Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Наблюдение за Мерцательная Движения сосудистое сплетение эпителиальных клеток

11.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52991

⸱

13 июля 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life Science and Medical Bioscience, Faculty of Science and Engineering, Waseda University, 2Department of Anatomy and Cell Biology, Interdisciplinary Graduate School of Medicine & Engineering, University of Yamanashi

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании детально оптизированный метод светового микроскопа был оптимизирован для наблюдения и анализа движения ресничек CPEC ex vivo в реальном времени вместе с электронно-микроскопическим методом для ультраструктурного анализа.

Аннотация

Сосудистое сплетение расположено в желудочковой стенке мозга, основной функцией которого, как полагают, является производство спинномозговой жидкости. Эпителиальные клетки сосудистого сплетения (CPEC), покрывающие поверхность ткани сосудистого сплетения, содержат множество уникальных ресничек, но большинство функций этих ресничек еще предстоит исследовать. Чтобы раскрыть функцию ресничек CPEC, уделяя особое внимание их подвижности, была разработана система наблюдения ex vivo для мониторинга подвижности ресничек в эмбриональном, перинатальном и постнатальном периодах. Сосудистое сплетение было рассечено из желудочка головного мозга и исследовано под видеоусиленным контрастным микроскопом, оснащенным дифференциальной интерференционно-контрастной оптикой. В этих условиях был разработан простой количественный метод анализа подвижных профилей ресничек CPEC в течение нескольких часов ex vivo. Затем морфологические изменения ресничек во время развития наблюдались с помощью сканирующей электронной микроскопии, чтобы выяснить взаимосвязь между морфологической зрелостью ресничек и подвижностью. Интересно, что этот метод может очертить изменения в количестве и длине ресничек, которые достигают пика на послеродовой день (P) 2, в то время как частота биения достигает максимума на P10 с последующим резким прекращением на P14. Эти методы позволят выяснить функции ресничек в различных тканях. В то время как соответствующие методы были опубликованы в предыдущем отчете1, настоящее исследование сосредоточено на подробных методах наблюдения за подвижностью и морфологией ресничек CPEC ex vivo.

Введение

реснички — это волосовидные выступы на поверхности большинства клеток позвоночных, которые привлекли внимание медицинских исследователей из-за класса заболеваний, называемых цилиопатиями2–4. Несмотря на повсеместную экспрессию органелл, сообщалось о широком спектре ресничных функций, включая моторику и биосенсорику. Например, подвижные реснички на мукоэпителиальной поверхности транспортируют слизь5 и эпителиальный мусор к выходу из трактов, тем самым предотвращая заболевание за счет очистки поверхности эпителия. Кроме того, в ранние периоды развития и эмбриональные стадии реснички регулируют пролиферациюстволовых клеток 6 и участвуют в определении лево-правой асимметрии тела позвоночных7.

Эпителиальные клетки сосудистого сплетения (CPEC) являются производными нейроэпителиальных клеток, которые покрывают поверхность ткани сосудистого сплетения в головном мозге, которые играют важную роль в поддержании гомеостаза внутричерепной среды путем производства спинномозговой жидкости (ликвора). Ранее было продемонстрировано, что КПЭК имеют множественные неподвижные реснички, которые регулируют выработку спинномозговой жидкости через рецепторы, сопряженные с G-белком, которые специфически сосредоточены на ресничках8. Несмотря на то, что эти реснички рассматривались как неподвижные реснички, было обнаружено, что некоторые реснички CPEC демонстрируют преходящую подвижность в неонатальномпериоде. Это открытие было весьма важным, поскольку оно показало, что так называемые неподвижные реснички не обязательно неподвижны с самого начала развития и могут проявлять преходящую подвижность в течение определенных временных окон, возможно, в ответ на специфические физиологические потребностии функции. Чтобы точно описать подвижную природу ресничек КПЭК, необходимо разработать систему наблюдения ex vivo, которая включает в себя анализ кинетических профилей, уникальных для ресничек КПЭК.

Что касается подвижности, хотя в нескольких технических отчетах описаны наблюдения за подвижными ресничками эпителия трахеи5,10, подвижными одноклеточными жгутиками11, так называемыми обычными подвижными ресничками12 и узловыми ресничками13, подробные аналитические методы, применимые к относительно волнистым структурам, таким как сосудистое сплетение, до сих пор не были хорошо задокументированы. Кроме того, требуется высокое временное разрешение для анализа цилиарного движения ЦПЭК, в котором без дорогостоящих высокоскоростных камер не обойтись. Чтобы обойти эту необходимость и упростить мониторинг подвижности ресничек различных типов клеток, была внедрена недорогая высокоскоростная камера, а такжебыл разработан легкодоступный и удобный метод записи подвижности подвижных ресничек, особенно для описания скорости и характера движения каждой реснички. Кроме того, здесь было использовано оригинальное программное обеспечение для анализа изображений "TI Workbench" для облегчения детального анализа подвижности. В совокупности этот метод обеспечивает новую краткую стратегию анализа движения ресничек вместе с корреляционной сканирующей электронной микроскопией (СЭМ), которая может быть использована в широком спектре исследований ресничек.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протоколы и использование экспериментальных животных были одобрены институциональных уходу за животными и использование комитетов в университете Яманаси и университета Васэда. Уход за животными проводили в соответствии с ведомственным руководящим принципам.

1. Подготовка КЗЭК

  1. Подготовьте следующие устройства и материалы: Стерео микроскоп, предпочтительно, способный передавать освещение снизу; пара щипцов часовщик (Дюмон # 3 или # 4), пламя стерилизовать, прямые операционные ножницы, пламя стерилизовать; два стерильных 10 см пластиковой посуды, содержащие 20 мл ледяной Лейбовиц L-15 среды; 35 мм со стеклянным дном блюда, содержащие 2 мл РТ Лейбовиц L-15 среды; 100 мл химический стакан, содержащий 70% этанола; неонатальные щенки мыши.
  2. Кратко погрузить новорожденных мышь в 70% этанола и быстро усыпить путем обезглавливания с помощью операционной ножницы.
  3. Сразу же место голову в ледяной Лейбовиц L-15 среды, в стерильной 10 см дишиллинг
  4. Снимите кожу с использованием свода черепа пару щипцов часовщика, разрезать череп подвергать мозг, а затем разрезать черепные нервы, чтобы изолировать весь мозг.
  5. Перевести мозг в новое блюдо, содержащей ледяной Лейбовиц L-15 среды и наблюдать под микроскопом стерео, убедившись, что мозг полностью погружен в среду.
  6. Установите спинной мозг вверх и ориентировать мозг таким образом, что обонятельные луковицы находятся в положении 3:00 (для правшей). Держите мозг осторожно пинцетом в левой руке.
  7. Использование тонких щипцов (рассечение Дюмон # 3 или # 4) в правой руке, отрезать мозолистого тела и под паренхимы, соединяющий полушария, вдоль продольной трещины головного мозга.
  8. Аккуратно нажмите полушарий от боковым сторонам и подвергать поперечной мозговой трещину.
  9. Отделите полушария, зажимая из йе паренхимы между полушарии и таламуса.
  10. Аккуратно вытащить боковые сосудистое сплетение желудочков, которая крепится к боковой стороне гиппокампа по пластинке affixa.
  11. Перевести выделенные сосудистое сплетение в 35 мм со стеклянным дном блюдо с свежей Лейбовиц L-15 среды, и накладывать массу (список материалов) мягко, чтобы держать ткань в месте.

2. Живая съемка КЗЭК Cilia

  1. Подтвердите правильное ультрафиолет (УФ) и вывод (ИК) фильтр отсечки (ы), чтобы заблокировать свет короче 400 нм и длиннее 700 нм, и что нейтральный плотности (ND) фильтры (25% и 6%) вставляются в пути света из инвертированного микроскопа.
  2. Настройте фокус объектива примерно на глаз, а затем настроить конденсатор, так что центр и фокус, чтобы соответствовать освещения Келера. Вставьте соответствующий дифференциального интерференционного контраста (ДИК) призмы, DIC элементом, а также анализатора и поляризатора элементов в LiGHT путь, чтобы соответствовать оптики DIC.
  3. Регулировка контрастности зрения положением DIC призмы так, чтобы структура поверхности ткани является самым узнаваемым. Если все реснички клеток-мишеней подвижны, четкое представление о подвижных ресничек не может быть получена на глаз из-за их движением.
  4. Измените путь света к видеокамере, и удалить нейтральные фильтры, чтобы увеличить световой мощности.
  5. Используйте камеру в режим фокусировки, чтобы отрегулировать поле зрения и внимания. Во время фокусировки, в которой видео изображения отображаются в режиме реального времени на мониторе, очевидно, вид подвижных ресничек не доступен.
  6. Используйте камеру на 200 Гц при времени экспозиции 0,1 мс для требуемого периода (от секунд до минут). После приобретения пакета изображений, отдельные кадры будут отображаться четкие цилиарных структур. Если цилиарные края размыты, увеличить частоту кадров или использовать более короткое время экспозиции.
  7. Запишите движение ресничек КЗЭК в 25-60 мин после эвтаназии в ЛейбовицL-15 среднего.

3. Анализ движения Мерцательная

  1. Вручную отслеживать избиении модели каждого реснички на мониторе компьютера. Все позиции мерцательная наконечник в каждом кадре с указателем мыши, которые собраны для траекторной информации каждого реснички. Либо проанализировать траекторию информацию, используя то же программное обеспечение или экспорт в другие, более общего применения для дальнейшего анализа. Эффективность этого шага анализа описан в дискуссии.
  2. Оцените траектории в двух режимах движения, возвратно-поступательный или вращательный, на глазок.
  3. Вычислить частоту биений цилиарного (CBF) с помощью следующей формулы: [CBF = (количество кадров в секунду) / (среднее число кадров для одного такт)] 14, которые могут быть получены из диаграммы движения цилиарного наконечник (фиг.3 ). Повторите этот расчет для нескольких циклов мерцательная избиение, потому что другие, реснички на той же клетке могут мешать движению каждого ciliuм, в результате неравномерности.
  4. Для анализа угловой однородность цилиарной избиение осей в пределах одной ячейки, определить угол θ избиение для каждой траектории (рис 4). Для назад и вперед траекторий, соответствовать позиции кончика реснички к прямой линии, и определить θ как угол линии делает с оси х. Для вращающихся траекторий, соответствовать позиции к эллипсу, и определить θ как угол большой оси эллипса составляет с оси х. Подробная информация о фитинга описаны в разделе Результаты представитель.
  5. Для количественного описания каждой траектории, рассчитать обобщенную пропорции AR. Вкратце, повернуть траекторию - θ и определяют AR как отношение между шириной распределения по х - и у -axes (рис 4б). Подробности приведены в разделе Результаты Представительства и интерпретация, Значимость, и ограничение параметра описаны в дискуссии.

4. Подготовка проб для SEM

Примечание: СЭМ является важным методом для оценки состояния ресничек на CPECs в полном объеме. Для подготовки образцов для РЭМ, стандартная процедура сообщалось ранее 15 используется с небольшими изменениями.

  1. Перед рассмотрением ткани из мозга, подготовить фиксатор в стеклянный флакон 5 мл с полиэтиленовой крышкой. Фиксатор состоит из 2% параформальдегида, 2,5% глутарового альдегида (половина раствора Карновского в 16) в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,4.
  2. Рассеките из ткани из мозга, как описано в шаге 1.
  3. Кратко промыть изолированную ткань с сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS) в новое блюдо, а затем зафиксировать ткани в фиксаторе в стеклянной пробирке в течение 1 часа при комнатной температуре. Используйте одноразовые пипетки передачи и обработки образцов Gently. После промывки в HBSS, ткань становится липким.
    1. Для передачи образцов в растворе фиксирующего медленно изгнать небольшое количество раствора, содержащего ткань из пипетки в капли и добавить к фиксатором.
  4. После фиксации отказаться от фиксатора и промойте ткань с фосфатным буфером три раза.
  5. Погружают ткань в 10% растворе сахарозы промыть остальные альдегиды. Чтобы обеспечить полное удаление альдегидов, погрузить образцы в растворе в течение 10 мин, а затем повторить два раза со свежим 10% сахарозы. Это важно для достижения надлежащего пост-фиксацию на последующих стадиях.
  6. Погружают ткань в раствор 1% осмия в фосфатном буфере в течение 30 мин, а затем поместить на льду в течение после фиксации. Судить о степени osmification по цвету образца: когда альдегиды полностью удалены, образец черного цвета.
  7. Вымойте образцы фиксировали ткани широко с двойным дистиллированнойd воды несколько раз.
  8. Обезвоживают образцы погружением в переменной концентрации этанола, как правило, 65%, 75%, 85%, 95%, 99% и 100%, в течение 10 мин каждый. Получить безводного этанола путем размещения молекулярных сит в 99,5% этанола из недавно купленного бутылку. Повторите обезвоживание безводным этанолом три раза.
  9. Поместите обезвоженные образцы в изоамилацетат, замещения реагента для сушка в критической точке, в течение 10 мин. Повторите этот шаг дважды. Этот реагент быстро испаряется, и образец может стать сухой, что приводит к разрушению поверхностным натяжением. Таким образом, не сушить образец полностью.
  10. После окончательного обмена изоамилацетат, удалить большую часть растворителя, немедленно обернуть открытую стеклянную ампулу с алюминиевой фольгой, и поместить флакон на сухом льду. С помощью иглы или тонкий пинцет, сделать несколько отверстий в фольге, покрывающей рот флакона, так что жидкий диоксид углерода протекает легко в флаконе в критической точке сушилку. Перейдите к следующему шагукак можно быстрее.
  11. На этом этапе, свести к минимуму вынос изоамилацетат в камеру сушилки, но не позволяйте образец полностью высохнуть, прежде чем сушка в критической точке. Кроме того, не оставляйте пробы на сухом льду для излишне долго, чтобы избежать обмерзания на флаконе.
  12. Передача стеклянные флаконы обернутого фольгой, содержащие образцы ткани в критической точке сушилку, который обеспечивает поверхностную структуру ткани остается неизменным во время удаления воды, содержащейся в ткани. Подробная информация о работе с критическую точку сушилка может быть получена из инструкций изготовителя.
  13. Ручка образцы тщательно используя зубочистку, чтобы свести к минимуму механическое повреждение. Полученные высушенные образцы тканей являются хрупкими. Установите образцы на металлических заглушек и пальто с золотой палладия с использованием ионного НАПЫЛЕНИЕМ.

5. Наблюдение с помощью СЭМ

  1. Соблюдайте СЭМ и записывать изображения с цифровой камерыоборудованы сканирующего электронного микроскопа.
  2. Передачи данных цифрового изображения на ПК для анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Обзор рабочего процесса показан на рисунке 1, в том числе изображения устройств.

Текущие наблюдения движения CPECs

Фильм 1 показан фильм CPECs, выделенных из мыши перинатальной и фильм 2 показан увеличенный вид изображений в кино 1. Следует отметить, что отдельные советы цилиарных менее ясны в неподвижных изображений по сравнению с теми, в кино. На рисунке 2 показано отслеживание...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Перспективы этого метода

Хотя способ, описанный здесь, не обеспечивает более точный анализ ресничек, чем ранее опубликованных методов, значение этого метода состоит в простоте системы и экономической эффективности, которые могут быть с легкостью применить для скрининга любые цилиарной подвижности экс виво. В частности, Т. Workbench обеспечивает простой и удобный интерфейс, который позволяет исследователям наблюдать и анализировать ресничек моторику более легко. Эффективные методы ав...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов. Эта статья направлена ​​на отчетности подробную методику наблюдать моторику ресничек в изолированных сосудистое сплетение тканей. Научные новинки были представлены в предыдущих исследованиях 1,8.

Благодарности

Эта работа была поддержана Проектом для частных университетов: субсидия встречного фонда от Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий (MEXT) Японии (T.I.) и гранты на научные исследования (C) от MEXT (S.T. и K.N.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Required reagents
for live cell imaging
ethanolWako Chemicals057-00456
Leibovitz L-15 mediumLife Technologies11415-064
for SEM preparation
ethanolWako Chemicals057-00456
Сбалансированный солевой раствор ХэнкаLife Technologies14170112
параформальдегида Merck1040051000
глутаральдегид Nacalai tesque17003-05
изоамилацетатNacalai tesque02710-95
Молекулярные сита 4A 1/8 Wako Chemicals130-08655для приготовления безводного этанола
фосфатного буфера (PBS)Sigma-AldrichD1408
фосфатный буфер, 0,1 МДля приготовления 100 мл смешайте 19,0 мл 0,1  M2PO4 и 81,0 мл 0,1  M Na2HPO4
monosodium phosphate (дигидратNacalai tesque31718-15
динатрийфосфат (безводный)Nacalai tesque31801-05
sucloseNacalai tesque30406-25
osmium tetroxideNisshin EM300
сухой лед
[header]
Инструменты и материалы для диссекции
для визуализации в реальном времени и подготовки к СЭМ
стерео микроскопOlympusSZX7
плоское бумажное полотенце
Φ 10 см пластиковая тарелка
100 мл стакан
прямые операционные ножницыSansyoS-2B
щипцы для часовщиковDumontNo.DU-3 или -4, INOX
для визуализации живых клеток
glass нижняя тарелкаMatsunami GlassD110300
<сильно>для приготовления СЭМ
альминум фольга
стеклянный флакон 5 мл с полиэтиленовым колпачкомNichiden Rika-GlassPS-5A
трансферная пипеткаSamco ScientificSM251-1Sдля переноса образцов
зубочисткадля переноса образцов
ионное распыление с золотом-палладиемHitachiE-1030
сушилка для критических точекHitachiHCP-2
[header]
микроскопическое оборудование и материалы
для визуализации живых клеток
inverted микроскопOlympusIX81
100 Вт ртутный комковатый корпус и блок питанияOlympusМожно использовать ртутную лампу U-ULH и BH2-RFL-T3
мощностью 100 ВтUshioUSH103D
DIC, n.a. 0.55OlympusIX-LWUCD
электрический затворVincent AssociatesVS35S22M1R3-24 и ручной затвор VMM-D1.
Полосовой фильтр (400-700  nm, Φ 45  мм)Косин КагакуC10-110621-1
ND фильтр (Φ 45 мм)Olympus45ND6, 45ND25комбинация 25% и 6% ND фильтров используется
объектив (водный иммерсионный) с элементом DIC OlympusUApo 40XW/340, n.a., 1.15 с IX-DPAO40
высокоскоростной видеокамеройAllied Vision TechnologiesGE680≥ Частота кадров 200 Гц и время экспозиции 1 мсек
Программное обеспечение для сбора / анализа изображенийв собственном программном обеспеченииTI Workbenchспособно получать изображения с высокой частотой кадров.
ПК для управления / анализа камерыAppleMac Pro
виброизоляционный столMeiritsu SeikiAD0806
вес для тканиWarner Instrumentsкомплекты срезов анкеровОн может быть изготовлен из нейлоновой сетки, приклеенной к U-образной форме сплющенной Φ 0,5  мм платиновая проволока.
защитное стекло (альтернативный вес для ткани)Мацунамина заказЗащитное стекло можно использовать в качестве груза для ткани.
for SEM
inverted микроскопOlympusIX81
сканирующий электронный микроскопJEOLJSM-6510
), конденсатор ,

Ссылки

  1. Nonami, Y., Narita, K., Nakamura, H., Inoue, T., Takeda, S. Developmental changes in ciliary motility on choroid plexus epithelial cells during the perinatal period. Cytoskeleton. 70 (12), 797-803 (2013).
  2. Bisgrove, B. W., Yost, H. J. The roles of cilia in developmental disorders and disease. Development. 133 (21), 4131-4143 (2006).
  3. Fliegauf, M., Benzing, T., Omran, H. When cilia go bad: cilia defects and ciliopathies. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (11), 880-893 (2007).
  4. Oh, E. C., Katsanis, N. Cilia in vertebrate development and disease. Development. 139 (3), 443-448 (2012).
  5. Shah, A. S., Ben-Shahar, Y., Moninger, T. O., Kline, J. N., Welsh, M. J. Motile cilia of human airway epithelia are chemosensory. Science(New York, N.Y). 325 (5944), 1131-1134 (2009).
  6. Kiprilov, E. N., et al. Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery). The Journal of Cell Biology. 180 (5), 897-904 (2008).
  7. Hirokawa, N., Tanaka, Y., Okada, Y., Takeda, S. Nodal flow and the generation of left-right asymmetry. Cell. 125 (1), 33-45 (2006).
  8. Narita, K., Kozuka-Hata, H., et al. Proteomic analysis of multiple primary cilia reveals a novel mode of ciliary development in mammals. Biology Open. 1 (8), 815-825 (2012).
  9. Takeda, S., Narita, K. Structure and function of vertebrate cilia, towards a new taxonomy. Differentiation; Research in Biological Diversity. 83 (2), S4-S11 (2012).
  10. Ikegami, K., Sato, S., Nakamura, K., Ostrowski, L. E., Setou, M. Tubulin polyglutamylation is essential for airway ciliary function through the regulation of beating asymmetry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (23), 10490-10495 (2010).
  11. Foster, K. W. Analysis of the ciliary/flagellar beating of Chlamydomonas. Methods in Cell Biology. 91, 173-239 (2009).
  12. Lechtreck, K. -F., Sanderson, M. J., Witman, G. B. High-speed digital imaging of ependymal cilia in the murine brain. Methods in Cell Biology. 91, 255-264 (2009).
  13. Okada, Y., Hirokawa, N. Observation of nodal cilia movement and measurement of nodal flow. Methods in Cell Biology. 91, 265-285 (2009).
  14. Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
  15. Takeda, S., et al. Left-right asymmetry and kinesin superfamily protein KIF3A: new insights in determination of laterality and mesoderm induction by kif3A-/- mice analysis. The Journal of Cell Biology. 145 (4), 825-836 (1999).
  16. Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy. The Journal of Cell Biology. 27, 137-138A (1965).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Анализ движения ресницдифференциально-интерференционный контрастный микроскопиясканирующая электронная микроскопиянаблюдение ex vivoчастота биения ресницразвитие морфологии ресницпротокол диссекции тканейметод видеотрекингаколичественная оценка подвижности ресниц
Наблюдение за Мерцательная Движения сосудистое сплетение эпителиальных клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.