Методическая статья

Адаптация процесса электропрядения чтобы обеспечить три уникальных условиях для Tri-слоистые In Vitro Модель дыхательных путях стены

DOI:

10.3791/52986

⸱

31 июля 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Drug Delivery and Tissue Engineering, University of Nottingham, 2Laboratory of Biophysics and Surface Analysis, School of Pharmacy, University of Nottingham, 3Division of Immunology and Allergy, School of Molecular Medical Sciences, University of Nottingham, 4Division of Respiratory Medicine, School of Clinical Sciences, University of Nottingham, 5NIHR Respiratory Biomedical Research Unit, University of Leicester, 6School of Sport, Exercise, and Health Sciences, Loughborough University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Достижения в технологиях биоматериалов позволяют разрабатывать трехмерные многоклеточные конструкции. Мы разработали протоколы электроспиннинга для получения трех отдельных скаффолдов для культивирования основных структурных клеток дыхательных путей, чтобы обеспечить 3D-модель бронхиольной стенки дыхательных путей in vitro.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Электроспиннинг - это легко адаптируемый метод получения пористых 3D-волокнистых каркасов, которые можно использовать в культуре клеток in vitro. Изменение собственных параметров в процессе позволяет в высокой степени контролировать характеристики каркаса, включая диаметр волокна, выравнивание и пористость. Путем разработки скаффолдов с размерами и топографией, аналогичными органо- или тканеспецифическим внеклеточным матрицам (ВКМ), можно создать микроокружение, репрезентативное для тех, воздействию которых клетки подвергаются in situ.

В качестве модельной ткани была выбрана стенка бронхиолы дыхательных путей, состоящая из трех основных микросред. Используя в качестве ориентира децеллюляризованную ЭКМ дыхательных путей, мы электроспиннинговали неразлагаемый полимер полиэтилентерефталата (ПЭТ) по трем различным протоколам для получения трех отдельных электроспиннинговых скаффолдов, оптимизированных для культуры эпителиа, фибробластов или гладкомышечных клеток. Используя коммерчески доступную биореакторную систему, мы стабильно совместно культивировали три типа клеток, чтобы получить in vitro модель стенки дыхательных путей в течение длительного периода времени.

Эта модель подчеркивает потенциал использования таких методов в диагностических исследованиях in vitro, изучающих важные механизмы межклеточных перекрестных помех или оценивающих новые фармацевтические мишени, предоставляя соответствующую платформу, позволяющую культивировать полностью дифференцированные взрослые клетки в 3D, тканеспецифичных средах.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Области регенеративной медицины и тканевой инженерии быстро развивается, с прорывами в трахеи и почек регенерации два заметных последних достижений. Биоматериалов, разработанные в тканевой инженерии становятся все более доступными, с возможностями для передачи таких протоколов до менее специализированных лабораториях. Одно поле заливают пользу путем увеличения использования биоматериалов в пробирке диагностики.

В пробирке исследования являются важной платформой для расследования внутриклеточных сигнальных путей в пределах одного типов клеток, и помогли очертить механизмы, лежащие в основе многочисленных pathophysiologies болезни. Эти исследования как правило, зависят от одного типа клеток культивируются в монослое на тканевой культуры пластика (TCP); двумерное (2D) жесткая поверхность пор менее эластичной и пористой, чем трехмерных (3D) среды клетки подвергаются воздействию в ткани или органе. Животные модели традиционно электроннойmployed, чтобы подтвердить эффекты, обнаруженные в пробирке и перевести всей ткани, а также может быть использован в качестве доклинических платформы для исследования заболеваний человека. Тем не менее, различия межвидовых подорвать эту зависимость на животных моделях в нашем понимании человеческой болезни -. Например, сколько понимание астмы болезни легких основан на модели мыши, несмотря на присущих различий между человеческим состоянием и этой модели в том числе мало доказательств из тучных клеток инфильтрации дыхательных путей гладкой мышечной пучка, или способности к развитию спонтанного заболевания у животного модели 3,4. Есть также этические соображения, касающиеся использования животных моделях, с "3RS" стандарт "замены, уточнения и сокращения» экспериментов на животных поощряется в Великобритании и других странах.

Привлекательной альтернативой будет повторение человеческих тканей в лабораторных структуры создающейс исследовать кооперативный характер между взрослыми типов клеток человека в единое целое. Клетки существуют в 3D многоклеточных структур в тканях, каждый в уникальном микро-среды. Культивирование клеток на TCP позволяет только культуру клеток монослоя, не в состоянии воспроизвести эту среду, или предоставить возможности для мульти-клеточной культуре. Биоматериалов продвижение дает возможность развиваться как природные, так и синтетические 3D платформы для клеточной культуры. Decellularized ЕСМ могут быть использованы для 3D культуры клеток при recellularized с других типов клеток, включая стволовые клетки 1, однако такие протоколы могут быть сложными и трудоемкими, при наличии ограниченных ткани и в значительной степени из нечеловеческого происхождения. Другие протоколы позволяют больший контроль над клеточными условиях, созданных, например, наноимпринтной, осаждения ECM, клетки листовых технологий, или электропрядения. Электропрядения создает нетканые 3D пористые коврики волокон диаметром от нанометра до микрометра, гeplicating природные размеры ECM. Все чаще используется Electrospun леса, как 3D культивирования клеток платформ -. Манипуляция электропрядения параметров позволяет контролировать сложную лесов характеристик, таких как размер пор, диаметр волокна, топографии и выравнивания поверхности и химии. Изменения таких параметров, как было показано, непосредственно влияют на клеточную адгезию и рост, когда клетки культивировали в изоляции.

Эти преимущества были использована в настоящем исследовании, чтобы позволить культивирование нескольких типов клеток в виде одного 3D конструкции ткани, используя бронхиолы дыхательных путей в качестве модели 3D структуры ткани. Бронхиола стенка состоит из трех основных регионах (рисунок 1). Слизистая оболочка дыхательных путей, где эпителиальные клетки сидеть на воздух-жидкость интерфейса (ALI), обеспечивая важный барьер к внешней среде. Они проживают на ретикулярная базальной мембраны (УОР), плотно компактный ЕСМ состоит в основном из collagан И.В., perlecans и ламинины. Суб-слой слизистой находится непосредственно под слизистой, более пористой области, состоящей из нескольких типов клеток, включая фибробласты, миофибробластов и Лейкоциты проникают в условиях болезни. Наконец гладкомышечных пучков обернуть вокруг дыхательных путей в виде спирали, и состоят из выровненных листов гладких мышц дыхательных путей (ASM). Это относительное состояние сократительной гладкомышечных, что контролирует тон дыхательных путей. Занятости electrospun лесов в легочной системы до недавнего ограничивается регенеративных целей; с electrospun замена трахеи успешно пересадили. Несмотря на то, успешно, такие методы лечения ограничены в числе, и ориентированы на трахею из-за относительной простой характер функции ткани в. Ограниченные примеры моделей дыхательных путей, используемых для диагностики в пробирке существует, и, в основном, сосредоточены на измерениях гладких мышц,. Нетоксичным и нен-разложению полимер полиэтилентерефталат (ПЭТ) ранее electrospun, и был использован в настоящем исследовании, чтобы обеспечить каркасы, произведенные можно хранить в течение длительного времени без ухудшения (что позволяет им быть использованы "с полки"), а также подходит Для стабильной клеточной культуры в течение длительных периодов времени. Предыдущие исследования из нашей группы продемонстрировали, что использование трех вариаций базовой протокола электропрядения, три отдельные каркасы ПЭТ electrospun может быть произведено, чтобы обеспечить оптимальные топографии для эпителиальных культивирование фибробластов дыхательных путей, и гладкие мышечные клетки в изоляции 21,22 и совместного культивирования дыхательных путей эпителиальные и фибробласты 22. Диаметр волокна было установлено, значительно влияет на эпителиальную функциональность 22, и выравнивание волокон позволило поколение выровненных листов гладких мышц 21. Эти исследования проводились независимо друг от друга в статических условиях. В настоящем исследовании, эти differeNT каркасы, содержащие полностью дифференцированные клетки взрослого человека были совместно культивировали в течение одной недели в ALI в коммерчески доступном биореакторе в качестве секции 3D стенки дыхательных путей, обеспечивая физиологически соответствующие модели в пробирке для исследования дыхательных путей между клеточные ответы. Хотя это протокол с использованием бронхиолы дыхательных путей в качестве модельной системы, она может быть адаптирована в качестве платформы для совместного культивирования 3D слизистой оболочки блоков из других органов.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первичные клетки ASM из-астматические лиц были выделены из бронхиальных биопсий в больнице Glenfield (Leicester, UK), как описано ранее. Исследование было одобрено Комитетом по этике Лестершир и пациенты дали свое письменное информированное согласие.

1. электропрядения ПЭТ Строительные леса (рис 2)

  1. Приготовьте раствор (10 мл) класса напиток бутылка ПЭТ в соотношении 1: 1 дихлорметана (DCMro) - решение трифторуксусной кислоты (ТФК). Концентрации ПЭТ 8%, 30% и 10% вес / объем (вес / объем), обязательны для нановолокна, микрофибры и выровнены каркасов, соответственно, и затем перемешать раствор O / N при КТ в течение ПЭТ распустить.
  2. Переносят раствор ПЭТ в шприц и прикрепить 23-г (для нановолокна) или 18-г (для микроволокна и выровнены) иглу шприца и поместите шприц в моторизованной шприцевой насос. Убедитесь, что острие иглы поворачивается на дно.
  3. Расположите маndrel 15 см от кончика иглы, обеспечивая иглу указывается в центре барабана.
  4. Прикрепите электроснабжения до кончика иглы с зажимами и землей оправки (через банановой гнездо) на землю. Включите питание на оправке и установленной скоростью до 60 оборотов в минуту (эквивалентно примерно 13,2 м · мин -1) для нановолокон и микрофибры лесов. Набор скорости до 2000 оборотов в минуту (эквивалентно примерно 440 м · мин -1) для согласованных леса.
  5. Установите шприцевой насос с расходом 0,5 мл · ч -1 нановолокон случайных и выровненных каркасов или 2,0 мл · ч -1 для лесов микроволокна. Дать насосу работать до тех пор, пока раствор не выдавливают из кончика иглы, чтобы удалить весь воздух в игле. Затем остановите насос.
  6. На шприцевой насос, установить общий объем раствора должны быть высланы до 2 мл и запустить насос.
  7. Набор напряжение питания 14 кВ и выключатель питания на суппLY.
  8. Electrospin до 2 мл раствора не была electrospun (4 ч в течение нановолокна и выровненных лесов, 1 ч для микрофибры лесов).
  9. Отрежьте леску с лезвием вдоль ширины оправки. Это производит 2D лист эшафот размер области оправки поверхности (в данном случае, прямоугольного листа 22 см х 11 см), которые могут быть тщательно очищены от оправки). Храните эшафот алюминиевой фольгой для снижения электростатического заряда).
    Примечание: Двухфазные леса производятся последовательный электропрядения в нановолокон эшафот непосредственно из микрофибры эшафот.

2. Стерилизация строительные леса перед использованием в культуре клеток

  1. Из лесов листа, выбивать диски двухфазных или выровненных лесов с помощью биопсии пера 0,8 мм диаметр и придерживаться прокладка с помощью нетоксичного клея аквариум.
  2. Стерилизация каркасов с использованием ультрафиолетового облучения в течение 30 мин с каждой стороны каркасов, прежде замачивания в 20% Объем / объем антибиотик / противогрибковым раствором (2x10 5 единиц мл -1 пенициллина G, 2000 мг мл -1 стрептомицина сульфата и 500 мкг мл -1 амфотерицин B) O / N при 4 ° С.
  3. Промыть каркасов с PBS 3 раза, а затем сохранить каркасов в TCP-луночных планшетах в PBS при 4 ° С до использования.

3. Сотовые Культура СМИ Составляющие

  1. Культура CALU3 эпителиальных клеток в среде DMEM-F12, дополненной 10% об / об эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 2 нМ L-глутамина, раствора 1% объем / объем антибиотика / противогрибкового раствора (10000 единиц мл -1 пенициллина G, 100 мг мл стрептомицина сульфат -1 и 25 мкг мл -1 амфотерицин B).
  2. Культура фибробластов и MRC5 ASM клетки в DMEM, дополненной 10% об / об эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 2 нМ L-глутамина, раствора 1% объем / объем антибиотика / противогрибкового раствора (10000 единиц мл -1 пенициллина G, 100 мг мл -1 стрептомицин сульфат и 25 мкг мл -1 амфотерицин B).
  3. Культура эпителиальных фибробластов-ASM клеток со-культур в 70:30 DMEM-F12: DMEM СМИ смесь.

4. Посев фибробластов и эпителиальных клеток на двухфазного строительные леса

  1. В культуре ткани пластины, замочить каркасов в среде DMEM-дополненной среде и инкубируют при 37 ° С в течение 1 ч перед посевом клеток.
  2. Снимите DMEM с добавкой средств массовой информации, поместить микрофибры этап эшафот к вершине и семян 1,5 x10 4 MRC5 фибробластов в 30 мкл DMEM, дополненной-СМИ. Перемешайте пластину на орбитальном шейкере в течение 2 ч, прежде чем выходить в термостате при 37 ° C 5% CO 2 в воздухе O / N.
  3. Поверните эшафот над тем, нановолокна фаза эшафот сталкивается вершине, семян 3,0 x10 4 CALU3 эпителиальные клетки в 30 мкл DMEM-F12 с добавкой СМИ на нановолокна фазы эшафот и инкубировать FOR 2 ч при 37 ° С, 5% СО 2 в воздухе перед погружением каркас в 70:30 DMEM-F12: DMEM, дополненной-носитель O / N до передачи в биореактор.

5. Посев АНМ клеток на неприсоединения строительные леса

  1. В планшет для тканевых культур, замочить каркасов в среде DMEM-дополненной среде и инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С перед посевом 2,5 x10 4 клеток в 30 мкл DMEM-дополненной среде и инкубировали в течение 2 ч (37 ° С, 5% СО 2 в воздухе). Погрузитесь в DMEM эшафот-дополненной возвращения средств массовой информации в инкубатор и оставить O / N до создания три-культуры в биореакторе.

6. Установка планом Tri-культура с помощью биореактора системы (рис 7)

  1. Поместите двухфазный эшафот прокладку в паз в одной камере с эпителиальной фаза вверх в камеру.
  2. Поместите выровненную эшафот под двухфазной эшафот (так он примыкает к миcrofiber фаза двухфазной эшафот) и зафиксировать две камеры биореактора вместе.
  3. Собирают две схемы перфузии потока соединен с двумя средними резервуарами (DMEM-F12 с добавкой сред в резервуаре апикальной, DMEM-F12 / DMEM с добавкой средств массовой информации в базальной резервуара) и насос носителя вокруг двух цепей примерно 0,1 мл / мин с использованием перистальтического насоса (40 мл носителя повторно через каждый контур). Дом все части системы в термостате при 37 ° С, 5% CO 2 в воздухе.
  4. Через неделю, удалите бумагу из апикальной камере, и культура эпителиальных клеток в ALI для дальнейшего неделю до анализа.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сканирующий электронный микроскоп изображения decellularized ткани дыхательных путей или иммуногистологических изображений из биопсий дыхательных путей, определенных желательных характеристик ECM дыхательных путей мы желает ввести в electrospun лесов топографии: Родной УКР матрица состоит из волокон примерно 153 нм ± 30,6 нм (средний ± SD п = 50 измерений ) в диаметре (3А и 5А), в то время как матрицы, окружающей УКР более пористыми по природе (рис 3C). Иммуногистологического разрезы пучков гладких мышечных показать ASM представить как выровненных листах клеток 21 (рис 3Е). Эта информация использовалась для направления характеристики, введенные в electrospun лесов. Вращающейся оправке смог стабильно вращаться с высокой скоростью (> 2000 оборотов в минуту / 440 м · мин -1), чтобы произвести каркасов с выровненными волокнами. Вращение Медленное оправки (60 мин 13,2 м · мин -1) не влияет на ориентацию волокон, Но производится каркасов с более равномерной толщины, чем при электропрядения на статической плиты. Изменяя параметры электроформования (концентрация ПЭТ и скорости потока раствора), можно было создать каркасов волокна с диаметром в несколько микрометров или сотен нанометров (параметры электроформования указаны в таблице 1).

Electrospun волокна с эквивалентным диаметром волокна до натуральных волокон УКР (150 нм) были получены с использованием 6% раствор ПЭТ, однако при таких низких концентрациях ПЭТ, бисероплетение волокон произошло (рис 4а). Это было устранено путем увеличения концентрации раствора ПЭТ до 8%, который производится единые нановолокон со средним диаметром 255 нм ± 2,4 нм (среднее ± SEM) и средний размер пор 1,43 мкм ± 0,02 мкм (фигуры 4B, 5A и B). Чтобы electrospin нановолокон было необходимо уменьшить размер иглы от 18 г до 23 г, что позволяет более низкие скорости потока whilsт поддержание более высокую скорость потока и уменьшения иглы блокировки, повторяющееся проблемы с большей иглой. Когда электропрядения микроволокна, увеличение ПЭТ решения> 30% ПЭТ приводят к отсутствию единообразия в диаметре волокна (рис 4F) в дополнение к нескольким завалов на кончике иглы из-за высокой вязкости раствора. Однородные коврики микроволокна, имеющие средний диаметр волокна 2,50 мкм ± 0,02 мкм (среднее значение ± SEM) и средний размер пор 10,45 ± 0,13 мкм мкм были получены при электроформования 30% вес / объем ПЭТ раствора при скорости потока 2 мл / ч -1 (фиг 4F, 5A и B). Последовательное электропрядения из нановолокна эшафот непосредственно на эшафот микрофибры (еще привязаны к оправке) создал двухфазный эшафот (рис 3D). Средние диаметры волокон были 280 нм ± 20 нм и 2,30 мкм ± 0,06 мкм для нановолокон и микрофибры фаз соответственно,сопоставимы с размерами отдельных нановолокон и микрофибры лесов. Кроме того, толщина двухфазной помост был похож на сумме индивидуальных нановолокон и микроволокна каркасов (5С). За счет увеличения скорости оправки (2000 об / м · 440 мин -1), высоко выровненные нано- или микрофибры леса были произведены. 8% раствор ПЭТ вес / объем не был оптимальным для производства нановолокон и выровненные произведенные волокна, обладающие волновой морфологию (рис 3F). Увеличение на 10% ПЭТ недействительным этот эффект, но по-прежнему приводит к уменьшению диаметра волокон (216 нм ± 2,2 нм (среднее ± SEM)) по сравнению с случайным образом ориентированных нановолокон каркасов. Выравнивание волокна была рассчитывается путем определения отклонения угла каждого волокна от среднего угла волокна. В выровненных нановолокон лесов 79% волокон были выровнены (± 10 ° Средний угол волокно) по сравнению с 10,2% волокон в случайном порядке в соответствие нановолокна Scaffдети (рис 5D).

8% нановолокон эшафот был использован резюмировать УКР, на котором эпителиальные клетки проживание, и были использованы для поддержки культуры CALU3 клеток (эпителиальных клеток дыхательных путей строки). 30% вес / объем микрофибры леса, будучи более пористый в природе был использован, чтобы имитировать суб-регион слизистой, и культивировали при MRC5 клеток (фибробластов дыхательных путей линии). 10% вес / объем выровнены нановолокна эшафот условии топологическим ссылок, чтобы обеспечить выравнивание ASM клеток при культивировании на эшафоте. Все три клеточные типы-показали увеличение жизнеспособности при культивировании их индивидуальных каркасов в течение 2-недельного периода (фиг.6а) и выражены специфические белки клеточного типа после того, как 2-недельного периода культивирования (6В, 6С, 6D &). Дальнейшая характеристика отдельных клеток лесов взаимодействий были зарегистрированы в других местах 21,. Последовательное электропрядения из нановолокна эшафотна эшафот микрофибры производится двухфазный эшафот для совместного культивирования эпителиальных клеток CALU3 и фибробластов MRC5 на нановолокон и микрофибры фаз соответственно. Культивирование из двух клеток вместе в статических условиях, как сообщается в других местах 22. Дальнейшая работа попытке добавить другие слои клеток или продлить двухфазные раз культивирования за 2 недели в статических условиях оказались неудачными (данные не показаны). Для культуры три-слоистой модели в течение длительного периода, мы использовали биореактор перфузии потока. CALU3 и MRC5 клетки высевали на двухфазной помост, и ASM клетки высевали на выровненном помост, и оба культивировали отдельно в течение 2 дней. Два каркасы затем купили вместе, чтобы сформировать трехслойное модели стенке дыхательных путей в биореакторе (рисунок 7). Обе палаты перфузировали СМИ в течение 7 дней до апикальной эпителиальной камера имела его СМИ удалены, и эпителиальные клетки культивировали вALI еще в течение 7 дней. Строительные леса были установлены и либо срезы и окрашивали, или целые леса были иммунологически маркеров клеток-специфичны. Разрезы культуры трехслойное показали клеточные ядра распространяется через всех трех слоев совместного культивирования (8В). Когда клетки подвергали иммунному окрашиванию для маркеров клеток конкретных, эпителиальные клетки заполняется апикальную фазу нановолокон в сливной клеточном слое и окрашивали позитивно для цитокератином (рис 8C), на этапе микроволокна, фибробласты окрашивали позитивно для S100A4 (рис 8D), и на выровненные 10% леса ASM клеток, окрашенных положительно для SM22α (рис 8E), что указывает на хорошую выживаемость каждого типа клеток в 3D-модели стенке дыхательных путей.

figure-results-1
Рисунок 1. бронхиола дыхательных путей. Бронхиальная биопсия из тяжелойастматический дыхательных путей, показывающий эпителий на ретикулярная базальной мембраны (УКР), с основной области подслизистой заполняется мезенхимальных клеток, и окружающие пучки гладких мышц населенные гладкомышечных клеток, окрашенных для гладких мышц альфа-актина (Браун). Масштабная линейка показывает 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2. Схема электропрядения оборудования. Шприц, содержащий раствор полимер / растворитель (с иглой) помещают на шприцевой насос, обращенной к оправке. Электрический потенциал установлен между иглой и шпинделем в результате чего волокна необходимо извлечь из кончика иглы и нанесенных на вращающейся оправке. Как волокно проходит через атмосферу,растворитель испаряется, вызывающие отложение полимерных волокон на оправке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3. Сравнение electrospun каркасов с нативным ECM дыхательных путей. Сканирующего электронного микроскопа изображения decellularized базальной мембраны (A), decellularized дыхательных путей бронхиол сечения (С) и гистологического сечении дыхательных путей гладкой мышечной пучка (окрашивали гематоксилином и эозином, масштаб бар 40 мкм) (Е) по сравнению с нановолокна (B) двухфазный (D) и выровненные (F) ПЭТ леса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотретькрупная версия этой фигуры.

Таблица 1. Параметры, используемые для электропрядения из микроволокна, нановолокна и выровнены каркасов индивидуально и для двухфазной эшафот.

figure-results-4
Рисунок 4. Изменение концентрации ПЭТ волокна влияет характеристик. Сканирующего электронного микроскопа изображения electrospun каркасов, выделенных из 6%, 8%, 10% (AC), 25%, 30% и 35% (EG) (вес / объем) растворов ПЭТ , Также показаны выровненные леса производится с 8% (D) и 30% (Н) вес / объем ПЭТ-решений. Н.э. отображены на 5,000X увеличении EH отображены на 1,000X увеличения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы смотреть большеВерсия этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 5. Свойства electrospun ПЭТ лесов. Кривые () распределения, показывающие распределение диаметра волокна от ретикулярной базальной мембраны внеклеточной матрицы (ECM УКР), случайно выровненных нано- и микро-волокна лесов и выровненной нановолокна эшафот. (B), Гистограмма, показывающая относительное распределение пор по размерам в нано- и микро-волокна лесов. (С) Средняя толщина нановолокон, микроволокна, двухфазных и выровненных каркасов (среднее ± стандартное отклонение, N = 6). (D) Гистограмма график, показывающий отклонение от средней ориентации волокон в случайных или выровненных нановолокон каркасов анализ леса волокна проводили с использованием программного обеспечения ImageJ. Раренды нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-6
Рисунок 6. культура отдельных типов клеток на отдельных каркасах. () Результаты AlamarBlue жизнеспособность клеток анализа для ASM клеток на выровненных лесов, CALU3 клетки на каркасах и нановолокон MRC5 клетки на каркасах из микрофибры (средний ± SEM, п = 3 20). Сканирующий электронный микроскоп изображения нановолокна, микрофибры и выровненные леса волокна (B, C и D соответственно) и иммунофлюоресцентной изображения CALU3 клеток, окрашенных для Е-кадгерина (красный), MRC5 клеток, окрашенных для винкулина (красный) и АНМ клеток, окрашенных для SM22α (красный), все на их профессиональное лесов (E, F и G соответственно). Hoechst был использован для окрашивания ядер (синий), масштаб бар показывает 40 &# 181; м. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-7
Рисунок 7. перфузии система три слоя модели стенки дыхательных путей. () Фотография биореактора, подключенного к перистальтического насоса и 2x СМИ водоемов. (Б) Схематическое три-слоистых лесов. (С) Схема двух биореакторов схем, когда модель дыхательных путей, проведенных на границе воздух-жидкость. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-8
Рисунок 8. Полное 3D модель стены дыхательных путей. () Бронхиальная биопсия стенки дыхательных путей со слоем слизистой выделенной красным цветом, область подслизистого выделены зеленым цветом, и пучок гладких мышц выделены золота. (Б) Разрез три-слоистые стены дыхательных путей, состоящий из двухфазных и выровненных лесов, населенных эпителиальные, фибробластов и гладкомышечных клеток фиксированных после 2 недель совместного культивирования. Сотовые ядер окрашивали DAPI (синий) с лесов отражения (серый) одновременно отображаемого. Строительные леса были также фиксированной и иммунологически для специфических маркеров клеток через 2 недели, с CALU3 клеток, окрашенных для цитокератина (зеленый) (C), MRC5 клеток, окрашенных для S100A4 (зеленый) (D), и клетки гладких мышц, окрашенных по SM22α (красный) ( Е). Масштабная линейка показывает 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.


Таблица 1.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Возможность electrospin полимерные волокна с структурными свойствами, сравнимыми с естественной ECM привело к многочисленным природных или синтетических полимеров, или смесей полимеров, являющихся electrospun воссоздать эти среды,. Манипуляции с параметрами процесса (в том числе полимерной выбора, концентрации полимера, растворителя, кончик иглы расстояния и температуры) могут все влияние лесов характеристик; Однако некоторые параметры могут иметь большее влияние на эшафот свойствами, чем другие 25,. При изменении диаметра волокна ПЭТ, мы обнаружили, ключевые параметры, чтобы быть концентрация полимера использовали, скорость, с которой полимерный раствор electrospun, и диаметр иглы в. При электроформования выровненных волокон ключевые параметры используется метод сбора (вращающейся оправке), и скорость, с которой вращается оправка. В результате уменьшения скорости оправки 60 оборотов в минуту, мы обнаружили, что случайно выравненные леса, произведенные показали большую эшафот UNIветствия сравнению с электроформования на плоскую пластину коллектора.

Характеристики decellularized ткани дыхательных путей были проанализированы, чтобы обеспечить руководство для различных топологий лесов, разработанных для культуры каждого дыхательных путей типа клеток. Electrospun нановолокна привлекательным эшафот повторить подвал мембранных структур из-за малого размера пор, но высокой общей пористости, что позволяет увеличить метаболита диффузии в то время ограничивая клеточный движение. 9 Хотя оптимизации параметров электропрядения, диапазон концентраций ПЭТ и расходов были протестированы. Тончайшие волокна достигается с помощью 6% раствор вес / объем ПЭТ, ранее используемый другими группами. Тем не менее, высокий уровень бисером, и отсутствие единообразия были постоянные проблемы. Первоначальные попытки удалить бисером включены добавлением катионного поверхностно-активного вещества, бромид цетилтриметиламмония (СТАВ), к раствору, чтобы снизить поверхностное натяжение, и тестирования различных источниковПЭТ. Добавление поверхностно-активного вещества уменьшается количество бисером, но не полностью. После попытки ряда коммерческих источников ПЭТ гранул, пищевой напиток бутылка ПЭТ используется, сокращая до бутылки напитки и растворения их в DCM: TFA решения растворителя. Используя это как привели источник ПЭТ в увеличении волокна однородности и снижение волокна бисером. Слегка увеличивая концентрацию раствора до 8% вес / объем, и уменьшение диаметра иглы (18G к 23G) мы последовательно производится бездефектных нановолокна с диаметром волокон примерно 250 нм. Electrospun нановолокон леса может быть очень электростатического при сборе с оправки решений ручной обработки каркасов сложных. Это было улучшено путем хранения каркасов в алюминиевую фольгу после вращения и замачивания в 70% IMS перед использованием. Это, казалось, чтобы помочь рассеять остаточное электростатический заряд оставил на эшафот из процесса электропрядения.

Для обеспечения верхographies похож на отдельных микросреды, с которыми сталкиваются три основных типа клеток дыхательных путей в пределах стенке дыхательных путей, основной протокол электропрядения был адаптирован производить три уникальные каркасов для этих типов клеток: по электропрядения низкий концентрация раствора ПЭТ медленно, были сгенерированы случайным образом выровнены нановолокна, на котором эпителиальные клетки высевали (имитируя УКР). По электроформования более высокую концентрацию раствора ПЭТ более быстрыми темпами, были сгенерированы случайным образом выровнены микроволокна (производить более пористого матрикса), в котором фибробласты высевали (имитируя суб-слизистой область непосредственно под УКР). По электроформования низкую концентрацию раствора ПЭТ на высокой скорости вращающейся оправке выровнены нановолокна были произведены, на которой гладкомышечные клетки ориентированы в направлении волокон, производство листов выровнены клеток.

Увеличение диаметров волокон приводит к увеличению размера пор, что позволяет более penetratio клетокп в каркасах и да поможет создать настоящий 3D-среде,. Микрофибры леса были заняты для культуры фибробластов в исследовании для того, чтобы клетки жили на нескольких плоскостях внутри эшафот. При увеличении концентрации ПЭТ до 30% вес / объем, ПЭТ волокна со средним диаметром 2,5 мкм были получены. Волокна большего диаметра (≈ 4 мкм) были получены с использованием 35% раствора ПЭТ вес / объем, но толщина эшафот однородность погиб, и выше изменчивость между отдельными волокнами было очевидно. Поры в микроволокна помост было более 7 раз больше, чем измеренные в нановолокон каркасов (10,45 мкм против 1,43 мкм соответственно), но по-прежнему статического посев клеток при условии, ограниченное проникновение сотовой. Это была улучшена за счет динамического посева клеток с использованием орбитальной смеситель, способ, показанный, чтобы быть эффективными ранее.

Высоко выравненные нановолокон леса были созданы электропрядения 10%вес / объем раствора ПЭТ на оправку вращающегося со скоростью 2000 оборотов в минуту (≈ 440 м · мин -1). Концентрация ПЭТ был увеличен с 8%, чтобы предотвратить неправильную волнообразный морфологию, что волокна выставлены при более низких концентрациях. Несмотря на увеличение концентрации, выравнивая волокна уменьшается средний диаметр волокна (216 нм против 255 нм, выровненный против случайных). Высокая скорость оправки рисунок волокон, прежде чем они высохли может вызвать этот эффект. Выравнивание волокон под влиянием выравнивание ASM клеток, а также имеет другие физиологические эффекты на АНМ клеток, которые были характерны в других местах 21.

Основным недостатком этого протокола является невозможность изображения живых клеток в / в каркасах делает первоначальный клеток-вложение или дифференциацию в течение длительного периода времени невозможно определить без ущерба для образцов. Это означает, что большинство оптимизация происходит после периода культивирования, то есть исправитьIng образцы, а затем измерения ли культура клеток успешно после не при культивировании клеток. Наблюдая изменение цвета в каркасах инкубировали в AlamarBlue (синий) до розового указывает клетки присутствуют и жизнеспособной, но не является идеальным. Электроформования более прозрачные полимеры, такие как желатин может помочь в визуализации клеток на каркасах. Электроформования из нановолоконные помост в нашей модели позволило репликацию УКР дыхательных путей, так же, состоящий из плотных нановолокон, на которой эпителиальные клетки находятся. Ранее было показано, что структурные элементы не могут мигрировать через нановолокна помост 22, хотя иммунные клетки способны (данные не показаны). Хотя предпочтительным для культивирования конкретных типов клеток на 3D поверхности (например, эпителиальные и эндотелиальные клетки), это предотвращение структурной клеточной миграции через нановолокон может быть вредным для культивирования клеток других типов. Как гладкие мышцы не в состоянии мигрировать через йе выровнены нановолокна леса мы собрали три-слоистых совместного культивирования с гладкой мышцы и фибробластов слоев, обращенных друг к другу (в отличие от выровненного эшафот, разделяющей два типа клеток). Хотя это позволяет клеткам быть близко друг, текущее исследование не может заключить ли один тип клеток (или фибробластов или гладкомышечных) обгонит весь слой над более длительного периода культивирования. Несмотря на эти ограничения, жизнеспособным трехслойное модель стенке дыхательных путей была разработана, что обеспечивает альтернативный платформу для исследования взаимодействия между этими нескольких типов клеток. Аналогичное три-слоистой исследования был недавно опубликован, где фибробласты были встроены в цилиндрическую коллагена I гидрогеля с гладкой мускулатуры высевают на наружной поверхности эпителиальных клеток и внутри просвета поверхности 17. Механическую стабильность electrospun каркасов развитых здесь позволит подобное трубчатые конструкции, который будет сформирован, и остается тока исследовRCH цель в нашей группе. Несмотря на то, исследование было сосредоточено на дыхательные пути, органы несколько в пределах доли тела это основное структурное подразделение слизистой, а через изменения арендаторов подчеркнул в этом исследовании, аналогичные платформы могут быть разработаны для тканей, содержащих базальной мембраны блок в том числе кровеносных сосудов, мочевого пузыря и Роговица, где были использованы основанные многослойные модели коллаген.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование, приведшее к этим результатам AirPROM, получило финансирование от Европейского Союза в соответствии с соглашением о гранте No 270194. Эта работа также финансировалась Национальным центром замены, совершенствования и сокращения животных в исследованиях (NC3Rs) и Центром инженерных и физических исследований (EPSRC) Докторским учебным центром (DTC) в области регенеративной медицины, Великобритания

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Полиэтилентерефталат (ПЭТ)Люкозаде (GSK) бутылкиН/ДИсточник ПЭТ для электропрядения. Разрежьте на мелкие кусочки и при необходимости взвесьте
Дихлорметан (DCM)Растворитель для ПЭТ
Трифторуксусная кислота (TFA)Сигма-растворительдля ПЭТ
Вращающаяся оправкаВстроенная в домИспользуется для сбора электропрядущих волокон. Вращаясь с разной скоростью, волокна могут быть выровнены или случайно ориентированы
Шприцевой насосГарвардский аппаратиспользуемый в процессе электроспиннинга
DMEM-F12Культуральная среда Gibcoдля клеток CALU3
DMEMGibcoКультуральная среда для клеток
HASM MEMGibcoПитательная среда для клеток MRC5
Антибиотик/антимикотик решениеGibcoMedia supplement
FCSGibcoMedia supplement
Orbital mixer (Orbital shake 503)Stuart ScientificДля динамического посева клеток на микрофибровые каркасы
Peristaltic Pump Watson MarlowДля обеспечения потока среды через биореактор
3DKubeKiyatecБиореактор для 3D клеточной культуры
,

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
  2. Song, J., Guyette, J., Gilpin, S. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
  3. Wenzel, S., Holgate, S. The mouse trap: it still yields few answers in asthma. American journal of respiratory and critical. 174 (11), 1171-1173 (2006).
  4. Zosky, G. R., Sly, P. D. Animal models of asthma. Clinical and experimental allergy journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 37 (7), 973-988 (2007).
  5. Bates, J. H. T., Rincon, M., Irvin, C. G. Animal models of asthma. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 297 (3), L401-L410 (2009).
  6. Johansson, F., Carlberg, P., Danielsen, N., Montelius, L., Kanje, M. Axonal outgrowth on nano-imprinted patterns. Biomaterials. 27 (8), 1251-1258 (2006).
  7. Paik, I., et al. Rapid micropatterning of cell lines and human pluripotent stem cells on elastomeric membranes. Biotechnology and bioengineering. 109 (10), 2630-2641 (2012).
  8. Williams, C., et al. Aligned Cell Sheets Grown on Thermo-Responsive Substrates with Microcontact Printed Protein Patterns. Advanced Materials. 21 (21), 2161-2164 (2009).
  9. Schindler, M., et al. A synthetic nanofibrillar matrix promotes in vivo-like organization and morphogenesis for cells in culture. Biomaterials. 26 (28), 5624-5631 (2005).
  10. Schindler, M., et al. Living in Three Dimensions. Cell Biochemistry and Biophysics. 45 (14), 215-227 (2006).
  11. Ahmed, I., et al. Morphology, cytoskeletal organization, and myosin dynamics of mouse embryonic fibroblasts cultured on nanofibrillar surfaces. Molecular and Cellular Biochemistry. 301 (1-2), 241-249 (2007).
  12. Flemming, R., Murphy, C., Abrams, G. Effects of synthetic micro-and nano-structured surfaces on cell behavior. Biomaterials. 20, 573-588 (1999).
  13. Sun, T., et al. Development of a 3D Cell Culture System for Investigating Cell Interactions With Electrospun Fibers. Biotechnol. Bioeng. 97 (5), 1318-1328 (2007).
  14. Kim, D. -H., Provenzano, P. P., Smith, C. L., Levchenko, A. Matrix nanotopography as a regulator of cell function. The Journal of cell biology. 197 (3), 351-360 (2012).
  15. Jeffery, P. K. Remodeling in Asthma and Chronic Obstructive Lung Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (10 pt 2), S28-S38 (2001).
  16. Jungebluth, P., et al. Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: a proof-of-concept study. Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).
  17. Miller, C., George, S., Niklason, L. Developing a tissue-engineered model of the human bronchiole. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. (July), 619-627 (2010).
  18. West, A. R., et al. Development and characterization of a 3D multicell microtissue culture model of airway smooth muscle. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 304 (1), L4-L16 (2013).
  19. Nesmith, A. P., Agarwal, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Human airway musculature on a chip: an in vitro model of allergic asthmatic bronchoconstriction and bronchodilation. Lab on a chip. , (2014).
  20. Hadjizadeh, A., Ajji, A., Bureau, M. N. Nano/micro electro-spun polyethylene terephthalate fibrous mat preparation and characterization. Journal of the mechanical behavior of biomedical materials. 4 (3), 340-351 (2011).
  21. Morris, G., et al. Human airway smooth muscle maintain in situ cell orientation and phenotype when cultured on aligned electrospun scaffolds. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (1), L38-L47 (1999).
  22. Morris, G. E., et al. A novel electrospun biphasic scaffold provides optimal three-dimensional topography for in vitro co-culture of airway epithelial and fibroblast cells. Biofabrication. 6 (3), 035014(2014).
  23. Sell, S., et al. The Use of Natural Polymers in Tissue Engineering: A Focus on Electrospun Extracellular Matrix Analogues. Polymers. 2 (4), 522-553 (2010).
  24. Subbiah, T., Bhat, G. S., Tock, R. W., Parameswaran, S., Ramkumar, S. S. Electrospinning of nanofibers. Journal of Applied Polymer Science. 96 (2), 557-569 (2005).
  25. Dalton, P. D., et al. Electrospinning and additive manufacturing: converging technologies. Biomaterials Science. 1 (2), 171(2013).
  26. Boland, E. D., Wnek, G. E., Simpson, D. G., Pawlowski, K. J., Bowlin, G. L. Tailoring tissue engineering scaffolds using electrostatic processing techniques: A study of poly(glycolic acid) electrospinning. Journal of Macromolecular Science-Pure and Applied Chemistry. 38 (12), 1231-1243 (2001).
  27. Stitzel, J. D., Bowlin, G. L., Mansfield, K., Wnek, G. E., Simpson, D. G. Electrospraying and electrospinning of polymers for biomedical applications. Poly(lactic-co-glycolic acid) and poly(ethylene-co-vinylacetate). Revolutionary Materials: Technology And Economics. 32, 205-211 (2000).
  28. Liu, W., Thomopoulos, S., Xia, Y. Electrospun nanofibers for regenerative medicine. Advanced healthcare materials. 1 (1), 10-25 (2012).
  29. Veleirinho, B. Solvent and concentration effects on the properties of electrospun poly (ethylene terephthalate) nanofiber mats. Journal of Polymer. , 460(2008).
  30. Balguid, A., et al. Tailoring Fiber Diameter in Electrospun Poly(epsilon-Caprolactone) Scaffolds for Optimal Cellular Infiltration in Cardiovascular Tissue Engineering. Tissue Engineering Part A. 15 (2), 437-444 (2009).
  31. Shalumon, K. T., et al. Fabrication of three-dimensional nano, micro and micro/nano scaffolds of porous poly(lactic acid) by electrospinning and comparison of cell infiltration by Z-stacking/three-dimensional projection technique. IET nanobiotechnology / IET. 6 (1), 16-25 (2012).
  32. Thevenot, P., Nair, A., Dey, J., Yang, J., Tang, L. Method to Analyze Three-Dimensional Cell Distribution and Infiltration in Degradable Scaffolds. Tissue Engineering Part C-Methods. 14 (4), 319-331 (2008).
  33. Rose, J., et al. Gelatin-Based Materials in Ocular Tissue Engineering. Materials. 7 (4), 3106-3135 (2014).
  34. Liliensiek, S. J., Nealey, P., Murphy, C. J. Characterization of Endothelial Basement Membrane Nanotopography in Rhesus Macaque as a Guide for Vessel Tissue Engineering. Tissue Engineering Part A. 15 (9), (2009).
  35. Abrams, G. A., Murphy, C. J., Wang, Z. -Y., Nealey, P. F., Bjorling, D. E. Ultrastructural basement membrane topography of the bladder epithelium. Urological research. 31 (5), 341-346 (2003).
  36. Abrams, G. A., Bentley, E., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Electron Microscopy of the Canine Corneal Basement Membranes. Cells Tissues Organs. 170 (4), 251-257 (2002).
  37. Reichl, S., Bednarz, J., Muller-Goymann, C. Human corneal equivalent as cell culture model for in vitro drug permeation studies. British Journal of Ophthalmology. 88 (4), 560-565 (2004).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Tri layered ScaffoldAirway Wall ModelPET Polymer SolutionRandomly Aligned MicrofiberAligned Nanofiber ScaffoldBioreactor Co culture SystemCell Type SeedingScanning Electron MicroscopyIntercellular Cross talk

Похожие статьи