Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение и характеристика нейтрофилов с Противоопухолевые свойства

24.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52933

⸱

19 июня 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental Biology and Cancer Research, Institute for Medical Research Israel-Canada, Hebrew University Medical School, 2Institute of Pulmonary Medicine, Hadassah-Hebrew University Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Нейтрофилы играют важную роль не только в защите хозяина от вторжения микроорганизмов, но и участвуют в иммунном надзоре за опухолевыми клетками. В данной статье описаны методы, связанные с выделением нейтрофилов с противоопухолевыми свойствами, и методы мониторинга противоопухолевой функции нейтрофилов in vitro и in vivo.

Аннотация

Нейтрофилы, наиболее распространенным из всех белых кровяных клеток в кровотоке человека, играют важную роль в защите хозяина против вторжения микроорганизмов. Кроме того, нейтрофилы играют центральную роль в иммунной наблюдения опухолевых клеток. Они обладают способностью распознавать опухолевые клетки и индуцировать гибель клеток опухоли или через контакт-зависимого механизма клеток с участием перекиси водорода или через антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC). Нейтрофилы с противоопухолевой активностью, могут быть выделены из периферической крови больных раком и опухоли мышей. Эти нейтрофилы называются опухолевых захваченных нейтрофилов (ДЕСЯТЬ), чтобы отличить их от нейтрофилов здоровых субъектов или наивного мышей, которые не показывают никакого существенного опухоли цитотоксическую активность. По сравнению с другими лейкоцитов, нейтрофилов показывают другую плавучесть делает возможным получение> 98% населения чистый нейтрофилов при воздействии на градиенте плотности. Однако, в дополнениек нормальной высокой плотности нейтрофилов населения (ГДН), у больных раком, в опухоли мышей, а также при хронических воспалительных состояний, отдельные популяции низкой плотности нейтрофилов (LDN) появляются в обращении. LDN совместно очищают с мононуклеарных фракции и может быть отделена от мононуклеарных клеток, используя положительный или отрицательный алгоритмов выбора. После того, как чистота выделенных нейтрофилов определяется с помощью проточной цитометрии, они могут быть использованы для ин витро и ин виво функциональных анализов. Мы опишем методы для мониторинга противоопухолевую активность нейтрофилов, их способность мигрировать и продуцировать активные формы кислорода, а также мониторинг их фагоцитарную способность экс VIVO. Мы также описать методы, чтобы пометить нейтрофилов для отслеживания в естественных условиях, и определить их антиметастатическую потенциала в естественных условиях. Все эти методы имеют важное значение для понимания того, как получить и охарактеризовать нейтрофилов с анти-опухолифункция.

Введение

Нейтрофилы вначале были охарактеризованы как врожденных иммунных клеток, которые служат в качестве первого линия обороны против вторжения микроорганизмов. Сегодня известно, что нейтрофилы имеют более далеко идущие функции, будучи вовлеченным в монтаже адаптивного иммунного ответа против чужеродных антигенов 1,2, регулирующих кроветворение 3, 4 и ангиогенез ранозаживляющее 5. Кроме того, нейтрофилы могут повлиять на рост опухоли и метастазов прогрессирование в силу своих сторонников и противоопухолевых деятельности 6,7. Нейтрофилы характеризуются полиморфной сегментированные ядра (следовательно, называют полиморфно (PMN лейкоцитов)) и содержат по крайней мере три различных подклассов гранул, а также секреторные везикулы 8 (1А-C).

Нейтрофилы обладают высокой фагоцитарной способности и высокой активности НАДФН-оксидазы критической для устранения микробной и секретируют широкий спектр важных хемокинов, по крайнейтяги дополнительных нейтрофилов и других иммунных клеток к месту воспаления 8,9. Нейтрофилы характеризуются экспрессии большого количества поверхностных рецепторов, включая Toll-подобных рецепторов (TLR,), С-типа рецепторов лектинов (Clrs), дополняют рецептор 3 (CD11b / CD18) и другие адгезивные молекулы (например, L-селектина, LFA-1, VLA-4 и карциноэмбриональный антиген-связанных молекулы клеточной адгезии 3 (CEACAM3 / CD66b)), рецепторы хемокинов (например, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), хемоаттрактант рецепторы (например, PAFR, LTB 4 R и C5aR) , рецепторов цитокинов (например, G-ЧСФР, ИЛ-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, ФНО), формил-пептид рецепторов (например, FPR1-3), и Fc рецепторы (например, CD16 (FcγRIII ), CD32 (FcγRII) и CD64 (FcγRI) 10. У мышей, нейтрофилов, как правило, определены как CD11b + Ly6G +, тогда как нейтрофилы человека, идентифицируют с использованием лейкоцитов маркеры CD11b, CD15, CD16 и CD66b, Также общепринятым для окрашивания для миелопероксидазы белков гранул (МРО) и эластазы нейтрофилов (NE) для обнаружения нейтрофилов в тканях.

Он по-прежнему неясно, будет ли разнообразные функции нейтрофилов при посредничестве той же клетке или отдельных клеток субпопуляций. Накопление данные позволяют предположить, на наличие гетерогенной популяции нейтрофилов, который проявляет высокую степень пластичности, пострадавших от провоспалительных стимулов и микросреды 11,12. Фридлендер и др. 13 грубо разделить нейтрофилов в рак в двух основных групп населения называют N1 с противоопухолевыми свойствами и N2 со свойствами про-опухолей. При раке, а также при хроническом воспалении, имеется дополнительный субпопуляция состоит из гранулоцитарного миелоидных полученных клеток-супрессоров (G-MDSCs), которые подавляют Т-клеточные ответы 14. G-MDSCs считаются незрелые миелоидные клетки характеризуются CD11b + Ly6Cнизкий Ly6G привет фенотип у мышей 15, имея CD15 + CD16 / низкий фенотип человека 16. Г-MDSCs выразить более высокие уровни аргиназой и миелопероксидазы, а более низкие уровни цитокинов и хемокинов, чем нормальных циркулирующих нейтрофилов. Они меньше фагоцитарной и миграционной, но дают более высокие уровни АФК 15,17,18. В настоящей работе мы опишем некоторые основные методики выделения и характеристики нейтрофилов с противоопухолевыми свойствами.

В то время как нейтрофилы составляют самое многочисленное население всех белых кровяных клеток в кровотоке человека (45 - 70%; 1800 - 6000 / мкл), у мышей, при нормальных условиях, они довольно редкие (10 - 15%; 300 - 500 / мкл ). Число нейтрофилов увеличивается неуклонно Upon воспаления, а иногда и в рак, который представляет собой состояние хронического воспаления 7. Нейтрофилы развиваются из общего миелоидного мультипотентны предшественника (CMP) CEзаполняет в костном мозге, с помощью процесса, дифференциации, проходящие этапы миелобласты (МБ), промиелоциты (ТЧ), миелоциты (MC), метамиелоцитов (мм) и диапазона ячеек (BC) 8. Зрелые, постмитотические нейтрофилы могут оставаться в костном мозге в течение 4 - 7 дней, прежде чем они будут освобождены в обращении 8. Оборот нейтрофилов в крови, как правило, быстрое со средним периодом полураспада 6 - 12 часов, который может быть продлен при воспалительных процессах. Нестимулированные нейтрофилы имеют ограниченный анти-онкогенного активности, особенность, которая может быть приобретена подвергая наивные нейтрофилов к хемокинов IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 и CXCL5 6,19 или искусственно, подвергая их к форбол эфира форбол 12 -myristate 13-ацетата (РМА) 6.

Короткий период полувыведения из крови нейтрофилов вместе с низким числом нейтрофилов (~ 3 - 5 х 10 5) достигается с 1 мл крови наивного 6 - 8 недель старой мыши, сделали этотрудно исследовать функцию циркулирующих нейтрофилов мыши в пробирке. Чтобы преодолеть эту трудность, другие источники были использованы. Например, большое число нейтрофилов, могут быть получены из костного мозга 20 или брюшины после индукции стерильного воспаления (например, после внутрибрюшинного введения тиогликолевой бульон или Зимозан А). Следует отметить, что нейтрофилы, полученные из брюшной полости не оказывает какого-либо анти-онкогенного активностью (неопубликованное наблюдение).

. Granot др 6 отмечено, что линии BALB / C мышей, инокулированных ортотопически с помощью мыши 4T1 молочной клеточной линии карциномы разработки нейтрофилию что усугубляет прогрессированию опухоли 6 (Фигура 2А), так что 20 - 40 миллионов нейтрофилов крови можно легко выделить из 1 мл крови 3 - 4 недели после прививки опухоли. Эти нейтрофилы приобрели противоопухолевой активностью, и, соответственно, был ИСПNED опухолевые захваченных нейтрофилы (ДЕСЯТЬ), для того, чтобы отличить их от наивных нейтрофилов 6 (рис 2b). В то время как нейтрофилы высокой плотности (СЗР, 1А) обладают высокой анти-онкогенными, нейтрофилы низкой плотности (LDN, рис 1б), генерируемые в контексте рака не 21. Кроме того, высокой плотности нейтрофилы из костного мозга и селезенки мышей с опухолями имеют противоопухолевую активность (неопубликованные данные). Следует отметить, что прогрессированию опухоли селезенки становится постепенно увеличена (спленомегалия), с увеличением количества нейтрофилов.

Следует отметить, что десять также генерируются в других моделях рака, включая как спонтанных (MMTV-PyMT и MMTV-Wnt1 опухолей молочной железы и K-Ras приводом опухолей легких) и вводили (АТ-3 (MMTV-PyMT) и E0771 карциномы молочной железы клетки, ООО карциномы легкого Льюиса клетки и В16-F10, клетки меланомы). Тем не менее, степень мобилизации нейтрофилов в этих свою очередьили модели гораздо меньше, чем от 4T1-инокулированных мышей, достигая 5 - 10 х 10 6 нейтрофилы в 1 мл крови через 3 недели.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Животные: 5-7 недель BALB / C мышей приобрести Харлан (Израиль). Все эксперименты с участием животных были одобрены Институциональные уходу и использованию комитета животных Еврейского университета (IACUC) по. Человека образцы: Коллекция крови от пациентов рака и здоровых добровольцев было одобрено Медицинский центр Хадасса Institutional Review Board (IRB).

1. Индукционная нейтрофилов с анти-опухолевых Недвижимость в естественных условиях, используя рака молочной железы мыши Модель.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги должны быть выполнены с использованием стерильных растворов в ламинарный воздушный поток шкафа (LAF) Био-безопасности.

  1. Семенной 5 х 10 5 клеток 4T1 в 100 мм планшет для тканевых культур в 10 мл модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей 4,5 г / л D-глюкозы с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ D- глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 100 ед / мл пенициллина G и 100 мкг / мл стрептомицина сульфата. Выдержите йе клетки при 37 ° С в увлажненном инкубаторе, содержащем 5% СО 2 в течение 3 до 4 дней. Убедитесь, что клетки 50 - 100% сплошности на день эксперимента.
  2. Для отсоединения опухолевые клетки из культуры ткани пластины, аспирация культуральной среды, промыть клетки с 5 мл PBS, аспирации PBS и добавляют 3 мл 2,5 г / л раствора трипсина. Выдержите клеток 2 - 3 мин с трипсином при 37 ° C.
  3. Добавьте 10 мл среде, содержащей сыворотку, чтобы нейтрализовать трипсина и пипетку вверх и вниз, пока все клетки не были отделены. Передача суспензии клеток в 15 мл коническую центрифужную пробирку.
  4. Центрифуга клетки при 200 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте среду, оставляя 200 мкл среды выше клеточного осадка. Ресуспендируют клеток в остаточном объеме и добавляют 10 мл PBS. Переверните пробирку 2 - 3 раза, чтобы получить однородную суспензию клеток и вывезти 10 мкл для подсчета клеток в гемоцитометра. Использование трипановым синим различать живых и мертвых клеток.
  5. Центрифуга клеточной суспензии в течение 5 мин при 200 х г при комнатной температуре. Аспирируйте PBS и клетки вновь суспендируют в PBS до конечной концентрации 2 × 10 6 клеток / мл. Убедитесь, что суспензию отдельных клеток не имеет комков.
  6. Вводите 1 х 10 6 4Т1 клетки или люциферазы-экспрессирующих клеток 4Т1 в 50 мкл PBS ортотопически в левой паховой молочной жировой ткани женщин BALB / с мышей с использованием 0,3 мл шприц с 30G х 8 мм иглы.
    1. Перед инъекцией, анестезию мышей в индукционной камере, получающих низкую скорость потока изофлуран (3 - 5%) в 100% кислорода.
    2. Положите мышь на стерильный хирургический площадку и убедиться, что голова должным образом размещены внутри ИФ носового конуса. Подтвердите правильное анестезии, зажимая лапу. Используйте ветеринар мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость под наркозом. Бритье волос вокруг места инъекции и дезинфицировать с 70% этанола.
    3. Используйте стерильный набор хирургических инструментов, чтобы сделать небольшой горизонтальный разрез (5 мм) окмерно на полпути между паховой и брюшной соски, подвергать жировой ткани и вводят 1 х 10 6 клеток 4Т1 в 50 мкл. Закрыть разрезы с 9 мм клипов, которые должны быть удалены через неделю. Инъекции люциферазы-экспрессирующих клеток позволяет контролировать размер опухоли и метастазов с помощью визуализации биолюминесценции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это минимально инвазивная процедура не требует после хирургического лечения и вводили мышам восстановить в течение 2 - 3 мин.
    4. Монитор мышей, пока они не приходя в сознание, и убедиться, что они полностью восстановить сознание До прихода в компанию других мышей.
  7. Через 3 - 4 недели, когда первичная опухоль достигла объема 2 см 3, пожертвовать мышей медленным потоком СО 2, и сразу же после последнего дыхания, получить кровь путем сердечной пункции с использованием 25G х 5/8 "иглу подключен к 1 мл туберкулина шприца, предварительно обработанной гепарином. Держите рот иглы вверх при вставкеШприц в горизонтальном положении через диафрагму к сердцу, и медленно и постепенно обратить кровь избежать избыточного давления (рисунок 3).

2. Выделение нейтрофилов

  1. Изоляция цитотоксических нейтрофилов из крови мышей с опухолями.
    1. Развести 1 мл крови, отобранных из несущей опухоль мыши (см протокол 1.11) в PBS, содержащем 0,5% (вес / объем) бычьим сывороточным альбумином (БСА) до конечного объема 6 мл.
    2. Фракционирование разбавленной крови на свежеприготовленного прерывистой градиенте сахарозы:
      1. Добавить 3 мл стерилизованного фильтрацией сахарозы 1,119 г / мл на дно 15 мл конической полипропиленовой центрифужной пробирке.
      2. Медленно и осторожно, слой 3 мл стерилизованного фильтрацией сахарозы 1,077 г / мл на верхней части г / мл 1,119 слоя. После этого добавить медленно и осторожно 6 мл разбавленной крови (протокол 2.1.1) в верхней части 1,077 г / мл слоя (фиг.4А). Рекомендуется провести наклона трубки иdding различные компоненты медленным, но непрерывным потоком, сохраняя рот пипетки к нижней стенке трубы, таким образом, что турбулентность отсутствует формируется.
    3. Центрифуга трубки, содержащей разбавленную кровь на градиенте сахарозы при 700 х г в течение 30 мин при комнатной температуре без тормоза.
    4. Осторожно снимите трубку из центрифуги, не вызывая турбулентность. Большинство эритроцитов будет в нижней части трубы. Нейтрофилы высокой плотности (СЗР) находятся в виде белой-на-красного кольца на границе между 1.119 г / мл и 1,077 мкг / мл слоев (около отметки 3 мл), в то время как низкой плотности лейкоциты обнаруживаются в белое кольцо на границе между слоем 1.077g / мл и BSA-PBS, содержащего (около отметки 6 мл, рис 4В).
    5. не Аспирируйте PBS + 0,5% BSA до достижения 5 мм выше слоя с низкой плотностью клеток. Пипетировать вне низкой плотности клеток путем медленного всасывания в наконечнике в 1 мл через медленно закрученной вокруг клеток.Передача клеток в 30 мл PBS с 0,5% BSA.
    6. не Аспирируйте верхний слой в той же трубе градиента до достижения 5 мм выше диапазона высокой плотности клеток. Пипетировать из высокой плотности клеток, которые в основном нейтрофилы высокой плотности, и передачи клеток в 30 мл PBS, содержащем 0,5% БСА.
    7. Центрифуга клетки при 400 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
    8. Аспирата супернатант и лизировать эритроциты ресуспендированием клеток в 36 мл стерильной воды для ВЭЖХ в течение 30 сек. Изотоничность должны быть восстановлены путем добавления 9 мл в 5х сосредоточены ФБР с добавкой 2,5% (вес / объем) БСА.
    9. Центрифуга клетки при 400 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
    10. Аспирата супернатант и ресуспендирования клеток в PBS-BSA. Подсчитайте количество нейтрофилов в гемоцитометре и использовать трипановым синим различать живых и мертвых клеток.
    11. Центрифуга клетки при 400 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре и ресуспендируют нейтрофилов в желаемом инкубационной среде до конечной плотности клеток. Использованиенейтрофилы немедленно.
    12. Затем, после того, как другой центрифугированием, ресуспендируют нейтрофилов в инкубационной среде до конечной плотности клеток. Использовать немедленно нейтрофилов.
  2. Выделение циркулирующих нейтрофилов у больных раком.
    1. Смешайте 10 мл гепаринизированной (20 ед / мл) крови человека с равным объемом 3% декстрана T500 в физиологическом растворе и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Во время этой инкубации эритроцитов будет оседать.
    2. Подготовка 50 мл коническую полипропиленовую пробирку с 10 мл сахарозы 1,077 г / мл и медленно слой лейкоцитов богатых супернатант сверху г / мл сахарозы слоя 1,077 (фиг.4С).
    3. Центрифуга при 400 х г в течение 30 мин при комнатной температуре без тормоза. С высокой плотностью нейтрофилы (СЗР) появится в осадке. Нейтрофилы низкой плотности (LDN) совместно очищают с моноциты и лимфоциты на границе между 1,077 г / мл сахарозы слоя и плазмы (рис 4D).
    4. Ресуспендируют нейтрофилов в 10 мл 0.2% NaCl в течение 30 сек, чтобы лизировать загрязняющих эритроцитов, и восстановить изотоничность добавлением 10 мл 1,6% NaCl и инвертировать один раз.
    5. Центрифуга 5 мин при 160 мкг при комнатной температуре, и мыть три раза в 20 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса. Центрифуга после каждой промывки и аспирации супернатант.
    6. Количество нейтрофилов и ресуспендирования клеток в RPMI-1640 с добавлением 2% ФТС в 2 × 10 6 / мл нейтрофилов или по желанию.

3. Обогащение крови нейтрофилов, используя магнитные шарики

  1. Положительный отбор
    1. Принимать по 1 мл крови из мышей, как описано в протокола 1,8, с гепаринизированной шприца.
    2. Центрифуга крови в 15 мл коническую пробирку при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    3. Аспирируйте супернатант или сохранить плазму крови для дальнейших исследований.
    4. Лизировать эритроциты путем ресуспендирования клеток в 8 мл ВЭЖХ-сорт воды. Через 30 сек восстановить изотоничность добавлением 2 мл 5-кратным Concentrated PBS, содержащий 2,5% BSA. Граф клеток.
    5. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    6. Ресуспендируют осадок клеток в 200 мкл PBS, содержащего 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА за 10 8 клеток.
    7. Добавить 50 мкл биотинилированного анти-Ly6G антитела. Все хорошо перемешать и выдержать в течение 10 мин в холодильник (не на льду).
    8. Добавить 150 мкл холодного PBS, содержащем 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА.
    9. Вихрь анти-биотин покрытием магнитного Microbead раствор. Передача 100 мкл к клеточной суспензии. Все хорошо перемешать и выдержать в течение 15 мин в холодильник (не на льду).
    10. Промыть клеток путем добавления 10 мл PBS, содержащем 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА, и центрифуге при 400 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
    11. Отберите супернатант полностью, и ресуспендируют в 500 мкл холодного PBS, содержащим 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА.
    12. Вставьте магнитную разделительную колонну в магнитный держатель, который прикреплен к магнитной подставке, и промыть его с 500 мкл холодного PBS, содержащим 0.5% БСА и 2 мМ ЭДТА.
    13. Применение клеточной суспензии на колонку. Проточный содержит немеченые LyG6-отрицательных клеток.
    14. Промыть колонку с 500 мкл PBS, содержащего 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА. Дополнительные немаркированные клетки будут в потоке через.
    15. Повторите стадии промывки еще 500 мкл PBS, содержащего 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА.
    16. Удалить столбец из магнита и поместить его на 15 мл пробирку. Добавить 1 мл PBS, содержащем 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА, и промойте магнитно меченых клеток, плотно нажимая на поршень в колонну. Поток через содержит Ly6G + нейтрофилы.
  2. Отрицательный подбор
    1. Подготовка лейкоциты крови в соответствии с шагами 3.1.1 3.1.5.
    2. Ресуспендируют 1 х 10 8 клеток в 1 мл PBS, содержащего 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА в 5 мл полистирола с круглым дном трубки.
    3. Добавить 50 мкл нормальной сыворотки крыс.
    4. Добавить 50 мкл обогащения нейтрофилов Сocktail (содержащий биотинилированные антитела, специфичные для не-нейтрофильных лейкоцитов), хорошо перемешать и выдержать в течение 15 мин в холодильнике.
    5. Промыть клетки добавлением 4 мл PBS, содержащем 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА, и центрифуги 400 х г в течение 10 мин.
    6. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 1 мл PBS, содержащим 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА.
    7. Добавить 50 мкл тетрамерных комплексов антитело, направленное против биотина и декстрана. Все хорошо перемешать и выдержать в течение 10 мин в холодильник.
    8. Вихревой также трубки, содержащей покрытый декстраном магнитных шариков перед добавлением 150 мкл в клеточной суспензии. Все хорошо перемешать и инкубировать 10 мин в холодильник.
    9. Доведите клеточной суспензии до общего объема 2,5 мл добавлением ФБР, содержащим 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА. Осторожно перемешать, чтобы получить однородную суспензию клеток.
    10. Вставьте трубку (без крышки) в магнит, и дать постоять в течение 3 мин.
    11. Обратить магнит с трубкой в ​​одной непрерывнойдвижение таким образом, что несвязанные ячейки в жидкости будут переданы в новую пробирку. Оставьте магнит и трубу перевернутый для 2 - 3 сек, а затем вернуться к вертикальном положении. Магнитно-меченные нежелательные клетки остаются связанными со стенкой исходного трубки, в то время как несвязанные нейтрофилы будет передано в жидкости.

4. Цитологическое окрашивание нейтрофилов

  1. Ресуспендируют 1x10 5 нейтрофилы в 50 мкл PBS и передачи клеточной суспензии к адаптеру клеточного препарата тонкослойной таких как цитоспина. Центрифуга адаптер на 150 мкг в течение 5 мин. Отделите заранее помечены предметное стекло от адаптера.
  2. Fix клетки путем погружения стеклянные слайды в 70% этаноле в течение 2 мин. Позвольте препараты от адаптера (см шаг 4,1), чтобы высохнуть при комнатной температуре, прежде чем окрашивания. Опустите слайды 5 - 6 раз в дистиллированной воде.
  3. Пятно 1 - 2 мин в растворе Майера гематоксилин. Промыть 1 мин в водопроводной воде. Пятно 10 сек в эозином Y решения , Стирать в водопроводной воде. Высушить путем промывки слайды в возрастающих концентрациях этанола (70%, 96% и 100%). Пусть стеклах воздушно-сухой в ближайшее время и проверить слайды под световым микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: гематоксилин имеет глубокий синий цвет фиолетовый-и пятен нуклеиновых кислот, в то время как эозином розовый и окрашивает белки неспецифическим. Цитоплазматические гранулы нейтрофилов остаются запятнано кислотных или основных красителей, который является происхождение для имени «любящего быть нейтральным. В то время как базофильные гранулоциты пятно темно-синий с гематоксилином и эозином и eosinophilc гранулоцитов ярко-красные, появляются нейтрофилы нейтральный розовый (Смотрите рисунок 1А). Зрелые нейтрофилы характеризуется полиморфно ядра, которое в целом большая с 2 - 5 лепестков "сегментированных нейтрофилов (рис 1А и 1С). Незрелые нейтрофилы характеризуются одним-лопастным изогнутой или кольцевой ядра (Фиг.1В).
ve_title "> 5. Определение чистоты нейтрофилов методом проточной цитометрии.

  1. Ресуспендируют 1x10 6 клеток в 100 мкл FACS буфера (PBS, содержащим 0,5% БСА, 2 мМ ЭДТА и 0,02% NaN 3). Для образцов цельной крови, гемолиз необходимо до окрашивания (шаги 3.1.1 3.1.5). Добавить 10 мкл FcR блокирующий реагент в течение 5 мин.
  2. Добавить 0,5 мкг флуоресцентного меченных антител со специфичностью к LY-6G для нейтрофилов мыши или CD11b и CD66b на нейтрофилах человека, хорошо перемешать и выдержать в течение 15 мин при комнатной температуре.
  3. Настройка громкости в 500 мкл ЗФР, содержащим 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА и анализировать окрашивание с помощью проточной цитометрии.

6. Последующие нейтрофилов ворота в естественных условиях

  1. В естественных условиях BrdU маркировки нейтрофилов
    1. Вводите 100 мкл 10 мг / мл (бромдезоксиуридина BrdU) раствора в стерильной PBS внутрибрюшинно мышей с опухолями.
    2. Изолировать нейтрофилов крови 48 часов после инъекции Аогласно протоколу 2.1. Пятно BrdU-меченых нейтрофилов с использованием набора BrdU потока.
  2. CFSE маркировка нейтрофилов
    1. Ресуспендируют 10 7 нейтрофилов в 1 мл подогретого PBS.
    2. Добавьте 2 мкл 5 мМ исходного раствора CFSE к взвешенных нейтрофилов до конечной концентрации 10 мкМ. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 мин при 37 ° С. 5 мМ CFSE получают растворением 2,8 мг CFSE (5- (и 6 -) - карбоксифлуоресцеина диацетат, сукцинимидил эфир) в 1 мл ДМСО. Разделить на 10 мкл аликвоты в стерильные 200 мкл труб и в магазине в темноте при -20 ° C.
    3. Нейтрализации избытка CFSE добавлением равного объема RPMI-1640, содержащей 10% FBS. Инкубируют в течение 10 мин при 37 ° С. Центрифуга нейтрофилов при 400 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Промыть нейтрофилов в два раза в 10 мл RPMI-1640, содержащей 10% FBS.
    4. Центрифуга при 400 х г в течение 10 мин и ресуспендируют в соответствующем объеме PBS. Нейтрофилы (например, 1 х 10 7 Клетки) теперь могут быть введены внутривенно или с помощью инъекций в сердечной мышей-реципиентов.

7. В пробирке анализа люциферазы для мониторинга противоопухолевую активность изолированных нейтрофилов.

  1. Выращивают люциферазы меченных опухолевых клеток, как описано в 4Т1 клеток в Протоколе 1.1-1.5, но ресуспендирования трипсина-диссоциированных клеток в среде оптимизированной пониженном сыворотки, с добавлением 2% ФТС. Отрегулируйте плотность клеток в 5 х 10 4 клеток на мл.
  2. Seed 5000 люциферазы меченных опухолевых клеток в 100 мкл среды оптимизирован снижение сыворотки, содержащей 0,5% FBS в каждую лунку 96-белой плоским дном ткани-луночного планшета культуры.
  3. 4 часа после посева клеток опухоли, добавить 1 х 10 5 нейтрофилы в 50 мкл оптимизированных снижается средний сыворотки, содержащих 0,5% FBS, и инкубируют O / N. Приготовьте суспензию клеток нейтрофилов с плотностью 2 × 10 6 клеток / мл. Контрольные лунки должны получить 50 мкл среды без нейтрофилов. Сделатьнесколько повторов каждой экспериментальной установки.
  4. На следующее утро, аккуратно аспирата супернатант и мыть каждую лунку по 200 мкл PBS. Аспирируйте PBS и добавить 50 мкл пассивного буфера для лизиса. Для легко отсоединение клеток (например, АТ-3 клеток), не мыть в PBS и немедленно добавить культивирования клеток лизис буфера после аспирации среды роста.
  5. Закройте планшет с алюминиевой фольгой и инкубируют ее на орбитальном шейкере при 150 оборотах в минуту в течение 20 мин при комнатной температуре.
  6. Поместите пластину в читателя люминесценции пластины. Вводите хорошо мудрый 50 мкл раствора люциферазы, и читать хемилюминесценции в течение 10 сек на лунку.
  7. Вычислить лизис% опухоли по следующей формуле:% лизиса опухоли = (1- [люминесценции образцов с нейтрофилами] / [люминесценции образцов в среде]) × 100%.

ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки вклада нейтрофилов метастатического посева, нейтрофилы могут быть истощены, как описано в протоколе 8.1. Для эффективного depletion управлять нейтрофилов разрушающих антитела, начиная с 7-й день после приживления опухоли.

8. антиметастатическую активность нейтрофилов в рак молочной железы мыши модели.

  1. В естественных условиях истощения нейтрофилов.
    1. Свежий подготовки 12,5 мкг крысиного анти-антитела (Ly6G нейтрофилов слой антител) или контрольного антитела изотипа IgG крыс (2а, Κ) в физиологическом растворе в конечном объеме 100 мкл на мышь.
    2. Начиная с 3-й день после приживления опухоли вводят ежедневно внутрибрюшинно дозу 12,5 мкг крыс анти-антитела Ly6G (100 мкл). Вводите контрольных мышей с 12,5 мкг или (100 мкл) контроля крыс изотипа (IgG 2a, Κ).
    3. Начиная с 14 дня, управлять антитела два раза в день, а уровень производства нейтрофилов резко возрастает, когда опухоль растет 4T1.
    4. Каждый день, получить образец крови (2 - 3 капли) по уменьшение поперечного сечения боковой хвост-вены. Соберите кровь в анти-coagulant содержащий трубку (гепарин, цитрат или ЭДТА).
    5. Убедитесь, истощение нейтрофилов с помощью проточной цитометрии, как описано в Протоколе 5.
  2. Опухоль Нейтрализация тест (модифицированный Winn анализ)
    1. Изолировать нейтрофилов из опухоли мышей. Смешайте 1 х 10 6 опухолевых клеток и 3 х 10 6 нейтрофилы в 50 мкл физиологического раствора (на мышь).
    2. Вводите клетки подкожно фланг 6 - 8 недель старые наивные линии BALB / C мышей. Бритье фланг до приживления опухоли, чтобы точные измерения размеров опухоли. Измерьте размер опухоли ежедневно, начиная на день 5 после приживления.
  3. Нейтрофилов приемных передачи
    1. Вводят 2 х 10 4 люциферазы экспрессирующих опухолевых клеток в 200 мкл PBS в хвостовую вену.
    2. Передача нейтрофилов следует проводить через 4 ч после инъекции опухолевых клеток. Следовательно, начать очистку ГБН от мышей, несущих опухоль (протокол 2.1) примерно 2 часа до их планируется вестественных передачи. Ресуспендируют нейтрофилов в PBS до конечной концентрации 2,5 х 10 7 клеток / мл.
    3. 4 часа после введения опухолевых клеток мышей разместить под тепловой лампой в течение 5 мин. Поместите мышей в фиксатор и вводят 5 × 10 6 ГБН (200 мкл) через хвостовую вену. Контрольные мыши инъецируют транспортного средства (PBS).
    4. Монитор образование метастазов в легких в различные моменты времени с помощью биолюминесценции в системе естественных изображений или иммуногистохимии.
  4. Легких метастатическим посев анализ
    1. Вводите 0,5 - 1 х 10 6 клеток 4Т1 родительских ортотопически в левой паховой молочной жировой ткани, как описано в Протоколе 1.
    2. На 10-й день, ресуспендируют GFP-экспрессирующих клеток 4Т1 в PBS до конечной концентрации 5 × 10 5 клеток / мл. Поместите мышей под тепловой лампой в течение 5 мин.
    3. Поместите мышей в фиксатор и вводят 1x10 5 GFP-экспрессирующих клеток 4T1 (200 мкл) внутривенно 4T1 опухоль мышей или наивные мышей.
    4. На следующий день, усыпить мышей и заливать легкие с 20 мл PBS, чтобы удалить оставшиеся эритроциты.
    5. Вырезания легкие для анализа GFP-положительных клеток с помощью иммуногистохимии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки вклада нейтрофилов метастатического посева, нейтрофилы могут быть истощены, как описано в протоколе 8.1. Для эффективного управления истощения нейтрофилов разрушающих антитела, начиная с 7-й день после приживления опухоли.

9. Подавление Т клеточной пролиферации нейтрофилами от мышей с опухолями.

  1. Удалить селезенки от эвтаназии наивного BALB / с мыши и место в 10 мл PBS.
  2. Поместите селезенки на сито 40 мкм клетки, которая помещается на чашку Петри, заполненную RPMI-1640. Использование конец поршня шприца, пюре селезенки через клетки сетчатый фильтр в чашку Петри. Промойте фильтр клеток с 5 мл RPMI. Откажитесь сетчатый фильтр.
  3. Передача ресуспендировали клетки в 50 мл коническую пробирку и центрифуги 400 х г в течение 10 мин.
  4. Жидкость над осадком сливают и лизировать эритроциты путем суспендирования клеток в 36 мл чистой воды в течение 20 сек, и приспособиться к изотоничности добавлением 4 мл PBS сконцентрированы х 10. В качестве альтернативы, лизировать эритроциты путем суспендирования клеток в 5 мл эритроцитов лизиса буфер (ACK), и инкубируют 5 мин при комнатной температуре. Нейтрализовать ACK добавлением 10 мл RPMI-1640. Центрифуга при 400 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Ресуспендируют клеток в 5 мл PBS и считать клетки.
  5. Ресуспендируют спленоцитов в PBS до конечной концентрации 4 × 10 7 клеток / мл в 2 мл пробирку 15. Добавить 2 мл 2,5 мкМ CFSE раствора в PBS. Быстро инвертировать трубку и инкубировать в течение 10 мин при 37 ° С с периодическим перемешиванием (каждые 2 мин), защищенном от света месте.
  6. Погасить избыток CFSE добавлением 4 мл подогретого FBS (100%) и инкубируют в течение 1 мин при комнатной температуре. Добавить 3 мл PBS и центрифуге при 400 мкг в течение 10минимум
  7. Промыть клетки с 30 мл PBS и центрифуге при 400 х г в течение 10 мин.
  8. Фильтр клетки через сетчатый фильтр 40 мкм клеток и мыть снова PBS.
  9. Ресуспендируют клеток в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS до конечной плотностью 2 х 10 7 клеток / мл.
  10. Семенной 2 × 10 6 / лунку (200 мкл) в 24-луночного культурального планшета-.
  11. Стимулирование клеток путем добавления 1 мкг очищенного Армении хомяка против мышиного антитела CD3ε в 500 мкл RPMI-1640 с добавлением 10% FBS.
  12. Добавьте 2 × 10 6 ГБН или LDN в 300 мкл RPMI-1640 с добавлением 10% FBS с CFSE-меченых спленоцитов, и инкубируют в течение 3 дней при 37 ° С. Уэллс без нейтрофилов должен получить 300 мкл среды. Общий объем в каждой лунке должен быть 1 мл.
  13. Сбор клеток и подготовить их к проточной цитометрии. Ресуспендируют клеток в 100 мкл FACS буфера (протокол 5), и добавить 10 мкл FcR блокирующий реагент. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре.
  14. Добавить 1 &# 956; л APC-сопряженных анти-CD8α антитела и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре.
  15. Определите интенсивность флуоресценции CFSE на CD8 + Т-клеток с помощью проточной цитометрии (рис 5). Интенсивность CFSE уменьшается вдвое при каждом делении клетки. Таким образом, количество клеточных делений может быть определена по интенсивности окрашивания CFSE.

10. Анализ миграции нейтрофилов

  1. Семенной 5x10 5 клеток 4Т1 в 7 мл среды оптимизированных уменьшается сыворотки с добавкой 0,5% FBS в 25 см 2 тканевой культуральной колбы и инкубируют 24 ч при 37 ° С.
  2. Передача 800 мкл супернатанта к нижней камере миграции пластины с размером пор 5 мкм.
  3. Ресуспендируют 2 х 10 5 нейтрофилов в 400 мкл среды оптимизированной пониженном сыворотки, с добавлением 0,5% FBS. Применение клеточной суспензии в верхней камере и инкубируют в течение 2 часов при 37 ° С.
  4. В конце инкубации, удалить верхнюю камеру иподсчитать количество нейтрофилов, которые мигрировали в нижнюю камеру.

11. Мониторинг нейтрофилов продукцию активных форм кислорода (АФК).

  1. Готовят 1,1 × 10 6 нейтрофилы / мл в сбалансированном солевом растворе Хенкса без фенолового красного. Пластина 180 мкл, содержащие 2 × 10 5 нейтрофилы в каждую лунку 96-белой плоским нижней пластине так.
  2. Поместите пластину в читателя люминесценции пластины. Добавьте 20 мкл раствора люминола 500 мкМ в PBS в каждую лунку, чтобы получить конечную концентрацию 50 мкМ. Читайте базальной хемилюминесценции для 1sec в течение времени, 5 мин с 10-секундными интервалами.
  3. Добавить стимулятор (например, РМА в концентрации 10 нМ или 100 нМ или ФМЛФ в концентрации 10 мкМ). Подготовка 10x концентрированный раствор каждого агента в сбалансированном солевом растворе Хенкса без фенолового красного и добавить 22 мкл в соответствующие лунки. Чтобы контрольные лунки добавляют 22 мкл транспортного средства.
  4. MeasuRe хемилюминесценции в планшет-ридере. У обоих короткий (каждые 10 сек в течение 5 мин) и долго (каждую минуту в течение 1 часа) время, конечно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В недавнем исследовании мы определили антиметастатическую функцию нейтрофилов 6. Нейтрофилы от опухоли мышей приобрести фенотип цитотоксическое и имеют потенциал, чтобы убить опухолевые клетки 6. Это в отличие от нейтрофилов из наивного мышей, которые не имеют существенного влияния анти-опухоли 6. Несколько из методов, описанных в разделе протокола были использованы для изучения функции нейтрофилов противоопухолевую в пробирке и в естественных условиях 6.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Нейтрофилы являются наиболее распространенными из всех белых кровяных клеток и первыми отвечают в случаях инфекции и воспаления. Как таковые, они очень чувствительны к внешним сигналам и легко активированы. Кроме того, нейтрофилы имеют очень короткий период полураспада и быстрый оборот. Вместе, эти характеристики вызывают ряд трудностей в работе с нейтрофилов, таких, что уникальные экспериментальные стратегии требуется. Например, есть несколько нейтрофилов стратегии очистки, каждый со своими плюсами и минусами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

З. поддерживается грантами от I-CORE программу Израиля научного фонда (грант № 41/11), Abisch-Френкеля Фонд Rosetrees Доверие, Фонд исследований рака Израиль (ICRF - Исследование Карьера премии развития) и КОНЦЕРН фундамент. ZGF поддерживается грантами от Cancer Research Foundation Израиля (ICRF - Исследование Карьера Award развития), главный научный сотрудник Израильского Министерства здравоохранения и Израильской ассоциации легких.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ
Мышь 4T1 клетки карциномы молочной железыADCCCRL-2539Питательная среда: DMEM + 10 % термоинактивированные FBS
ПЛАСТИКОВЫЕ ИЗДЕЛИЯ И ОБОРУДОВАНИЕ
24-луночный планшет для культуры тканей Falcon353047Стерильный
планшет для культуры тканей 100 мм Corning430167Стерильный
25 см<суп>2 Колба для культуры тканейNunc156340Стерильная
90 мм Чашка для культуры бактерий Miniplast, Ein Shemer, Израиль20090-01-017Стерильная
коническая центрифуга 15 мл Стерильная коническая центрифуга Miniplast, Ein Shemer, Израиль835015-40-111Стерильная
50 мл Стерильная коническая центрифужная пробирка Miniplast, Эйн-Шемер, Израиль835050-21-111Стерильный
сокол 12 x 75 мм Полистирольная трубка с круглым дном Becton Dickinson352058Sterile
Millicell 24 Migration Plate с размером пор 5&мкм; М Merck MilliporePSMT010R1Стерильный
белый 96-луночный планшет с плоским дном Costar3917Стерильный
клеточный фильтр (40 мм)BD Falcon352340Стерильный
20G x 1.5" ИглаBD Microlance 3 301300Стерильная
игла 23G x 1"BD Microlance 4300800Стерильный
25G x 5/8" Игла BD Microlance 5300600Стерильный
0,3 мл Шприц с иглой 30Г x 8 ммBD Micro-Fine Plus Demi320829Стерильный
9 мм Зажимы BD, AutoClip 427631Стерильный
магнит EasySep STEMCELL Technologies18000
MACS LS Разделительная колонна Miltenyi Biotech130-042-201Стерильный
MidiMACS Сепаратор МагнитMiltenyi Biotech130-042-302
MACS MultiStandMiltenyi Biotech130-042-303
Микроскоп Предметное стекло Menzel-Glä ser Superfrost  Plus ТермоJ1800AMNZ
орбитальный встряхиватель Sky line,S-3.02.10L
 TECANInfiniteF200Pro
POWDER
Бычья сыворотка альбумин (БСА), фракция VSigmaA7906
Бромодоксиуридин (BrdU)  BD Pharmingen550891Sterile
CFSE (5-(и 6-)-Карбоксифлуоресцеин диацетат, сукцинимидиловый эфир)Молекулярные зондыC1157
Dextan T500Sigma31392
Гепарин натриевая соль из слизистой оболочки кишечника свиньи SigmaH3149
Азид натрия (NaN3)SigmaS8032Высокотоксичный, обращайтесь с осторожностью
Порошок тиогликоллата Difco225650
Zymosan ASigmaZ4250
МЕДИА И ДОБАВКИ
Модифицированная среда Eagle от Dulbecco (DMEM)SigmaD5796Sterile
Opti-MEM® Я уменьшил уровень сыворотки СМИ Life Technologies31985062Sterile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 mediumSigmaR8758Sterile
Foetal bovaine serum (FBS), термоинактивированнаяSigmaF9665Стерильная
L-глютаминBiological Industries, Бет ха-Эмек, Израиль03-020-1AСтерильный
пируват натрияBiological Industries, Бет ха-Эмек, Израиль03-042-1BСтерильный
пенициллин стрептомицин x 1000 растворBiological Industries, Бет ха-Эмек, Израиль03-031-5Стерильный
фосфатный буферный раствор (PBS) без Mg2+ и Ca2+ Biological Industries, Бет ха-Эмек, Израиль02-023-1Стерильный
PBS x 10 без Ca2+ и Mg2+ Biological Industries, Бет ха-Эмек, Израиль02-023-5AСтерильная
вода класса ВЭЖХ J.T. Baker4218-03Автоклав
РЕШЕНИЯ
ACK – Технологии Аммония-Хлорид-Калийnbsp;A10492-01
Раствор брмодеоксиуридина (BrdU) (10 мг/мл) в PBSРастворить 10 мг BrdU в 1 мл PBS и стерильным фильтром.
CFSE, 5 мМ в ДМСОРастворите 2,8 мг CFSE в 1 мл ДМСО. Разделите на 10 мл аликвоты в стерильных пробирках объемом 200 мл и храните в темноте при температуре -20oC.
Эозин Y растворSigmaHT110-2-32
Сбалансированный раствор соли ХэнксаBiological Industries, Бет ха-Эмек, Израиль02-016-1AСтерильный
гепарин, 20 мг/мл в PBSРастворить 100 мг гепарина в 5 мл стерильного PBS, и стерильный фильтр через фильтр 0,2 мм.
Histopaque-1119 Sigma11191Стерильный фильтр через фильтр 0,2 мм.
Histopaque-1077 Sigma10771Стерильный фильтр через светофильтр 0,2 мм.
Буфер для лизиса клеточной культуры люциферазы x5PromegaE153Aразвести 1:5 в стерильной воде непосредственно перед применением.
Раствор для анализа люциферазыPromegaE1501Содержит порошок субстрата для анализа люциферазы (E151A) и буфер для анализа люциферазы (E152A)
Раствор гематоксилина Майера SigmaMHS-32
PBS + 0,5% BSAРастворите 2,5 г BSA в 500 мл PBS, а стерильные фильтруйте через фильтр 0,2 мм.
PBS + 1% BSAРастворите 1 г BSA в 100 мл PBS, а стерильные фильтруйте через фильтр 0,2 мм.
5x PBS с 2,5% BSAРастворите 12,5 г BSA в смеси 250 мл стерильной воды класса ВЭЖХ и 250 мл PBSx10, и стерильно отфильтруйте через фильтр 0,2 мм.
PBS, содержащий 0,5% BSA и 2 mM EDTA. Растворите 250 мг BSA в 50 мл стерильного PBS и добавьте 200 мл 0,5M EDTA, pH 8,0, стерильно отфильтруйте через фильтр 0,2 мм.
Буфер FACS (PBS, содержащий 0,5% BSA, 2 мМ ЭДТА и 0,02% NaN3)Растворите 250 мг BSA в 50 мл стерильных PBS  и добавьте 200 мл 0,5M EDTA pH 8,0 и 500 мл 2% NaN3, стерильный фильтр через фильтр 0,2 мм.
Физиологический раствор (0,9% NaCl)Растворить 9 г NaCl в 1 000 мл двт, автоклав
0,2% растворРастворить 2 г NaCl в 1 000 мл двт, автоклав
1,6% растворРастворить 16 г NaCl в 1 000 мл дв., автоклав
2 % азидРастворить 1 г азида натрия в 50 мл стерильного двт, хранить при 4<суп>оС. Высокотоксичен.
3% раствор                                                                            Растворите 3 г порошка тиогликоллата в 100 мл дв.                                                                              Кипятить до тех пор, пока раствор не станет желтым и автоклавным.
Раствор трипана синего (0,4%)SigmaT8154Разведите 1:10 в PBS для получения 0,04% раствора.
Раствор трипсина B Biological Industries, Бет ха-Эмек, Израиль03-046-1Стерильный
1 мг/мл Зимозан АРесуспендия 1 мг Зимозан А в 1 мл стерильный PBS в пробирке Эппендорфа. Энергично вдохните и инкубируйте трубку при температуре 37 oC в течение 30 минут. Не автоклавировать. Перед применением приготовьте раствор в свежем виде.
Наборы EasySep PE selection kitSTEMCELL Technologies18557
EasySep PE selection cocktail STEMCELL Technologies18151
Магнитные наночастицы EasySep STEMCELL Technologies18150
Anti-Ly6G мышь Набор микрогранулMiltenyi Biotec130-092-332
EasySep Набор для обогащения нейтрофилов мышейSTEMCELL Technologies19762
EasySep Набор для обогащения нейтрофилов человекаSTEMCELL Technologies19257
FITC BrdU flow kitBD Pharmingen 
MACS Набор для выделения нейтрофиловMiltenyi Biotec130-097-658
Набор для анализа фагоцитоза Кайманова химическая компания 500290
АНТИТЕЛА
FcR, блокирующие антитела Biolegend101302
Очищенное антитело к Ly6G у крыс BD Pharmingen 551459Клон 1A8
PE-конъюгированного антитела крысы к мышиному антителу Ly6G Biolegend127608Клон 1A8
FITC-конъюгированный крысиный антимышиный Ly6GBD Pharmingen 551460Клон 1A8
PerCP-Cy5.5 крыса антимышиный Ly6G TONBO Biosciences65-1276Клон 1A8
violetFluor 450-конъюгированный крысиный антимышиный Ly6G TONBO Biosciences75-1276Клон 1A8
FITC-конъюгированный крысиный антимышиный CD11bBD Pharmingen 553310Клон M1/70
FITC-конъюгированный крысиный антимышиный Ly-6G и Ly-6C (GR-1)BD Pharmingen 553127Клон RB6-8C5
ПЭ-конъюгированная крыса антимышиный CD45BD Pharmingen 553081Клон 30-F11
ФИТК-конъюгированный крысиный антимышиный F4/80 Abcamab60343Клон BM8
FITC-конъюгированная мышь античеловеческая CD66b Biolegend305103Клон G10F5
Очищенное антитело контроля изотипа крыс (IgG2a, k) BD Pharmingen 553927Клон R35-95
LEAF очищенный армянский хомяк против мышиного антитела CD3eBioLegend100314Клон 145-2C11
Считыватель пластин ELMI & NaCl NaCl натрия тиогликоллата559619

Ссылки

  1. Tangye, S. G., Brink, R. A helping hand from neutrophils in T cell-independent antibody responses. Nat Immunol. 13, 111-113 (2012).
  2. Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 11, 519-531 (2011).
  3. Pruijt, J. F., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 6228-6233 (2002).
  4. Tecchio, C., Cassatella, M. A. Neutrophil-derived cytokines involved in physiological and pathological angiogenesis. Chem Immunol Allergy. 99, 123-137 (2014).
  5. Liu, M., et al. Formylpeptide receptors mediate rapid neutrophil mobilization to accelerate wound healing. PloS one. 9, e90613(2014).
  6. Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20, 300-314 (2011).
  7. Sionov, R. V., Fridlender, Z. G., Granot, Z. The Multifaceted Roles Neutrophils Play in the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. , (2014).
  8. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
  9. Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69, 698-704 (2001).
  10. Futosi, K., Fodor, S., Mocsai, A. Neutrophil cell surface receptors and their intracellular signal transduction pathways. Int Immunopharmacol. 17, 638-650 (2013).
  11. Scapini, P., Cassatella, M. A. Social networking of human neutrophils within the immune system. Blood. 124, 710-719 (2014).
  12. Fridlender, Z. G., et al. Transcriptomic analysis comparing tumor-associated neutrophils with granulocytic myeloid-derived suppressor cells and normal neutrophils. PloS one. 7, e31524(2012).
  13. Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2. TAN. Cancer Cell. 16, 183-194 (2009).
  14. Talmadge, J. E., Gabrilovich, D. I. History of myeloid-derived suppressor cells. Nat Rev Cancer. 13, 739-752 (2013).
  15. Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
  16. Choi, J., et al. CD15+/CD16low human granulocytes from terminal cancer patients: granulocytic myeloid-derived suppressor cells that have suppressive function. Tumour Biol. 33, 121-129 (2012).
  17. Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. J Leukoc Biol. 89, 311-317 (2011).
  18. Pillay, J., Tak, T., Kamp, V. M., Koenderman, L. Immune suppression by neutrophils and granulocytic myeloid-derived suppressor cells: similarities and differences. Cell Mol Life Sci. 70, 3813-3827 (2013).
  19. Lopez-Lago, M. A., et al. Neutrophil chemokines secreted by tumor cells mount a lung antimetastatic response during renal cell carcinoma progression. Oncogene. 32, 1752-1760 (2013).
  20. Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75, 604-611 (2004).
  21. Sagiv, J., et al. Phenotypic Diversity and Plasticity in Circulating Neutrophil Subpopulations in Cancer. Cell Reports. , (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Выделение и характеристика нейтрофилов с Противоопухолевые свойства
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.