Методическая статья

Ловушка-RC, переводя рибосом Affinity Очистка от редких клеточных популяций

DOI:

10.3791/52985

⸱

10 сентября 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1University of Clermont-Ferrand, 2Memorial Sloan Kettering Cancer Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) способна захватывать трансляцию мРНК, специфичную для типа клетки. В этой статье мы сообщаем о первом протоколе TRAP, посвященном выделению мРНК в популяциях редких клеток эмбрионов дрозофилы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Измерение уровней мРНК в процессе трансляции в отдельных клетках дает информацию о белках, участвующих в клеточных функциях в данный момент времени. Протокол, получивший название Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP), способен захватывать этот процесс трансляции мРНК специфичным для типа клетки способом. Основываясь на аффинной очистке полисом, несущих меченую рибосомную субъединицу, TRAP может быть применен для транслатомного анализа в отдельных клетках, что позволяет сравнивать типы клеток в ходе процессов развития или отслеживать прогресс развития заболевания и влияние потенциальных методов лечения на молекулярном уровне. В этой статье мы представляем оптимизированную версию протокола TRAP под названием TRAP-rc (rare cells), предназначенную для идентификации вовлеченных в трансляцию РНК из популяций редких клеток. TRAP-rc был валидирован с использованием системы нацеливания Gal4/UAS в ограниченной популяции мышечных клеток у эмбрионов дрозофилы. Этот новый протокол позволяет восстанавливать РНК, специфичную для клеточного типа, в количествах, достаточных для глобального анализа экспрессии генов, такого как микрочипы или РНК-секвенирование. Надежность протокола и большие коллекции драйверов Gal4 делают TRAP-rc очень универсальным подходом с потенциальными применениями в исследованиях генома клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Понимание того, как клетки приобретают специфические свойства во время разработки является решающим для того, чтобы оценить сложность органов и их потенциальной эволюции в сторону патологических условиях. Существует большой толчок исследование, чтобы расшифровать генные регуляторных сетей которые усиливают спецификацию и дифференцировку клеток по unrevealing глобальных профилей экспрессии генов, связывающий статус Поль II, размещение транскрипции фактором регуляторных последовательностей или пост-трансляционных модификаций гистонов.

Для оценки экспрессии генов на глобальном уровне микрочипов и РНК-след подходы используются. Микромножества позволяют обнаруживать мРНК изобилие, тогда как РНК-SEQ лучше приспособленным информирования о различных типах РНК, включая кодирование и некодирующих РНК, как микроРНК, lncRNAs или snRNAs. Тем не менее, эти методы не могут отличить активно транскрипции, стационарное мРНК, активно-перевод мРНК, и мРНК ввода процесс деградации. Измерение установившегося улели уровни мРНК, как известно, плохой оценка протеома композиции 1-3. Наоборот, выявление активно-перевод мРНК дает более точную картину производства белка.

Тем не менее, транскриптомных исследования в основном велись на уровне организма в целом, сравнивая прибыль или потерю функций специфического фактора дикого типа состояния 4-7 или рассеченной ткани, что делает профили экспрессии гена трудно интерпретировать. Последние достижения в области ориентированных на инструменты клеток, аффинной очистки и улучшения чувствительности в настоящее время позволяют выполнять генома анализы на небольших популяций клеток или даже отдельных клеток в живом организме.

У Drosophila, большие коллекции трансгенных линий позволяют конкретную временную и пространственную ориентацию различных тканей и клеточных субпопуляций с помощью системы GAL4 / UAS 8-10, дающий более точные количественное молекулярные механизмы, необходимые для функционирования клеток.

Среди вновь разработанных подходов полисом профилирование путем фракционирования была описана как способ захватить активно-перевод РНК 11. Этот метод основан на градиенте сахарозы центрифугирования позволяет выбор полисом фракции и определения мРНК переводится генома при анализе с микрочипов или глубокой последовательности. Полисом изоляция может быть соединен с нуклеазой для идентификации рибосомных следы, соответствующие фрагментам РНК защищенных рибосом в процессе перевода 12. Рибосомальная футпринтинга увеличивает точность количественного перевода РНК и разрешения последовательность уровня РНК рибосом и позиционирования, позволяет измерить скорость перевода. Тем не менее, на сегодняшний день она не применяется к изоляции клеток, специфической translatomes, в основном из-за сильного снижения доходности РНК, полученной в конце рибосомы процесса Footprinting. Учитывая, что выбор размера РНК может генерировать ложные потенциальную р-ositives из различных РНП, которые также могут быть защитными РНК аналогичным образом, дальнейшее развитие необходимы для улучшения рибосомальной Footprinting и адаптировать его к клеточно-специфической подходов.

Одним из таких методов, называемый Перевод Рибосомы Аффинная очистка (TRAP) был описан в 2008 году Heiman др. и прикладной для изоляции translatome из подмножества нейронов у мышей. По эпитоп пометки рибосомного белка в клетки типа-специфическим образом, полисом может быть выборочно очищен без кропотливой этапе клеток диссоциации и сортировки. В этом случае, 60S рибосомных белков L10A на поверхности рибосомы был помечен EGFP 13. С 2008 года несколько исследований использовали этот метод у разных видов, от мышей 14-19 в X. Laevis 20,21, 22,23 и данио арабидопсиса THALIANA 24. Метод TRAP также была адаптирована к модели Drosophila и используется для PuriFY типа клеток-специфических мРНК из нейронов и астроцитов 25 26. Универсальный двоичная система GAL4 / UAS был использован, чтобы выразить GFP-тегами RpL10A в ткани-специфическим образом. Главы взрослых мух рассекали выполнять выбор полисом от нервных клеток (мишенью пан-нейронных водителя Elav-Gal4) и изолированных РНК секвенировали. Большое количество повышающей регуляции генов соответствовали группам, указанным как известно, выражается в нервной системе, что свидетельствует о том, что подход имеет хорошую специфичность и побуждая нас, чтобы приспособить его к редким клеточных популяций (менее 1% клеток) присутствует в развивающихся эмбрионах Drosophila ,

В рамках модели дрозофилы, эмбриональная стадия является модель выбора для изучения процессов развития, как молекулярные актеры и морфогенетические движения эволюционно консервативны. Единственный тканеспецифические транскриптомных подходы, проведенные до сих пор в этой модели были выполнены с помощью мобильного или ядерная такrting и только смогли изучить стационарный транскриптом 27-31, создавая потребность в методах, посвященных ткани / клеток конкретных профилирования translatome в летучей эмбриона. Здесь мы сообщаем первый протокол TRAP, посвященный эмбрионов дрозофилы. С помощью этого метода, занимается-в-трансляции мРНК в очень ограниченной популяции клеток около 100 клеток на мышечные эмбриона успешно выделен с высоким качеством и специфичности. Двоичный GAL4 / система БАС используется для управления экспрессией GFP-тегами RpL10A в субпопуляции мышц без токсичности, не очевидные фенотипы или задержка развития, как показано ранее 25. Эмбрионы Drosophila обладают 30 мышцы за hemisegment, что приведет к мускулатуре личинки. При использовании регуляторную область обнаруженную в непосредственной близости от гена идентичности сутулость, 6 из 30 мульти-дро мышц ориентированы. В этом анализе, рибосомы, иммобилизованного на мРНК с помощью перевода удлинениеингибитора циклогексимид. Цитозольные экстракты затем используется для аффинной очистки с GFP покрытых антителами магнитных шариков. Качество очищенной РНК проверены с использованием Bioanalyzer. Количественный ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-КПЦР) был использован для определения специфичности и чувствительности изоляции мРНК и показали, что наш оптимизированный протокол является высокоэффективным.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fly Generation линия

  1. Создать два разных конструкций. В первом конструкции, RpL10A кДНК (рибосомной субъединицы белка L10A) клонировали ниже GFP в pUASP-PL-GFP-Гюнтер плазмиды (модифицированный вариант из 32). Использование зародышевой линии промотора позволяет более поливалентного использование трансгенной линии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Получить второй конструкцию путем клонирования регуляторную последовательность вождения тканеспецифичную экспрессию гена сутулиться вверх по течению GAL4 (TF), используя pPTGAL4 плазмиды.
  2. Вводите плазмиды отдельно в ж 1118 мух и вставьте конструкции в лету генома путем введения Р-элемента (в соответствии со стандартной процедурой) 33.
  3. Выберите трансформантов для того, чтобы восстановить летать линии с конструкциями на двух разных хромосомах. Последняя строка ловушка создается путем объединения этих двух линий (генетические кресты) для того, чтобы получить один двойной трансгенной стабильной линии. F0: W; Суо, БАС EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bх мас; суо / SCU; сутулиться Gal4 / TM6B. F1: W-; Суо, БАС EGFP :: RpL10A; Сутулиться Gal4 / TM6B. Массово усилить этот линии и собирать желании, постановочные эмбрионов.

2. эмбрионов

  1. Подготовка 8 больших клетки цилиндрическая населения, содержащие около 40 г молодых мух в клетку (около 180,000 мух / клетку).
  2. Продолжайте так называемых предварительных скрутки, которые позволяют мухи, чтобы очистить развивающиеся эмбрионы из их яйцеводы. Для этого, лежала мух в течение 1 часа на двух 11 см диаметр чашки Петри, содержащие смесь затвердевшего агара и виноградного сока и покрывают ⅓ поверхности с свежеприготовленные дрожжевой пасты. После 3 обменов виноградного сока пластины собирать реальные эмбрионов на подобных свежеприготовленные пластин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации будет варьироваться в зависимости от развития временного окна учился.
  3. Удалить пластины из клеток и оставить их при той же температуре в течение времени, необходимого для получения правильной стадии развития (например, 3 ч кладки + 10 ч AdditРациональная Инкубационный дает эмбрионы из стадии 10-13 ч после откладки яиц (AEL)). Ресуспендируют содержание плита (эмбрионы, дрожжи пасты, Мертвые мухи) с 50 мл воды, используя кисти.
  4. Пройти через серию сит (700 мкм, 355 мкм, 112 мкм), чтобы отделить эмбрионы из мертвых мух и остальные части тела, и собирают эмбрионов удерживается на меньшего диаметра сито, затем кратковременно мыть в деионизированной воде. Не следует использовать более чем 18 пластин в сборе, как это может засорить сита.
  5. Dechorionate эмбрионов в 4,5% хлорной в деионизированной воде в течение 2 мин и тщательно промойте деионизированной водой в течение 30-60 сек. Инкубируйте эмбрионов в PBS 0,01% Tween 20, 100 мкг / мл циклогексимида, в течение 5-10 мин при комнатной температуре при перемешивании.
  6. Сухие эмбрионы на целлюлозных абсорбирующих листов и передавать их на микроцентрифужных труб. Взвесьте трубы и флэш-заморозить эмбрионы путем погружения в жидкий азот. На этой стадии высушенные эмбрионы могут быть сохранены в течение нескольких месяцев при температуре -80 ° С.
3. Подготовка магнитных шариков, соединенных с GFP антитела

  1. Тщательно ресуспендирования белка G магнитных шариков в оригинальной бутылке нежный агитации.
  2. Передача 90 мкл из бисера в РНКазы без трубки и собирать их на магнит (30-60 сек). 90 мкл шариков необходимо выполнить иммунопреципитации (IP) 1 мл лизата, содержащие 60-80 мг / мл протеинов. Уважайте отношения для предотвращения насыщения шарик. Используйте несколько трубок в соответствии с количеством белка.
  3. Бисер Вымойте с 1 × PBS 0,01% Tween 20 (500 мкл) и собирать шарики на магните, чтобы отбросить супернатант. Добавить 30 мкг GFP антител в 350 мкл PBS 0,01% Tween 20 с шариками и инкубируют при медленном конце над конца смесительной в течение 30 мин при комнатной температуре.
  4. Сбор шарики на магните (30-60 сек), отбросить супернатант и промыть в 500 мкл буфера для экстракции полисом (HEPES 10 мМ, KCl 150 мМ, MgCl 2 5 мм, 0,5 мм DTT, 1% Тритон, циклогексимид 100 мкг / мл , Protease ингибитор 1 ×, РНКазы ингибитор 100 U).
  5. Соберите бусы на магните и добавить 500 мкл блокирующего буфера (BSA 0,1 мкг / мкл дрожжевой тРНК, 0,1 мкг / мкл, гликоген 0,1 мкг / мкл в буфере для экстракции полисом).
  6. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре и повторить этот шаг один раз свежей блокирующем буфере.
  7. Соберите бусы на магните и промыть в 500 мкл буфера для экстракции полисом, то вспомните шарики и немедленно приступить к шагу иммуноочистки (раздел 6).

4. Подготовка лизата

  1. Перед началом установки программы на разнонаправленного быстрая скорость бисером мясорубку: 2 × 10 сек при 5000 оборотов в минуту, 15 секунд паузы. Передача высушенные зародыши (1,5 г) в 15 мл пробирки prechilled на льду, содержащей полисом экстракционного буфера, и гомогенизируют немедленно. Однородный 1,5 г зародышей в 4 мл буфера для экстракции полисом.
  2. Распространение гомогенизировали эмбрионов в двух prechilled 2 мл пробирки и растереть ЭмбриОС, запустив программу гомогенизатора. Передача лизата в чистые prechilled микроцентрифужных пробирках на льду и подготовить postnuclear супернатант центрифугированием при 4 ° С в течение 10 мин при 2000 г.
  3. Передача супернатант на свежий prechilled микроцентрифужных трубки на льду, добавление 1/100 объема пробы 10% Nonidet P-40 в супернатанте (конечная концентрация = 0,1%), и смешать его осторожно переворачивая пробирку.
  4. Пульс-центрифуги образец в minifuge для сбора жидкости на дне пробирки, добавить 1/9 объема пробы 300 мм 1,2-Diheptanoyl-Sn-глицеро-3-фосфохолин (DHPC) (конечная концентрация = 30 мм ), смешать его осторожно переворачивая пробирку, и инкубируют смесь на льду в течение 5 мин (смесь путем обращения в несколько раз во время инкубации).
  5. Подготовьте после митохондриальной супернатант центрифугированием при 4 ° С в течение 10 мин при 20000 г. Измерение концентрации белка по методу Брэдфорда: концентрация в лизате должна быть в пределах 60-80 мг / мл. ТАке супернатант в свежий prechilled микроцентрифужных трубки и немедленно приступить к стадии предварительного поглощения (раздел 5).

5. Предварительно поглощения

  1. Тщательно ресуспендирования магнитных шариков от осторожном перемешивании и передачи 30 мкл гранул, в микроцентрифужных трубки при комнатной температуре (30 мкл бисер / 1 мл лизата) эмбриональных.
  2. Сбор шарики на магните, пипетки от надосадочной жидкости и ресуспендирования бисером в полисом экстракционного буфера (500 мкл). Сбор шарики на магните, добавить эмбриональных лизата и инкубируют в течение 1 ч при 4 ° С на ротатора.
    1. Удалить шарики и держать супернатант на льду в течение стадии иммуноочистки. Перед иммуноочистки, держать 100 мкл супернатанта (входные), чтобы сравнить глобальной образец РНК с РНК образца собранной после иммуноочистки, по RT-КПЦР например.

6. Иммуноочистка

  1. Добавить 1 мл (что соответствует 60-80 мг / мл белка) изпредварительно абсорбируют лизата к РНКазы пробирку, содержащую 90 мкл блокированных бусин, соединенных с GFP антитела. Инкубируйте образцы при температуре 4 ° С в течение 2 ч при осторожном конец поверх конца перемешивания в трубчатой ​​ротатора. Кроме того, выполнение инкубации o / n при 4 ° С.
  2. После инкубации, собирать шарики на магните. Использование minifuge вращаться вниз шарики, то ресуспендирования их в 500 мкл промывочного буфера (Hepes 10 мМ, KCl 350, MgCl 2 5 мм, Nonidet P-40 1%, DTT 0,5 ммоль, циклогексимид 100 мкг / мл, РНКазы ингибитор 100 ед ) и собрать их на магните. Повторите этот шаг еще два раза.
  3. Изменить шарики на новый prechilled РНКазы трубки и мыть два раза. Соберите бусы на магнит, и приступить к добыче РНК, добавив 1 мл TRIzol непосредственно с шариками и следуйте инструкциям изготовителя.

7. РНК Очистка и оценка качества

  1. Используйте комплект RNeasy Micro в соответствии с инструкциями изготовителя. По завершении, Elutе РНК с (х) мкл РНКазы свободной воды. Теплый течение 2 мин при 60 ° С, и магазин быстро замораживали образцы при -80 ° С. Проверьте качество РНК с помощью Bioanalyzer (следуйте инструкциям производителя).
  2. Чтобы проверить специфичность TRAPed РНК, выполнять обратную транскрипцию 3 нг очищенной РНК (вход и IP) в соответствии с инструкциями изготовителя (надстрочными III). Используйте кДНК, полученной для количественной ПЦР с использованием геноспецифических наборы праймеров.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дрозофилы эмбриональных соматических мышечная система состоит из 30 мышц в hemisegment, и каждая мышца имеет определенный набор свойств: код генов, удостоверяющих личность, должность, номер событий термоядерных, местах прикрепления и иннервации. Определение перевод мРНК в определенном мышц подмножества даст информацию о белках, необходимых для формирования этих специфических характеристик мышц. Использование метода TRAP основе, РНК из субпопуляции мышц экспрессировать ген идентичность сутулость очищали (1А-В). Одной из основных проблем этого подхода является качество и специфичность выделенной РНК. Оптимизированный протокол сообщили здесь включен систематическое восстановление высококачественной РНК оценивается с анализом Bioanalyzer. Полученный профиль показывает не деградация РНК (рис. 1в)

В других исследованиях, разработанных по методу ловушка, были подняты вопросы по специфике данных. Здесь мы яmprove метод для подавления фона, связанного с неспецифического связывания РНК с гранулами или трубок и оптимизации промывочным буфером. Для того чтобы оценить уровень фонового и эффективность изоляции сутулость-экспрессирующих клеток, мы привели RT-КПЦР испытания на 3 повторов одного и того же эмбриональной стадии. Сложите-обогащения 4 различных генов (Mef2, сутулятся, Просперо, soxNeuro) были рассчитаны по сравнению с входом и нормализуется против гена RpL32 (рис 1D). Эти результаты показали, 2.3-кратное обогащение пан-мышечных MEF2 генных и 5,6-кратным обогащением гена сутулиться. В противоположность этому, эти два гена, выраженные в нервной системы были истощены сравнению с входом. Очень похожие значения кратные изменения наблюдались на 3 биологических повторяет, демонстрируя, что протокол является надежной. С водителем сутулиться-Gal4 и, начиная с 1,5 г, около 1.5x10 ^ 6 эмбрионов были получены, которые содержат 100 GFP клеток эмбриона / (в общей сложности 150 × 10 ^ 6 положительнымклетки).

После запуска эксперимента ловушка, выход составляет около 25-45 нг специфической РНК в зависимости от стадии-на-интерес. Этот материал достаточно, чтобы запустить анализ микрочипов или РНК-SEQ, используя протокол усиления построить РНК-след библиотеку. Эффективность будет сильно зависеть от прочности используемого драйвера, чтобы выразить RpL10A-EGFP.

figure-results-1
Рисунок 1. Качество и оценка специфика TRAP-изолированными РНК из сутулиться-GAL4> эмбрионов UASRpL10A-EGFP.

(АВ) Конфокальные образы этап-16 эмбриона, показывая выражение RpL10A-EGFP в частности, в шести сутулиться мышечных клеток на hemisegment (A). Со-локализация RpL10A-EGFP с общей мышечной маркера Beta3tubulin наблюдается на картинке слияния (B). (С) Контроль качества TRAPed РНК РАн на Bioanalyzer показывая целостности и рРНК 18S и 28S. Анализ (D), РТ-КПЦР показывая высокую специфичность ловушки-изолированные экспериментов мРНК на 3 биологических повторяет сценических-16 эмбрионов. Сложите изменение рассчитывается по сравнению с входом и нормализуется против гена RpL32. Mef2 стенограммы присутствующие во всех мышечных линий являются 2,3 раза обогащенного по сравнению с входом в то время как более ограниченные сутулиться транскрипты 5,6 раза обогащенного. Нервные клетки, экспрессирующие Просперо и soxN гены истощены в 2,2 раза и 5,5 раза соответственно,. Усы представляют стандартное отклонение (п = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта статья описывает модифицированный протокол Переводы рибосом аффинной очистки (название «Ловушка-RC"), посвященный изучению редких клеточных популяций в эмбрионах дрозофилы. Информация предоставляется на основных этапов для успешного выделения специфической РНК с выходом пригодных для микрочипов или РНК-SEQ анализа, т.е., 1) количество биологического материала, необходимого и оптимизированной процедуры эмбриона лизиса и экстракции полисом; 2) бисер / антитело к лизатов соотношениях для оптимального иммунопреципитацией; 3) шаги, позволяющий уменьшить фона в том числе буферной композиции стирки таким образом, чтобы работать TRAP-RC эксперименты с высокой специфичностью и чувствительностью.

Этот протокол дает воспроизводимые данные делает его легко применены к другим типам клеток. Эта методика дает возможность проанализировать дифференциального экспрессию генов на уровне активно-переводе мРНК и, следовательно, проложить дорогу к пониманию экспрессию белка в спецификации БР типа клеток на определенном временном окне. Заметим, однако, что белок обилие будет зависеть от скорости процессов перевода и деградации. Основным ограничением метода TRAP является невозможность для измерения содержания белка в точном количественном выражении или обнаружить посттрансляционную модификации. Улучшение количественного путем измерения плотности рибосом вдоль тела мРНК и, тем самым, в ячейки типа-специфическим образом можно сделать TRAP в сочетании с рибосома Footprinting очень мощный инструмент. В недавней работе 34, эта комбинация была выполнена в человеческих эмбриональных почек 293 клеток. Авторы побежал нуклеазную Footprinting затем с помощью аффинной очистки индуцибельного биотинилированной виде RpL10A использованием стрептавидином шарики. Это доказательство принципа, что можно выполнить с рибосомами Footprinting в целом организме, а нацелены на конкретную тип клеток, ограничение быть количество биологического материала, необходимого для этой цели.

"> Выполнение TRAP эксперименты параллельно с глобальными транскриптомных анализов позволит отслеживать пропорции между вновь транскрипции и actively- перевод РНК. Это будет глубоко информативным потенциальных посттранскрипционных механизмов, происходящих в конкретных контекстах развития или конкретных клеточных популяций -по микроРНК, например.

В заключение, ловушка является высокоэффективным, специфичным и чувствительным методом для выявления РНК, связанные с активно-переводе рибосом в порядке клеточно-специфической. Этот метод может быть использован в самых разнообразных организмов и типов тканей. Новый протокол TRAP-RC описано здесь был оптимизирован для редких клеточных популяций (менее 1% от общего числа клеток) и на количество конечного материала, достаточного для последующих анализов на уровне целого генома.

Возможное ограничение этого метода является требование сильной водителя, чтобы произвести отмеченных рибосомы в количестве, достаточном для компете с эндогенными нетегированных них в адресной типа клеток. В недавнем исследовании 25, авторы оценкам 10-30% соотношение меченых против нетегированных рибосом.

Чтобы преодолеть эту проблему растущего БАС-RpL10A-EGFP количество копий должно значительно улучшить этот баланс. Кроме того, добавление к описанным генетического фона в UAS-GAL4 трансген будет усиливать выработку белка GAL4 и косвенно повышать экспрессию RpL10A-EGFP. Это должно способствовать более заполняемость меченых рибосом на мРНК.

Обратите внимание, что это уже эффективный подход может быть даже более мощным, адаптации дополнительные методы, чтобы принести больше количественный аспект или, чтобы обнаружить и распутать молекулярные механизмы, которые необходимы для контроля экспрессии генов.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Николя Аллегра, Мод Пейни и Жана-Филиппа Да Понте за их отличную техническую помощь. Эта работа была поддержана Национальным агентством исследований (ANR-JC-CARDIAC-SPE), стартовым грантом INSERM, ANR ID-CELL-SPE грантом, Equipe FRM и грантом AFM 15845.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
HEPESСигма H4034-1006
1,2-дигептанил-sn-глицеро-3-фосфохолин Avanti Polar Lipids850306P
Гликогентермо научный R0561
Очищенный BSA 100X BiolabsB9001
Дрожжевые тРНК SigmaR5636
Супер РНКаза В AmbionAM2694
Антитело GFP клон N86/38UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated75-132 
Nonidet P40 Roche11754595001
Precellys 24 Lysis гомогенизация Бертин Технолоджи
Нуклеазная водаNalgene
Dynabeads ProteinGInvitrogen10004D
Хлорид калия (KCl)Прикладная биосистема 
Хлорид магния (MgCl2) Прикладная биосистема 
Ватдин целлюлозный небеленый ВВР115-2597 
Сита 112, 355, 710 мкм;Retsch
TRiZol Invitrogen15596-018
MagRack 6GE HealthCare 
Наконечники фильтра с низким уровнем связывания ClearLine
Rnase free tube 1,5 млClearLine390689DD
Твин 20 Биореагент Fischer BP337-500
Циклогексимид Сигма C1985
Таблетки ингибитора протеазы, Mini-Complete, без ЭДТА Рош11836170001
AM96406AM9530628948964

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Molecular bioSystems. 5, 1512-1526 (2009).
  2. Maier, T., Guell, M., Serrano, L. Correlation of mRNA and protein in complex biological samples. FEBS letters. 583, 3966-3973 (2009).
  3. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (1038).
  4. Junion, G., et al. Genome-wide view of cell fate specification: ladybird acts at multiple levels during diversification of muscle and heart precursors. Genes. 21, 3163-3180 (2007).
  5. Jakobsen, J. S., et al. Temporal ChIP-on-chip reveals Biniou as a universal regulator of the visceral muscle transcriptional network. Genes. 21, 2448-2460 (2007).
  6. Cunha, P. M., et al. Combinatorial binding leads to diverse regulatory responses: Lmd is a tissue-specific modulator of Mef2 activity. PLoS genetics. 6, e1001014(2010).
  7. Sandmann, T., et al. A core transcriptional network for early mesoderm development in Drosophila melanogaster. Genes, & development. 21, 436-449 (2007).
  8. Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512, 91-95 (2014).
  9. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 9715-9720 (2008).
  10. Gallo, S. M., et al. REDfly v3.0: toward a comprehensive database of transcriptional regulatory elements in Drosophila. Nucleic acids research. 39, D118-D123 (2011).
  11. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).
  12. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature protocols. 7, 1534-1550 (2012).
  13. Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
  14. Doyle, J. P., et al. Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types. Cell. 135, 749-762 (2008).
  15. Dougherty, J. D., Schmidt, E. F., Nakajima, M., Heintz, N. Analytical approaches to RNA profiling data for the identification of genes enriched in specific cells. Nucleic acids research. 38, 4218-4230 (1093).
  16. Fomchenko, E. I., et al. Recruited cells can become transformed and overtake PDGF-induced murine gliomas in vivo during tumor progression. PloS one. 6, e20605(2011).
  17. Helmy, K., et al. Identification of global alteration of translational regulation glioma in vivo. PloS one. 7, e46965(2012).
  18. Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
  19. Drane, L., Ainsley, J. A., Mayford, M. R., Reijmers, L. G. A transgenic mouse line for collecting ribosome-bound mRNA using the tetracycline transactivator system. Frontiers in molecular neuroscience. 7, 82(2014).
  20. Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
  21. Watson, F. L., et al. Cell type-specific translational profiling in the Xenopus laevis retina. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 241, 1960-1972 (2012).
  22. Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13416-13421 (2013).
  23. Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).
  24. Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. Cell-type specific analysis of translating RNAs in developing flowers reveals new levels of control. Molecular systems biology. 6, 419(2010).
  25. Thomas, A., et al. A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila. PloS one. 7, e40276(2012).
  26. Huang, Y., Ng, F. S., Jackson, F. R. Comparison of Larval and Adult Drosophila Astrocytes Reveals Stage-Specific Gene Expression Profiles. G3. , (2015).
  27. Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genome Res. 22, 766-777 (2012).
  28. Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic acids research. 40, 9691-9704 (2012).
  29. Dobi, K. C., Halfon, M. S., Baylies, M. K. Whole-genome analysis of muscle founder cells implicates the chromatin regulator Sin3A in muscle identity. Cell reports. 8, 858-870 (2014).
  30. Salmand, P. A., Iche-Torres, M., Perrin, L. Tissue-specific cell sorting from Drosophila embryos: application to gene expression analysis. Fly. 5, 261-265 (2011).
  31. Busser, B. W., et al. Molecular mechanism underlying the regulatory specificity of a Drosophila homeodomain protein that specifies myoblast identity. Development. 139, 1164-1174 (2012).
  32. Rorth, P. Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of development. 78, 113-118 (1998).
  33. Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
  34. Ingolia, N. T., et al. Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes. Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

TRAP rcGFPBioanalyzerRT qPCR

Похожие статьи