смеси 250 мл стерильной воды класса ВЭЖХ и 250 мл PBSx10, и стерильно отфильтруйте через фильтр 0,2 мм. | ||
| PBS, содержащий 0,5% BSA и 2 mM EDTA | . Растворите 250 мг BSA в 50 мл стерильного PBS и добавьте 200 мл 0,5M EDTA, pH 8,0, стерильно отфильтруйте через фильтр 0,2 мм. | ||
| Буфер FACS (PBS, содержащий 0,5% BSA, 2 мМ ЭДТА и 0,02% NaN3) | Растворите 250 мг BSA в 50 мл стерильных PBS и добавьте 200 мл 0,5M EDTA pH 8,0 и 500 мл 2% NaN3, стерильный фильтр через фильтр 0,2 мм. | ||
| Физиологический раствор (0,9% NaCl) | Растворить 9 г NaCl в 1 000 мл двт, автоклав | ||
| 0,2% раствор | Растворить 2 г NaCl в 1 000 мл двт, автоклав | ||
| 1,6% раствор | Растворить 16 г NaCl в 1 000 мл дв., автоклав | ||
| 2 % азид | Растворить 1 г азида натрия в 50 мл стерильного двт, хранить при 4<суп>оС. Высокотоксичен. | ||
| 3% раствор | Растворите 3 г порошка тиогликоллата в 100 мл дв. Кипятить до тех пор, пока раствор не станет желтым и автоклавным. | ||
| Раствор трипана синего (0,4%) | Sigma | T8154 | Разведите 1:10 в PBS для получения 0,04% раствора. |
| Раствор трипсина B | Biological Industries, Бет ха-Эмек, Израиль | 03-046-1 | Стерильный |
| 1 мг/мл Зимозан А | Ресуспендия 1 мг Зимозан А в 1 мл стерильный PBS в пробирке Эппендорфа. Энергично вдохните и инкубируйте трубку при температуре 37 oC в течение 30 минут. Не автоклавировать. Перед применением приготовьте раствор в свежем виде. | ||
| Наборы EasySep PE selection kit | STEMCELL Technologies | 18557 | |
| EasySep PE selection cocktail | STEMCELL Technologies | 18151 | |
| Магнитные наночастицы EasySep | STEMCELL Technologies | 18150 | |
| Anti-Ly6G мышь Набор микрогранул | Miltenyi Biotec | 130-092-332 | |
| EasySep Набор для обогащения нейтрофилов мышей | STEMCELL Technologies | 19762 | |
| EasySep Набор для обогащения нейтрофилов человека | STEMCELL Technologies | 19257 | |
| FITC BrdU flow kit | BD Pharmingen | ||
| MACS Набор для выделения нейтрофилов | Miltenyi Biotec | 130-097-658 | |
| Набор для анализа фагоцитоза | Кайманова химическая компания | 500290 | |
| АНТИТЕЛА | |||
| FcR, блокирующие антитела | Biolegend | 101302 | |
| Очищенное антитело к Ly6G у крыс | BD Pharmingen | 551459 | Клон 1A8 |
| PE-конъюгированного антитела крысы к мышиному антителу Ly6G | Biolegend | 127608 | Клон 1A8 |
| FITC-конъюгированный крысиный антимышиный Ly6G | BD Pharmingen | 551460 | Клон 1A8 |
| PerCP-Cy5.5 крыса антимышиный Ly6G | TONBO Biosciences | 65-1276 | Клон 1A8 |
| violetFluor 450-конъюгированный крысиный антимышиный Ly6G | TONBO Biosciences | 75-1276 | Клон 1A8 |
| FITC-конъюгированный крысиный антимышиный CD11b | BD Pharmingen | 553310 | Клон M1/70 |
| FITC-конъюгированный крысиный антимышиный Ly-6G и Ly-6C (GR-1) | BD Pharmingen | 553127 | Клон RB6-8C5 |
| ПЭ-конъюгированная крыса антимышиный CD45 | BD Pharmingen | 553081 | Клон 30-F11 |
| ФИТК-конъюгированный крысиный антимышиный F4/80 | Abcam | ab60343 | Клон BM8 |
| FITC-конъюгированная мышь античеловеческая CD66b | Biolegend | 305103 | Клон G10F5 |
| Очищенное антитело контроля изотипа крыс (IgG2a, k) | BD Pharmingen | 553927 | Клон R35-95 |
| LEAF очищенный армянский хомяк против мышиного антитела CD3e | BioLegend | 100314 | Клон 145-2C11 |
Ссылки
- Tangye, S. G., Brink, R. A helping hand from neutrophils in T cell-independent antibody responses. Nat Immunol. 13, 111-113 (2012).
- Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immun....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
