Method Article

Простой и Компьютерный обонятельных тестирование для мышей

DOI:

10.3791/52944

⸱

June 15th, 2015

 , 
1Unit of Anatomy, Department of Medicine, University of Fribourg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем простой и непредвзятый обонятельный тест на мышах. С помощью этого протокола обонятельная дискриминация, предпочтение, избегание и чувствительность к новому запаху по сравнению с водой могут быть оценены в ходе отдельных поведенческих сеансов. Этот метод показан для одного экспериментатора, а анализ основан на компьютерной обработке видео.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обоняние высоко консервативен среди видов и необходим для воспроизводства и выживания.

У человека, обоняние также является одним из органов чувств, что пострадавших при старении и сильным предиктором нейродегенеративных заболеваний. Таким образом, обоняние тестирование используется в качестве неинвазивного метода диагностики для выявления неврологического дефицита на ранних стадиях. Для того, чтобы понять механизмы, лежащие в основе обонятельной чувствительности к сети, обонятельные исследования на грызунах набирает обороты в последнее десятилетие.

Здесь мы представляем очень простой, эффективный и времени воспроизводимого метода обоняния тестирования врожденного восприятия запаха и чувствительности у мышей без необходимости какого-либо предварительного пищи или воды ограничений. Испытания проводятся в знакомой среде на мышах, требуют только ароматы и 2 минутные сеансы воздействия одоранта. Анализ проводится, ретроспективном, используя компьютерные помощь команды на ImageJ а может быть, поэтому, Осуществляется с начала до конца, от одного исследователя.

Этот протокол не требует какого-либо специального оборудования или установки и указывается для любой лаборатории, заинтересованной в тестировании обонятельный восприятие и чувствительность.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обоняние является одним из наиболее развитых и важных сенсорных функций у млекопитающих. Любое ухудшение в обонятельной деятельности может повлиять на потребление продуктов питания, социальное поведение и, в худшем случае, даже выживание. У человека, обонятельные ухудшение зависит 1 возраст и считается сильным предиктором неврологических расстройств 2 - 6. Идентификация тест обонятельные разработана в Университете штата Пенсильвания в настоящее время представляет собой один из наиболее часто используемых, неинвазивных и количественной, диагностических тестов, которые могут оценить ранние неврологические дефициты 7 и предсказать с большой долей вероятности прогрессирования деменции 8,9.

Доступность обонятельной системы и известность обоняния грызунов, вызвало интенсивное направление исследований адресации механизмы, лежащие в основе обонятельные функции 10. Ранее мы показали, что потеря функции Recept сигнализацииили Notch1 влияет обонятельный избежать 11. В этом протоколе мы используем мышей, лишенных лиганд сигнализации, Jagged1, в нейронах или глии изучать обонятельные характеристики.

Врожденный обоняние определяется тремя параметрами, как восприятия, различения запахов и обонятельных чувствительности 4. Обонятельная испытания на грызунах может быть осуществлено различными способами, и некоторые поведенческие исследования используют olfactometers, которые обеспечивают запах животному при определенных концентраций паров и в точном времени 12 - 14. Тем не менее, эти приборы дорого и могут быть доступны только в специализированных учреждениях. В нашей работе, мы предоставляем простой, быстрый и воспроизводимый обонятельный протокол тестирования, который осуществляется с помощью летучих ароматов. Тесты описано мера восприятия к аттрактанта или репеллента запаха и оценить дискриминации между запахом и воды 11,15,16. Используя ту же настройку, же можно также измерить чувствительность к запах при различных концентрациях 16,17. Ретроспективном помощью компьютера обработки видео, вдохновленный работой Пейдж и коллег 18, обеспечивает объективные результаты без необходимости экспериментального ослепления и позволяет для одного человека, чтобы осуществить весь эксперимент.

Этот протокол предназначен для обеспечения отправной точкой для изучения обонятельной поведение у мышей.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры на животных в соответствии с Директивой ЕС 2010/63 / ЕС о защите животных, используемых для научных целей и утверждаются местным комитетом по уходу за животными (Кантон Фрибур, Швейцария) по.

1. Подготовка животных

  1. Экспериментальные животные
    1. Выполните эксперименты на взрослых мужчин дикого типа и трансгенных мышей (C57BL / 6 фон) 3-5 месяцев. Три группы мышей соответствуют диких управления типа однопометными (группа, Jagged1 Flox / Flox 19) и два условных KO линий мышей (группа Б, Jagged1ncKO и С, Jagged1gcKO).
    2. Дом мышей при стандартных лабораторных условиях в проветриваемом помещении, с 12 ч контролируемой темный / светлый цикл и обеспечить пищу и воду без ограничений.

2. Экспериментальная установка

  1. Экспериментальная арена
    1. Для экспериментального арене, используйте чистую стерилизованную клетку мыши (36 см длина х 20,5 см ширина х 13,5 см высота) (1А).
    2. Связать каждой мыши в клетке номером с пресной постельные принадлежности, высокой 3 см. Если клетки используются повторно, а в тесте чувствительности запаха, принять следующие меры, чтобы избежать перекрестного загрязнения между запахов и мышей.
      1. Отметить сторону воды.
      2. Очистить узкие стенки клеток с двумя тонкую бумагу опрыскивают 70% -ным этанолом, по одному на каждой стороне.
      3. Накапливаются клетки в соответствии с генотипом мышей и временного хранения под капотом ламинарного.
  2. Камера
    1. Установите камеру на штатив настроенного с целью на 58 см от дна клетки (рис 1А). Закрепите положение штатива и клетку и ограничивают с отметками для обеспечения камеры, сосредоточены на верхней части клетки.
    2. Запись видео в 320 пикселей х 240 пикселей, 15.08 кадров в секунду как MOV файлов.
  3. Запахи
    1. Ресуспендируют ScenTS, когда указано, в растворителе, в котором они растворимы.
    2. Для испытаний предпочтение использование арахисового масла. Ресуспендируют арахисовое масло в арахисовом масле (10% вес / объем).
    3. Для тестового использования избегания чистого 2-метилмасляную (2-МБ) кислоты (98%).
    4. Для испытания чувствительности, использовать женский мочи из той же колонии мыши и фона (C57BL / 6).
      1. Для удобства сбора мочи 1-2 дней до обонятельной теста. Задержите и удерживайте нажатой клавишу мыши под капотом с его живота над клетке сетки. В клетке сетки поместить пластиковый Петри, чтобы собрать капли мочи.
      2. Соберите мочу из каждой самки в 1,5 мл трубки и смешать все образцы мочи для нормализации изменчивости между животными. Хранить при -20 ° С до использования.
      3. В день эксперимента, оттаивают мочи и выполнить 4 разведений в бидистиллированной воде при коэффициенте разбавления 10 (1:10, 1: 100; 1: 1000; 1: 10000).

3. Обонятельный Тестирование

Примечание: В этом протоколе запахов были намеренно выбраны, которые воспринимаются как сильные аттрактанты (арахисовое масло и женщина мочи) или сильного репеллента (2 МБ кислоты) 15. Важно проводить предпочтения и тесты чувствительности к приятных ароматов до теста избегания, чтобы исключить возможность какого-либо вмешательства с обонятельной поведения. Тем не менее, для простоты, в этой статье, предпочтение и избегания теста будет как описано в тесте восприятия. Каждый поведенческий сессия начинается с фазы привыкания.

  1. Привыкание Фаза
    1. Место животное в чистом назначенного клетку и пусть это исследовать в течение 5 мин (Фиг.1В). Так среды экспериментальной клетке знаком домашней клетке, это короткое время достаточно, чтобы позволить привыкания.
    2. Если чувствительность теста завершена в течение одного дня, выполнять привыкания только один раз перед аппликацийп высшей разбавленной запаха. Если тест чувствительности осуществляется в разные дни, каждый день необходимо фазы привыкания на новом чистой клетке.
  2. Восприятие Тест
    1. После привыкания, включите камеру и сразу же пипеткой 60 мкл приятным ароматом (арахисовое масло) и 60 мкл нейтрального аромата (водопроводной воды) на противоположных стенках клетки примерно в 10 см от дна (рис 1в).
    2. Пусть мышь исследовать запахи в течение 2 мин (рис 1D). После этого выключите камеру.
    3. В этот момент, перейти к следующему мыши, начиная с этапа привыкания. Проводят исследование избегания точно таким же образом с применением 60 мкл репеллента запаха (2-МБ кислота) и 60 мкл воды.
  3. Тест чувствительности
    1. Оценка привлекательности порог самцов мышей с возрастающими концентрациями женской моче в следующем порядке: 1: 10000; 1: 1000; 1: 100; 1:10 и чистый мочи.
    2. После приучения, подвергнуть каждой мыши в высоком разведении пипеткой экспериментатором как описано ранее в разделе 3.2.1.
    3. Запишите исследовательское поведение мочи в сравнении с водой, в сроки 2 мин на видео камеру. После того как все мыши когорты испытывали на самом высоком разбавлении (1: 10000), подвергать более высокой концентрации мочи, как было указано выше.

4. После специального анализа данных

Примечание: Все поведенческие тесты, описанные обрабатываются постфактум, следуя инструкциям анализа данных.

  1. Откройте MOV файлов в ImageJ для систем Windows,
    1. Установите Quick Time для Java с использованием пользовательских настроек из http://www.apple.com/quicktime/download.
    2. Установите плагин Quick Time с сайта ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/qt-capture.html).
    3. Импорт QTJava.zip (C: Program Files QuickTime QTSystem) в библиотеки EXTENSион ImageJ (.ImageJ JRE Lib EXT).
    4. Копировать также QTJava.zip в папку плагинов и переименовать его в QTJava.jar.
    5. Установите шесть скрипты, прикрепленные в папке макросов (ImageJ Plugins Макросы).
    6. Открыть ImageJ и скомпилировать и запустить плагин Quick Time, после близко ImageJ.
    7. Повторно ImageJ и откройте файл MOV, используя File> Import> с помощью Quick Time.
  2. Регулировка Видео
    1. После того как видео файл открывается в ImageJ, вырезать видео, чтобы получить постоянную разведку 2 мин с момента экспериментатор пипеткой на отдушки в клетку (T0). Определить кадр, соответствующий T0 и удалить предыдущие кадры, используя шагом 1 (ImageJ изображения Стеки ToolsSlice удаления). Используйте ту же команду, чтобы удалить все кадры, превышающие разведку 2 мин.
    2. Убедитесь, что клетка по центру и при необходимости использовать изображения> Transform> Команда Повернуть, чтобы выровнять его.
  3. СмотриО Обработка
    Примечание: Видео обработка полностью с помощью компьютера и использует макросы команд, сопровождающих эту статью.
    1. Для того, чтобы ограничить область на клетку в 127 пикселей х 218 пикселей размером запустить Шаг 1 макрос из плагинов> Макрос> Выполнить команду. Перемещение фиксированный прямоугольник над клеткой (рис 2, шаг 1).
    2. Обрезать область клетку на область интереса (ROI), используя Шаг 2 макроса (рис 2, этап 2).
    3. Используйте Шаг 3 макрос извлечь изображение мыши от фона путем присвоения пороговый сигнал, despeckling и фильтрации дисперсию сигнала. Значения выходных в оси Z участка показывают средние значения серого, соответствующий интенсивности тени мыши движущегося в окупаемости инвестиций в "водной камеры" при разведке 2 мин. Скопируйте результаты в таблицу с именем в соответствии с ROI в файл электронной таблицы (рис 2, шаг 3).
    4. Используйте Шаг 4 макросизвлечь средние серые значения мыши в ROI »запах камеры". Скопируйте результаты в таблицу с именем в соответствии с ROI в том же файле электронной таблицы, как в 4.3.3 (рисунок 2, стадия 4).
    5. В целях дальнейшего ограничения анализ движения мыши в ROI »воды периметру" использовать Шаг 5 макроса. Скопируйте результат на листе с именем в соответствии с ROI в том же файле электронной таблицы, как в 4.3.3 (рисунок 2, раздел 5).
    6. Чтобы ограничить анализ движения мыши в ROI »запах периметру" использовать Шаг 6 макрос. Скопируйте результат на листе с именем в соответствии с файлом ROI таблицы, как в 4.3.3 (рисунок 2, стадия 6).
    7. Процесс все видео и проверить на соответствие количества кадров в животных. Вот, запишите все животных для 1810 кадров, соответствующих геологоразведочных сессии 2 мин.
    8. Для каждого животного, и для каждого ROI рода кадры со средним серым васифилис больше, чем 0. Divide количество кадров значениями соответствует 1 секунду и получать секунды, проведенные в каждой ROI.

5. Статистический анализ

  1. Для каждого теста проверить однородность дисперсии внутри групп / генотипов с помощью теста Бартлетта, используя формулу, доступных на http://www.real-statistics.com/one-way-analysis-of-variance-anova/homogeneity-variances/.
  2. В тесте притяжения и избегания, проводить сравнения между времена провел с водой в сравнении с запахом в одной группе с помощью Т-тест ненаправленная Стьюдента предполагая равные или неравные отклонения в зависимости от результатов теста Бартлетта. Сравните время, проведенное с запахами, минус время, проведенное с водой между генотипами односторонним ANOVA с тестом после специальной Бонферрони.
  3. В тесте чувствительности анализа сравнения времени, проведенного с запахом вычитается из времени, затраченного с водоснаг среди групп в определенном разведении мочи по односторонним ANOVA с тестом после специальной Бонферрони. Сравните чувствительность среди групп на растущие концентрации запаха на 2-Way ANOVA с повторениями с теста после специальной Бонферрони.
  4. Взаимодействие между генотипами и лечения в тесте притяжения и избегания исследованы 2-полосная ANOVA с тестом после специальной Бонферрони.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тест измеряет восприятие влечение к арахисовое масло и избежания до 2 МБ кислоты. Три группы мышей протестированы и время, проведенное в "запах периметру" количественно по сравнению с водой. В тесте предпочтений, контрольная группа отображает значительное предпочтение запаха по сравнению с водой (т = 2,52 8, р <0,05). С другой стороны, группа Б не показывают какого-либо значительного влечение к арахисовое масло и проводит больше времени с водой (T = 6 3.22, р <0,05). Таким образом, он ведет с...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тесты, предложенные в этом протоколе позволяют оценить различные аспекты врожденного обонятельной поведения у мышей: восприятие запахов, дискриминации между запахов в сравнении с водой и чувствительность к запахам. Этот протокол может быть применен к любой запах в соответствии с предпочтениями и масштаба избегания показано ранее 15. Поскольку протокол основан на исследовательскую активность, важно, что у мышей не обнаруживают какой-либо ухудшение двигателя или беспокойство, которые могут повлиять на их движен...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конфликта интересов нет.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа финансируется Швейцарским национальным фондом (31_138429) и Фондом Synapsis для поддержки исследований болезни Альцгеймера.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Клетка для мышейItalplast (Италия)1144B36 см длина x 20,5 см ширина x 13,5 см высота
Подстилка из сколотой древесиныAbedd (Австрия)LTE E-001высотой 3 см
Арахисовое маслоMigros (Швейцария)NA1:10
2-метилмасляная SigmaAldrich (Швейцария)W269514Чистая
женская моча от фертильных самок той же линии мышейNANADilution series
CameraOlympus (US)Camedia C-8080MOV файлы
Quicktime для Java (Windows)Apple (СШАNAвидеоплагин для визуализации MOV файлов
ImageJ для WindowsNIH (США)NAОбработка и анализ видео
)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doty, R. L., Kamath, V. The influences of age on olfaction: a review. Cognitive Science. 5, 20(2014).
  2. Mesholam, R. I., Moberg, P. J., Mahr, R. N., Doty, R. L. Olfaction in neurodegenerative disease: a meta-analysis of olfactory functioning in Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. Archives of Neurology. 55 (1), 84-90 (1998).
  3. Moberg, P. J., et al. Olfactory Dysfunction in Schizophrenia: A Qualitative and Quantitative Review. Neuropsychopharmacology. 21 (3), 325-340 (1999).
  4. Kovács, T. Mechanisms of olfactory dysfunction in aging and neurodegenerative disorders. Ageing Research Reviews. 3 (2), 215-232 (2004).
  5. Barrios, F. A., et al. Olfaction and neurodegeneration in HD. Neuroreport. 18 (1), 73-76 (2007).
  6. Doty, R. L. Olfaction in Parkinson’s disease and related disorders. Neurobiology of Disease. 46 (3), 527-552 (2012).
  7. Doty, R. L., Shaman, P., Dann, M. Development of the University of Pennsylvania Smell Identification Test: a standardized microencapsulated test of olfactory function. Physiology & Behavior. 32 (3), 489-502 (1984).
  8. Devanand, D. p, et al. Olfactory Deficits in Patients With Mild Cognitive Impairment Predict Alzheimer’s Disease at Follow-Up. American Journal of Psychiatry. 157 (9), 1399-1405 (2000).
  9. Conti, M. Z., et al. Odor Identification Deficit Predicts Clinical Conversion from Mild Cognitive Impairment to Dementia Due to Alzheimer’s Disease. Archives of Clinical Neuropsychology. 28 (5), 391-399 (2013).
  10. Keller, A., Vosshall, L. B. Better Smelling Through Genetics: Mammalian Odor Perception. Current opinion in neurobiology. 18 (4), 364-369 (2008).
  11. Brai, E., et al. Notch1 activity in the olfactory bulb is odour-dependent and contributes to olfactory behaviour. European Journal of Neuroscience. 40 (10), 3436-3449 (2014).
  12. Larson, J., Hoffman, J. S., Guidotti, A., Costa, E. Olfactory discrimination learning deficit in heterozygous reeler mice. Brain Research. 971 (1), 40-46 (2003).
  13. Alonso, M., et al. Olfactory Discrimination Learning Increases the Survival of Adult-Born Neurons in the Olfactory Bulb. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10508-10513 (2006).
  14. Wesson, D. W., Keller, M., Douhard, Q., Baum, M. J., Bakker, J. Enhanced urinary odor discrimination in female aromatase knockout (ArKO) mice. Hormones and behavior. 49 (5), 580-586 (2006).
  15. Kobayakawa, K., et al. Innate versus learned odour processing in the mouse olfactory bulb. Nature. 450 (7169), 503-508 (2007).
  16. Witt, R. M., Galligan, M. R., Despinoy, J., Segal, R. Olfactory Behavioral Testing in the Adult Mouse. Journal of Visualized Experiments JoVE. (23), (2009).
  17. Lee, A. W., Emsley, J. G., Brown, R. E., Hagg, T. Marked differences in olfactory sensitivity and apparent speed of forebrain neuroblast migration in three inbred strains of mice. Neuroscience. 118 (1), 263-270 (2003).
  18. Page, D. T., et al. Computerized assessment of social approach behavior in mouse. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 3, 48(2009).
  19. Nyfeler, Y., et al. Jagged1 signals in the postnatal subventricular zone are required for neural stem cell self-renewal. Embo J. 24 (19), Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=16163386" 3504-3515 (2005).
  20. Tong, M. T., Peace, S. T., Cleland, T. A. Properties and mechanisms of olfactory learning and memory. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
  21. Steinlechner, S. Chapter 2.12 - Biological Rhythms of the Mouse. The Laboratory Mouse (Second Edition). , Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123820082000179 383-407 (2012).
  22. Corthell, J., Stathopoulos, A., Watson, C., Bertram, R., Trombley, P. Olfactory Bulb Monoamine Concentrations Vary with Time of Day. Neuroscience. 247, 234-241 (2013).
  23. Lehmkuhl, A. M., Dirr, E. R., Fleming, S. M. Olfactory assays for mouse models of neurodegenerative disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51804(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Olfactory TestingMouse BehaviorImageJ AnalysisOdor PreferenceOdor AvoidanceSensitivity TestComputer assisted AnalysisVideo RecordingHabituation ProtocolUrine Dilution

Related Articles