Количественная социальной мотивации у мышей, используя условные связи

Краткое содержание

В этой статье описывается новый протокол количественного измерения социальной мотивации у мышей с использованием оперантного обусловливания для социального вознаграждения. Протокол полезен для измерения социальной мотивации на мышиных моделях аутизма и других расстройств социального поведения.

Аннотация

В этом протоколе, социальная мотивация измеряется в мышей через пару оперантных парадигм кондиционирования. Для проведения экспериментов, две-патрон коробки трансфера были оснащены двумя оперантного рычагов (левого и правого) и пищевой емкости в одной камере, которая затем была разделена из второй камеры с помощью автоматизированной гильотины двери, покрытой проволочной сетки. Различные мышей стимулирования, вращается по тестированию дней, служил в качестве социального стимула за проволочной сетки, и были видны только после открытия гильотины двери. Тестовые мышей обучали рычажного пресса для того, чтобы открыть дверь и получить доступ к партнеру стимула в течение 15 сек. Постепенно увеличивается на фиксированный график 3. сессий тестирования количество рычага прессов, необходимых для получения социального награду закончилась после испытаний мышей остановился нажатия на рычаг в течение 5 минут подряд. Последнее усиленный отношение или останова может быть использован в качестве количественной меры социальной мотивации. Для второго парадигмы, тМыши EST обучали различать левый и правый рычаг прессов с целью получения либо пищевого вознаграждения или социальной вознаграждение. Мыши были вознаграждены за каждые 3 прессов каждого соответствующего рычага. Количество продуктов питания и социальных выгод можно сравнить как измерение стоимости, предъявляемые каждой награды. Отношение каждого типа вознаграждения также можно сравнить между штаммами мыши и изменение этого соотношения можно контролировать в процессе тестирования сессий для измерения насыщения с данного типа вознаграждение. Оба этих оперантного кондиционирования парадигмы весьма полезны для количественной оценки социальной мотивации в мышиных моделях аутизма и других нарушений социального поведения.

Введение

В последние годы, увязка генетических и экологических факторов, нарушений социального поведения в том числе расстройства аутистического спектра, привел к разработке моделей, предназначенных для мыши исследовать роль этих факторов в социальном поведении. Это создало спрос на новые методы для характеристики социального поведения у мышей, включая количественную меру социальной мотивации ^1.

Есть несколько установленных парадигмы, которые могут быть использованы, чтобы продемонстрировать социальную мотивацию у мышей, однако; все они имеют серьезные ограничения на их способность количественно прочность мотивированного поведения. Например, некоторые из самых ранних поведенческих оценок включают простые наблюдения социальных взаимодействий между двумя грызунов, которые никогда не встречались. Несколько поведения, включая приближается, следуя, принюхиваясь, и холить часто измеряются, и может обеспечить индекс социальной мотивации. Эти исследования были проведены первоначальноу крыс ^2-5, а потом адаптированы для использования в мышей ^6,7. Привыкание / dishabituation парадигмы социального признания, в которых тест животное подвергается неоднократно в той же стимула животного (привыкания), а затем подвергается новой животного (dishabituation) также обеспечивают измерение социальной мотивации ^8. Как этикетки предложить, типичные животные покажет привыкли поведенческую реакцию на повторное присутствии тех же животных, но по стимулированию продемонстрирует dishabituation, или возвращение к исходному, при контакте с новым животным. Ответ, скорее всего привыкание демонстрирует снижение мотивации испытуемого мышь, чтобы взаимодействовать с стимула мыши. Социальные выбор парадигмы, позволяющие тест мышь, чтобы выбрать между пустой камере и стимула мыши ограниченного в другую камеру были также использованы для оценки социальной мотивации. Суд, как правило, начинается с размещения тест мышь в нейтральной, центральной камере. Некоторые версии этой задачи привлечь тethering стимула мыши одной камере ^9. Модификация этой задачи используется использование проволоки корпуса над стимулирования мышей, избегая прикрепление стимулирования животных ^10. Совсем недавно, социального условный место предпочтения задача была разработана в котором мышам кондиционером ассоциировать визуально различимых камеры или с наличием или отсутствием социального партнера, а затем позволили исследовать пустые камеры следующие кондиционирования ^11. Больше времени провел в камере, где ранее произошла социальные пар считается показателем социальной мотивации.

Все выше парадигм предоставляют ценные данные, связанные с социальной фенотипирования мышей. Тем не менее, в то время как можно наблюдать, демонстрирует ли мышь "желание" искать социальное взаимодействие в указанных парадигм, сила этого "желание", то есть., Социальной мотивации, трудно измерить. Сила мотивированного поведения имееттрадиционно измеряется в грызунов путем создания сценария, в котором они должны работать для того, чтобы получить доступ к источнику их мотивации. Это, как правило, включает в себя учебные грызунов в оперантного парадигмы участием пищи, как мотивирующего фактора. Тем не менее, этот метод был использован ранее для расследования социальной мотивации у крыс, но ни связанных с доступом к сексуальным партнером для самцов крыс или, для женщин, доступ к своим щенкам (обзор в Мэтьюз и др., 2005) ^12,13.

До развития парадигм социальной мотивации, описанных ниже, там был только один исследование, исследовали социальную мотивацию за пределами сексуальной мотивации с помощью оперантного парадигмы с мышами ^12. В этой серии экспериментов, беспородных мышей Swiss Webster были обучены нажимать на рычаг, чтобы получить доступ к однополой конспецифической. В одном эксперименте, значительно уменьшается время ожидания, чтобы начать отвечать за доступ к целевой МОВе была продемонстрирована в индивидуальном размещены мышей по сравнению с мышами, групповых расположен предлагая повышенную мотивацию искать социальную доступ в этих социально изолированных мышей. В другом эксперименте того же исследования, было проведено сравнение между солевым раствором и антагониста окситоцина (атозибана) инфузии мышей. Интересно, что мыши препарата-инфузии показали значительно повышенную задержку, чтобы начать отвечать за доступ к целевой мыши предполагая снижение мотивации для социальной вознаграждение у этих мышей.

В то время как эти эксперименты представляют собой благородную попытку количественно социальной мотивации у мышей с помощью оперантного кондиционирования, они были также очень ограничены и в значительной степени улучшены с помощью методов, описанных ниже. Например, очевидно, фундаментальный недостаток в первом эксперименте описано выше (эксперимент 2 фактического исследования) было использование исследователей всего 2 целевых мышей чередовались по тестированию дней. Предыдущие исследования показали, что социальное признание в группе-расположенмыши могут длиться в течение, по крайней мере 7 дней, ведущих к снижению социальных расследования при повторном воздействии той же цели ^14. Тем не менее, общественное признание в индивидуальном размещены крыс и мышей исчезает в течение 1 - 2 ч, так что социальное исследование продолжительность остаются на базовом уровне, если повторное воздействие той же цели, по крайней мере 2 часа после первоначального воздействия ^15-17. Уменьшается задержка индивидуально-размещены мышей, чтобы начать отвечать за социальную доступа сообщили в Matthews и др. Эксперимент может быть следствием отсутствия общественного признания целевых мышей через ¹² дней тестирования. Этот потенциал путать контролируется в течение ниже способов при использовании нового целевого мыши на каждой испытательной день. Кроме того, в обоих экспериментах с Мэттьюз и др. Изучение описано выше, не было различий в сообщалось общего количества рычажных прессов, заключенных между группами. Вполне возможно, что разница в общей прессов рычага могли бы бытьан обнаружить, если исследователи использовали постепенно увеличивая соотношение ответов на вознаграждение, используемый в нашей дизайн-исследования, изложенной ниже. Кроме того, доступ к целевой мыши контролируется вручную экспериментатором, поднимая коробку, которая закрывала цель. Использование автоматически контролируемой гильотинного двери для доступа к целевой мыши исключает возможность артефакта из-за присутствия экспериментатора. В самом деле, для того, чтобы полностью автоматизировать социальная мотивация оперантного парадигмы, исследовательское оборудование было адаптировано как описано ниже.

Протокол

Это исследование было одобрено Комитетом по Уходу за животными и использованию Азуса Pacific University в. Все процедуры, связанные с животными проводились в соответствии с рекомендациями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных от Национальных Институтов Здоровья.

1. Изменение Аппараты для социальной мотивации и сравнение Валенсии тестирования парадигмы

1. Для того, чтобы проверить мышей в оперантного задач социального поведения, изменить центральный канал коробки Модульная трансфера. Эти коробки трансфера измерения 44 см х 17,3 см и изготовлены из плексигласа и нержавеющей стали.
2. Изменить программируемый дверь-гильотина путем установки проволочной сетки на лице дверной коробки. Проволочную сетку должны позволить ограниченное социальных контактов, но не позволяют мышей пересекать из одной камеры в другую.
3. Использование программируемого дверь-гильотина, разделите каждую коробку в двух палат: каждый размером примерно 22 см х 17,3 см. Назначить одну камеру как-йэлектронной испытательной камере, а другой в качестве целевого камеры.
4. Поместите рычаги мыши в испытательной камере на стене, противоположной двери гильотинного. Поставьте емкость жидкого ковш пищи между двумя рычагами мыши.
5. Программа рычаги мыши либо откройте дверь-гильотина или представить награду жидкой пищи, в зависимости от тестирования парадигмы.
6. Подключить переносной кнопку на аппарате и программы его открыть дверь-гильотина (для ручного формирования тестовой мышей).
7. Установите каждую коробку трансфер с контроллером ввода / R восемь каналов для мониторинга активности по металлической сеткой этаже каждой камеры. Смонтировать USB цифровой видео камеры над испытательной камере и подключите его к компьютеру. Заключите весь аппарат в течение меламина звука-ослабления кабиной.
8. Запуск программы с помощью оперантного индивидуальные программы, написанные в лаборатории.

2. Формирование Мыши для социальной мотивации Paradigm

1. Сделайте пробный мыши в тестовом СHamber и возраст и пол соответствием стимулом мыши в камере мишени.
2. Поезд тест мышь, чтобы нажать на рычаги, чтобы открыть дверь-гильотина, используя метод формирования или укрепления последовательных приближений к желаемой оперантного ответ. Во время этой процедуры формования, доставить подкрепление вручную, нажав кнопку ручного запрограммированный для управления дверь-гильотина.
   Примечание: Арматура состоит из открытия дверь-гильотина в течение 15 сек, что позволяет доступ к стимула мыши сквозь проволочную сетку.
3. Обратите внимание на мышь в испытательной камере с помощью камеры, установленной над испытательной камере.
4. Поезд каждой мыши в серии 30 мин ежедневных сеансов, пока они не демонстрируют, по крайней мере 10 оперантного ответов (рычаг прессы) в 3 из 5 сессий подряд тестирования. Поверните мышей через челночных коробок с использованием рандомизации.
5. Если мыши не достигнуть этого критерия через 30 ежедневных тренировок, снять мышей от эксперимента и Дезиgnate как не-учащихся.
   Примечание: количество ежедневных тренировок может быть расширено за пределы 30 в зависимости от предпочтений исследователя.
6. Альтернативн стимула мышей, используемых при формировании так, чтобы отличаться мыши используется каждый день.
7. Чистые ящики трансфера между каждой тренировке с использованием 70% этиловый спирт. Кроме того, после завершения тестирования каждый день, чистые все оборудование с помощью дезинфицирующего моющего средства.

3. Тестирование Мыши в социальной мотивации Paradigm

1. Поставьте обученный тест мышь в испытательной камере и возраст и секс соответствием стимул мышь в камере мишени. Во время тестирования, использовать бассейн по меньшей мере 10 стимулирования мышей, чтобы назначить в каждую тестовую мыши так, что стимул мышей повторяется только после 10 ежедневных сеансов испытаний. Не используйте мышей стимулирования, используемые во время формирования для тестирования.
2. Программирование гильотины дверь открыть на прогрессивной график соотношения арматуры, так что число оперантного Reответах (рычаг) прессы, необходимые для получения социальной награду 15 сек доступ к целевой мыши арифметически увеличивается в фиксированной ставке 3 Каждое испытание.
3. Программирование тестовых сессий до конца, когда тест останавливается мыши нажатия на рычаг в течение пяти минут подряд.
4. Запишите последний завершенный (усиленный) соотношение как точки останова. Использование данного зависимого меру в качестве показателя социальной мотивации. Проверьте каждой мыши в течение 20 последовательных ежедневных сеансов или, по крайней мере, 10 тестовых сессий после наблюдаются асимптотические уровни производительности.
5. Протрите коробки трансфер между каждой сессии тестирования с использованием 70% этиловый спирт и после завершения тестирования каждый день, используя дезинфицирующий моющее средство.

4. Валентность Сравнение социальных сравнении продовольственной Награда

1. После того как все мыши завершить мотивации парадигму социальной, проверить эти же мышей в задаче, предназначенная для сравнения валентность социальной награду с тем из пищевого подкрепления.
2. Программа один рычагчтобы открыть дверь гильотины и представить социальную награду за 15 сек и запрограммировать противоположное рычаг, чтобы представить награду жидкой пищи в течение 15 сек.
   Примечание: награда жидкая пища используется в данном протоколе состоял из сгущенного молока с добавлением сахара 0,2% сахарозы. Подготовьте достаточное количество (обычно 500 мл) в течение неоднократно представляя награды 0,02 мл каждой мыши.
3. Связать испытания мышей чередующиеся рычаг / вознаграждение непредвиденных для контроля потенциальных отклонений рычага среди мышей. Таким образом, назначить половину мышей в каждой группе тестирования на левом рычаге награды / пищевой и правый рычаг / социальной вознаграждение непредвиденных а другая половина на левом рычаге / социальной вознаграждения и правый рычаг / пищевой вознаграждение непредвиденных.
4. Поезд мышей для сравнения валентной социального против пищевого подкрепления.
   1. Сделайте пробный мышь в испытательной камере и поместите возраст и секс соответствием стимул мышь в камере мишени.
   2. Сделайте всего один рычаг / вознаградить непредвиденных активное время каждой тренировки. Обучение состоитшесть сессий 1 час, которые чередуются между непредвиденных каждый день. Альтернативные мышей стимулирования назначенные каждой тестовой мыши каждый сессии социального награда.
   3. Поддерживать мышей на их вволю чау диете во время обучения и тестирования с пищевой наградой. Лишение пищи не является необходимым для инструментального кондиционирования у мышей с использованием сгущенного молока и раствора сахарозы ^18.
5. Тестирование мышей для сравнения валентной социальной против пищевой наградой.
   1. Программирование расписания арматуры при фиксированном соотношении 3: 1, так что каждый третий рычаг пресса усилены, но только соответствующей связанной награды.
   2. Программа испытаний сессий для запуска в течение 60 мин.
   3. Сделайте пробный мышь в испытательной камере и поместите возраст и секс соответствием стимул мышь в камере мишени. Примечание: В тот же пул 10 стимулирующих мышей, используемых в задаче социальной мотивации можно использовать снова, но назначен тестовых мышей с использованием 10-дневный вращение с.
   4. Теул мышей в 20 ежедневных сеансов следующих 6 дней обучения или, по крайней мере 10 ежедневных сеансов после наблюдения асимптотических уровней производительности. Основные зависимые меры для этой парадигмы является общее количество рычага прессов для каждого типа вознаграждения.
   5. Еще раз, протереть окна трансфера между сессиями тестирования с использованием 70% этиловый спирт и После каждого испытания день, используя дезинфицирующий моющее средство.

Результаты

Этот протокол был использован для сравнения просоциального C57BL / 6J штамма инбредных мыши с BTBR инбредной линии мышей, которая была ранее сообщалось, чтобы показать уменьшается в социальном поведении ^10,18. Было также использоваться, чтобы характеризовать социальную мотивацию в различных штаммов нокаутом мышей гипотетических, что повышению или понижению социальной мотивации. Ранее опубликованные результаты сравнивали C57BL / 6J и BTBR штаммов инбредных мышей показано на рисунке 1. Эти результаты показали, снизилась социальная мотивация для мышей BTBR по сравнению с C57BL / 6J мышей. Валенсия Сравнение парадигма также продемонстрировали снизился пищевой мотивации для мышей BTBR предлагая общее снижение мотивированного поведения для этого штамма (рис 1B).

2А представлены некоторые неопубликованные предварительные данные, сравнивающие братьев и сестер дикого типа на фоне деформации C57BL / 6 с гетерозиготными и homozygoнам нокаут братьев и сестер с ограниченной или отсутствующей белкового продукта из гена (ген X) предположили, содействовать социальному мотивацию. 2В представлены некоторые неопубликованные предварительные данные, сравнивающие братьев и сестер дикого типа на фоне деформации C57BL / 6, гетерозиготных нокаутом братьев и сестер с ограниченной белкового продукта из ген (ген Y) предположили, чтобы уменьшить социальную мотивацию. Предварительные данные от каждого из этих исследований подтверждают гипотезу каждого соответствующего и далее продемонстрировать ценность описанных оперантного социальная мотивация парадигм.

Рисунок 1. Ранее опубликованные результаты из социальной мотивации и валентной парадигм сравнения. () Среднее останова индивидуально-расположен (IH) мышей В6, групповых расположен (GH) мышей В6 и групповых расположен BTBR мышей через последние 10 дней тестирования в задаче социальной мотивации. Былов общей сложности 9 мышей в каждой группе. Индивидуально и в группах-B6 расположен мышей выполняется так же, но не было существенной разницы между В6 и BTBR мышей групповых расположен (т = 2,741, DF = 16, р = 0,015). (Б) среднее число питания наград и социальных наград за групповой расположен B6 и BTBR мышей через последние 10 сессий сравнения валентность парадигмы. Обе группы мышей получили значительно больше продовольствия, чем награды социальных вознаграждений (BTBR: T = 3,551, DF = 8, р = 0,007; В6: т = 9,478, DF = 8, р <0,001). Однако, мыши BTBR приобрела значительно меньше продовольствия награды, чем мышей В6, а также наименьшее количество социальных вознаграждений (т = 3.321, DF = 16, р = 0,004). Рисунок редактировался Reference ^18.

Рисунок 2. Типичные результаты неопубликованного исследования, использующего парадигму мотивации социального. () Среднее останова (Последнее армированного соотношение) достигнута до мышей остановилась нажатия на рычаг в течение 5 мин. Для гена X, в общей сложности 12 Вт, 7 HET, и 6 КО мышей были протестированы в мотивации парадигмы социальной. ANOVA показал существенное различие между генотипами (F = 7,18, DF = 2, 22, р = 0,004). Постфактум испытания Тьюки HSD показал, что КО мышей выполняется значительно ниже контроля WT. (B) Для гена Y, в общей сложности 8 HET и 6 WT мышей были протестированы. Независимых выборок т-тест показал значительное различие между генотипами (Т = 2,26, DF = 8,97, р = 0,05). * Указывает существенное отличие от мышей дикого на 0,05 альфа-уровне.

Обсуждение

Оперантного парадигмы социальной мотивации, описанные в этой статье, являются мощными инструментами для характеристики социального поведения в мышиных моделях болезни человека. Вместо того, чтобы позволить тест мышь, чтобы пассивно выбрать социальную встреча, эти парадигмы требует усилий от тестируемого мыши, чтобы получить социальную награду. Количество усилий, что тест мышь готова произвести для получения социальной награду дает количественную меру социальной мотивации. Кроме того, через сравнения валентность парадигмы, мотивированное поведение можно сравнить разных типов вознаграждения. Оба эти оперантных парадигм может быть использован для оценки сексуального и родительские мотивы, а представляя соответствующий стимул на противоположной стороне двери гильотинного.

Развитие этих парадигм социальной мотивации участие устранения неполадок нескольких ключевых переменных. Например, через пилотные исследования количество времени, что награда я социальныйы представлены был снижен с 30 сек до 15 сек. Хотя в это время является достаточным для социальных взаимодействий между испытаний и стимулирования мышей, будущие исследования могут оптимизировать количество времени для социальной вознаграждение. Точно так же, постепенно увеличивая соотношение рычага прессов в социальных наград была снижена с фиксированной скоростью от 5 до 3 на основе пилотного исследования.

Количество дней, необходимых для достижения асимптотической нажатия на рычаг поведение изначально оценивали через 30 дней ежедневных сеансов испытаний. Было установлено, что большинство мышей достижения асимптоты в 7 дней, так что количество тестовых сессий была снижена до 20 Daily производительности действительно колеблется, однако, так усреднения данных за последние 10 дней обеспечивает асимптотическую производительность, а также обеспечения лучшего индекс истинного среднего производительности чем меньшим количеством тестовых дней. Исследователи должны контролировать свои данные, чтобы убедиться, что асимптотическая эффективность достигается в течение 10 тестовых дней или модифицировать протокол по мере необходимости.

Траоцен- ками заседания были также снижены с 1 часа до 30 минут. Количество учебных сессий, необходимых действительно зависит от штамма мыши и некоторых мышей может быть произвольно обозначены как nonlearners после фиксированного числа учебных сессий ^18. Количество учебных дней, необходимых для достижения критерия для продвижения к испытательной парадигме предоставляет другой индекс социальной мотивации и, таким образом, достоин слежения. Исследователи также можете поэкспериментировать с различными вариантами пищевой наградой для сравнения валентность парадигмы. Тем не менее, важно, чтобы тестовые мышей, первоначально подготовку используя чисто социальную вознаграждение, а затем испытывают в мотивации парадигмы социальной перед началом сравнения валентность парадигму.

Эти оперантного парадигмы социальной мотивации могут быть изменены и улучшены путем измерения дополнительных переменных, чем те, которые указаны в протоколе выше. Например, расположение каждой мыши в его соответствующей камере можно отслеживать с помощью Currently доступны коммерческое программное обеспечение. Кроме того, конкретные модели поведения, включая нос к носу контакта или ультразвуковых вокализации может быть засчитан в течение социальных взаимодействий. Исследователи могут далее эксперимент с настройками в соотношениях, используемых в мотивации парадигмы социальной или испытаний, связанных с отсутствием социального партнера или даже сравнений с участием других стимулов позади гильотины двери, такие как видео или даже одному виду марионетку. Для сравнения валентность парадигмы, анализ динамики выбора всей испытаний может предоставить дополнительную информацию о сдвигах в мотивации из-за насыщения для определенного типа вознаграждения ^18.

В то время как эти оперантного парадигмы социальной мотивации обеспечить столь необходимую инструмент для количественной оценки социальной мотивации у мышей, они имеют некоторые ограничения. Во-первых, эти парадигмы требуют мышей имеют когнитивные способности, чтобы сделать узнал ассоциации между нажатия на рычаг и социальной вознаграждение. Некоторые модели мыши могутесть дефицит и когнитивных и социальных способностей, что делает его трудно оценить социальную мотивацию, используя эти парадигмы. Во-вторых, природа социального столкновения ограничена, как мышей только могут взаимодействовать через проволочную сетку. Однако, мыши все еще в состоянии успешно участвовать во многих типичных социального поведения, в первую очередь, нос к носу исследования. Последним ограничением этих методов является то, что они являются трудоемкими и требуют много времени, чтобы быть завершена. Обучение и тестирование через обе парадигмы требуется минимум два месяца ежедневных занятий. Некоторые мыши могут занять гораздо больше времени, чтобы узнать рычаг прессования ассоциацию растяжения необходимое количество сеансов. В то время как парадигмы, конечно, не квалифицируются как методы высокой пропускной, данные, которые они производят очень ценным и стоит обязательно приложения труда. Тем не менее, чтобы обеспечить более полное характеристику социального поведения конкретной модели мыши, рекомендуется, что эти парадигмы быть намиред в сочетании с другими известными методами измерения социального поведения у мышей.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Модульный шаттл Box	Med Associates Inc.	ENV-010MC
Автоматическая гильотинная дверь	Мед Ассошиэйтс Инк.	ENV-010B
Рычаги мыши	Мед Ассошиэйтс Инк.	ENV-3010M
Жидкостный ковш с пищевой емкостью	Med Associates Inc.	ENV-202M-S
Восьмиканальный контроллер ввода	Мед Ассошиэйтс Инк.	ENV-253C
Меламиновая звукопоглощающая труба	Мед Ассошиэйтс Инк.	ENV-016MD
MED-PC IV Программное обеспечение	Med Associates Inc.	MED-PC IV
Камера Microsoft Lifecam	Сетки Microsoft
Wire Grid			Wire можно приобрести в магазине жестких конструкций. Из верхней части клетки для мышей мы вырезаем проволочные сетки.
70% этилового спирта			Используется для очистки челночных коробок между мышами. Конкретный бренд не нужен.
Evaportated Milk Carnation			0,02 мл в сочетании с 0,2% сахарозой за каждую награду на мышь. Мы всегда покупаем одну и ту же марку для лучшей стабильности.
Сахароза			Любая марка чистого сахарного песка будет подлежать, так как он растворен в сгущенном молоке.