Количественное Цитозольные против вакуолярной<em&gt; Сальмонелла</em&gt; В первичных макрофагах дифференциальной проницаемости

Краткое содержание

Мы описываем количественное определение цитозольного и вакуолярного Salmonella typhimurium в макрофагах, полученных из костного мозга, с использованием дифференциальной пермеабилизации дигитонина.

Аннотация

Внутриклеточные бактериальные патогены могут размножаться в цитоплазме или в специализированных патогенов, содержащих вакуолей (PCVs). Чтобы добраться до цитозоль, бактерии, как Shigella Флекснера и Francisella novicida нужно вызвать разрыв фагосомы. В отличие, сальмонелла Typhimurium реплицируется в вакуолярной купе, известный как Salmonella -содержащего вакуоли (SCV). Однако некоторые мутанты Salmonella не поддерживать SCV целостность и, таким образом, выпущен в цитозоль. Процент цитозольного против вакуолярных бактерий на уровне отдельных бактерий может быть измерена дифференциальной проницаемости, также известный как фагосомы-анализ защиты. Подход делает использование имущества моющего средства дигитонина селективно связываться холестерина. Поскольку плазматической мембраны содержит больше холестерина, чем других клеточных мембран, дигитонин может быть использован, чтобы селективно проницаемыми плазматическую мембрану, оставляя внутриклеточных мембранбез изменений. Короче говоря, после инфицирования патогеном, экспрессирующих флуоресцентный белок-маркер (например mCherry среди прочих), плазматической мембраны клеток-хозяев в проницаемыми с короткой инкубации в дигитонин, содержащей буфер. Затем клетки промывали и инкубировали с первичным антителом (соединенный с флуорофора выбора), направленный против бактерии выбора (например, анти-Salmonella -FITC) и снова промывают. Если немаркированных бактерии используется дополнительная стадия может быть сделано, в котором все мембраны проницаемыми и все бактерии окрашивали с соответствующим антителом. После окрашивания, процент вакуолярных и цитоплазмы бактерий может быть количественно FACS или микроскопа путем подсчета одинарные или двойные-положительных событий. Здесь мы предлагаем экспериментальные детали для использования этой техники с бактерией Salmonella Typhimurium. Преимущество такого анализа является то, что, в отличие от других анализа, он обеспечивает количественную на уровне одного bacteРИА, и если анализировали с помощью микроскопии обеспечивает точное число цитозольного и вакуолярных бактерий в данной клетке.

Введение

Внутриклеточные бактериальные патогены репликации либо непосредственно в цитозоль клетки-хозяина, или в специализированных вакуолярных отсеков ^1. Во время начальной стадии инфекции большинство патогенных микроорганизмов получают усвоены либо фагоцитоза специализированных клеток (например, макрофагов), либо активно продвигает свою собственную поглощение в не-фагоцитирующих клеток. В фагоцитирующих клеток, как правило, фагосомы сливается с лизосомы сформировать деструкции отсек, где фагоцитированы частицы переваренной. Специализированный цитозольные бактерии, такие как Francisella novicida или Shigella Флекснера, бежать деградации phagosoma....

Протокол

1. дигитониновым Проба с mCherry-выражения сальмонеллы (FACS-анализа на основе)

1. Подготовка бактерии
   Примечание: Salmonella дикого типа SL1344 (Стрептомицин устойчива) выражают mCherry из плазмиды, кодирующей (pFPV mCherry под РПСМ промотора) используется в данном анализе. Бактериальный фагоцитоз и пролиферация, где не меняется при конститутивной экспрессии mCherry (данные не показаны) ^16.
   1. Инокуляции деформации за 1 день до инфекции в 3 мл LB среды с добавлением стрептомицина (90 мкг / мл) и ампициллином (100 мкг / мл, экспрессирующих вектора mCherry) в шейкере при 37 ° CO / N.
2. Покрытие клетки....

Результаты

На рисунке 1 и 2 приведены схемы дигитонинового анализа, описанные в протокол 1 и протокол 2, иллюстрирующий важные шаги в протоколе и полученные результаты. Рисунок 3 показывает типичные FACS результаты. Положительные и отрицательные элементы управления используются для установки ворот для mCherry + / FITC- бактерий (Salmonella) вакуолярный и mCherry + / FITC + бактерий (Salmonella) цитозольный. На основании этих воротах процент цитозольных и вакуолей бактерии могут быть .......

Обсуждение

Дифференциальный пермеабилизации это легко и надежный метод для анализа и количественной оценки субклеточную распределение бактериальных патогенов между вакуолярных отсеков и цитозоле. Анализ же успешно используется такими бактериями, как Francisella novicida ^2,4 и шигеллы Флекснера ^12. Тем не менее, поскольку многие внутриклеточные патогенов изменять или модифицировать хозяев эндомембранную структуры, надежность дигитониновым проницаемости должны быть определены на индивидуальной.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Дигитонин	Sigma	D5628 50	μ г/мл
PFA	mpbio	219998380
HEPES	Life Technologies	15630
Ацетат калия	Sigma	791733
MgCl2	Sigma	M8266
BSA	Sigma	A2153
антисальмонелла CSA-1-FITC	KPL	01-91-99-MG	1/500
антисальмонелла CSA-1	KPL	02-91-99-MG	1/500
антикальнексин	Enzo Lifesciences	SPA-860D	1/100
анти-PDI	Enzo Lifesciences	SPA-890	1/100
сапонин	Sigma	47036
Монтажная среда Vectashield	Vectorlabs	H-1200
Anti Rabbit антитела-488	Молекулярные Зонды	A-11070	1/500
глицин	Sigma	G8898
гентамицин	Life Technologies	15710-49	100 μ г/мл и 10 мкм; г/мл
Triton X-100	Promega	H5141
PBS	Gibco	20012-019
DMEM	Sigma	D6429
NEAA	Amimed	5-13K00-H
LSM700 Конфокальный микроскоп	Zeiss		визуализация сделана с 63X
FACS Fortessa	BD технологии		обнаружения mCherry 610 нм
	обнаружения FACS Fortessa	BD	FITC 530 нм

Технологии