Изучение белка функции и роль Altered экспрессии белка с помощью интерференции антител и трехмерных реконструкций

Краткое содержание

Контроль экспрессии белка не только важен для каждого живого организма, но и является важной стратегией для исследования функций белка в клеточных моделях. Представленный протокол демонстрирует применение интерференции антител в клетках млекопитающих, включая первичные нейроны гиппокампа, и демонстрирует использование трехмерных реконструкций при изучении функции белка.

Аннотация

Строгое управление экспрессии белка не только важное значение для любого организма в живых, но и является важной стратегией для исследования функции белка в клеточных моделях. Таким образом, недавние исследования изобрели различные инструменты для целевой экспрессии белка в линии клеток млекопитающих или даже животных моделей, в том числе и РНК интерференции антител. В то время как первая стратегия собралось много внимания в течение последних двух десятилетий, пептиды, опосредующие транслокации антител через грузов клеточных мембран и в клетки, полученные гораздо меньший интерес. В этой публикации, мы предоставляем подробный протокол, как использовать пептидный носитель под названием Chariot в эмбриональных клетках почек человека, а также в первичных нейронов гиппокампа проводить эксперименты интерференции антитела и дополнительно иллюстрируют применение трехмерных реконструкций при анализе функции белка. Наши результаты показывают, что колесница, вероятно, из-за его сигнала ядерной локализации, particulaRly хорошо подходит для белков-мишеней, проживающих в сомы и ядра. Примечательно, что при применении колесницы первичных гиппокампа культур, реагент оказалось на удивление хорошо принят диссоциированных нейронов.

Введение

Жесткий контроль экспрессии белка имеет важное значение для каждого живого организма командовать свое развитие, а также реагировать на внешние сигналы. Следовательно, множество механизмов, было изобретено в процессе эволюции, чтобы точно регулировать уровень экспрессии каждого белка, кодируемого приложением. существующие в любой эукариотической клетке в любой момент времени ее жизни 20000 генов. Происходящие на разных этапах производства белка, регулирующие механизмы варьируются от управления структуры хроматина, транскрипции и РНК обработки в направлении посттрансляционных модификаций белка, транспорта и деградации.

Поэтому не удивительно, что сбои в основной молекулярные механизмы и уровни экспрессии белка измененное были связаны с различными заболеваниями, такими как рак или с ограниченными умственными. Действительно, глядя на выдающуюся сложность развития нейронов и функции мозга у млекопитающих, в Sensiствительность этих сложных систем к изменениям в экспрессии белка проявляется в нескольких известных интеллектуальных дефицитов, включая болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона (AD и PD), а также расстройствами аутистического спектра (ASD), как хрупкая синдром Х (FXS). Последнее заболевание характеризуется обширным неправильная экспрессия множества белков, которое происходит из - за потери одного перевода регуляции белка, FMRP (Хрупкие Х умственная отсталость белковом) ^1-4. Кроме того, хромосомные перестройки , влияющие на Variable заряд х связанный белок А (VCXA), белок, который управляет стабильность мРНК и трансляцию путем модификации мРНК укупорки ^5, в последнее время были связаны с интеллектуальным дефицитом, в то время как точечные мутации не были выявлены у пациентов с когнитивными расстройствами как сейчас ^{6, 7,} предполагая , что наблюдаемые психические нарушения происходят из измененной экспрессии VCXA и дизрегуляции выражение своей целевой защдюймы В соответствии с этими выводами, исследования следственным Novo копии вариации числа генов , которые связаны с ASD установлено ли де что новые дупликации генов и делеции являются существенным фактором риска для ASD ^8, тем самым поддерживая идею , что повышенные или уменьшенные уровни экспрессии белка может привести к интеллектуальные дефициты.

Примечательно, что недавние исследования также при условии доказательства того, что уровень экспрессии данного белка четко настроена , чтобы предотвратить его агрегации , как следствие больших количеств белка с почти полным отсутствием запаса безопасности ^9. Поэтому было предложено , чтобы даже небольшие приросты достаточно , чтобы вызвать такие заболевания, как AD и PD ^9. Хотя разнообразие молекулярных механизмов , способствующих регуляции экспрессии белка предполагает сложную схему регулирования в свете этих выводов, исследование исследования уровня экспрессии более чем 5000 генов млекопитающих ¹⁰ показано , чтоприрода предпочитает более экономной схеме: было показано Клеточный обилие белков , предназначенных преимущественно регулируется на уровне трансляции ^10, тем самым иллюстрируя , что руководство наличия РНК в основном служит для тонкой настройки экспрессии белка.

Изучение дозы интерес белков (ИКП), следовательно, не только важно для понимания эндогенных функций белка, но также и к исследованию многих заболеваний и разработки методов лечения. Таким образом, в последние десятилетия наблюдается продвижение нескольких стратегий с использованием РНК-интерференции для манипулирования дозы POI. Хотя РНК - интерференции широко используется для изучения функции белка и даже применяется в клинических испытаниях для лечения рака или глазные заболевания, а также проводить противовирусные терапии у пациентов ^11-13, некоторые трудности могут возникнуть , которые могли бы сделать стратегию невозможно. Например, последовательность семян, которая приводит в действие нокдаун по гомологии является сравнительдаемых Короче говоря, тем самым содействуя вне целевых эффектов. Так как очень эффективные последовательности являются редкими и должны быть найдены среди тысяч вариантов (обзор в ^14), определение правильной последовательности может быть длительным и дорогостоящим, но результаты все еще ​​может быть разочарование.

Альтернативной стратегией является непосредственно целевой POI антителами. Здесь мы проиллюстрируем использование белковый носитель Chariot (производства активной Motif), чтобы уменьшить клеточное наличие белка, а также применение трехмерных реконструкций для изучения функции белка следующие нокдауна.

Активный мотив Chariot, непосредственно 2,8 кДа пептид, используют пептиды , челнок, белков и антител через мембраны клеток млекопитающих ^15. Пептидные ассоциируется с POIs путем формирования нековалентно связаны высокомолекулярные комплексы, использующие гидрофобные взаимодействия, после чего Chariot-ТОИ комплексов усваиваются в клетки в эндосомы-INDependent образом. Важно отметить, что Chariot было указано ни то, чтобы влиять на внутриклеточную локализацию белков челноке, и не оказывать цитотоксическое действие или повлиять на биологическую активность его груза ^15.

Протокол

1. Исходные растворы

1. Ресуспендируют лиофилизированный порошок активного мотив в стерильной H ₂ O до конечной концентрации 2 мкг / мкл. Нажмите тщательно для смешивания.
2. Подготовка небольших аликвот (например, 12 мкл каждого, 2 мкл необходимого для каждой реакции) и хранить их при температуре -20 ° С.

2. Получение клеток

1. Семенной клетки млекопитающих, такие как клетки НЕК293, или первичных нейронов на 24-луночный планшет в 500 мкл среды на рост в том числе антибиотиков.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании нейронов, семян клеток при низкой плотности и использовать только два средних ряда на 24-луночного планшета. Каждая скважина будет таким образом иметь пустой аналог укрывать среды во время инкубации (стадия 4.2). При работе нейронов, всегда убедитесь, что клетки не удерживаются вне инкубатора для более чем на несколько минут.
2. Культуры клеток в соответствующих условиях (увлажняется, 5% CO ₂ и 37 ° С) до тех пор , пока клетки не являются приложения. 50%вырожденная.
   Примечание: При использовании нейронов, культивирования клеток до желаемой стадии развития достигается и изменить приложение. 25-50% среды два раза в неделю. Среда: Neurobasal среда (содержащий 1x B27, 5 мМ L-глютамин и 1x пенициллина и стрептомицина, сравните с реф 16).

3. Chariot Комплексообразование

1. На реакцию, разбавить 0,1-2 мкг POI или соответствующим антителом, а также в качестве контрольного белка, или контрольного антитела, соответственно, в 50 мкл PBS.
   Примечание: Этот метод также работает с макромолекулярных комплексов , состоящих из предварительно связаны первичными и вторичными антителами (Cp 'Представитель Результаты', Рисунок 1.). Смешать и отжим.
2. Для каждого образца, разбавить 2 мкл Chariot исходного раствора в 50 мкл PBS с использованием отдельных труб, чтобы избежать самоассоциация Chariot. Смешать и отжим.
3. Перенесите разбавленный POI или антитела (шаг 3.1) к размыванию Chariot по пипеткойтин. Смешать и отжим.
4. Выдержите смесь в течение 30 мин при комнатной температуре (Chariot-POI комплексов сформирует).

4. Трансфекция клеток

1. Развести меркава комплексы (этап 3.4) в 100 мкл предварительно нагретом ростовую среду (37 ° C, без добавок). Удалите среду и промыть клетки один раз с использованием предварительно подогретый 1x PBS.
   Примечание: При использовании нейронов, не отбрасывать среду, то он будет использован повторно. Хранить при 37 ° С. Для промывания используют PBS , содержащем 0,5 мМ MgCl ₂ и CaCl _2.
   Предложение: сохранить среду в пустых лунок во время инкубации пластины (шаг 4.5).
2. Применить комплексное решение Chariot (шаг 4.1) к клеткам и рок-клетки осторожно, чтобы обеспечить равномерное распределение раствора. Растут клетки в стандартных условиях (шаг 2,2) в течение 1 ч. Добавить сыворотки до конечной концентрации 10%. При использовании нейронов, добавить среду, начиная с шага 4.1. Растут клетки в течение от 1 до 2 часов более.
   Обратите вниманиеОптимальное время инкубации зависит от размера и свойств груза и, возможно, потребуется скорректировать опытным путем. Следующие предложения могут служить в качестве руководства: Для получения пептидов, 1 час, обычно достаточно, белки 1-2 ч рекомендуется, на наличие антител 2 ч, а для трансфекции нейронов с антителами 4 ч.
3. Технологические ячейки для анализа, как обычно. Обратите внимание: метод совместим с экспериментами с использованием протоколов фиксации, а также живого изображения.

5. обработки изображений

1. С помощью лазерного сканирующего микроскопа, возьмите Z-стеки клеток и / или клеточных отсеков, представляющих интерес использованием около 0,25-0,5 мкм расстояние. Расстояние точный слой зависит от размера структуры реконструируемых и должна быть определена индивидуально.

6. Реконструкция

1. В следующих шагах, используйте нижнюю Esc для переключения между кнопками перемещения, Cntr выбрать несколько объектов, нажав Oп их и смена ключа для вырезания объектов (ср. шаг 6.10).
2. Откройте LSM-файл в Imaris.
3. Использование дисплея Настройка для каждого канала, контрастность изображения до тех пор яркие структуры не достигают насыщения. Обратите внимание, что эта корректировка не будет влиять на конструкцию поверхности, она служит только для оказания помощи экспериментатора в пороговой изображения.
4. Нажмите на иконку Добавить новые поверхности. Мастер откроется.
5. Выберите: Сегмент только интересующей области. Перейдите к следующему шагу.
6. Отрегулируйте допустимые пределы поля выбора, чтобы соответствовать ваш объект интереса. Пожалуйста, имейте в виду, что изображение имеет 3-х измерениях, и что выбор должен быть отрегулирован на плоскости г, а также. Если прямоугольная форма коробки отбора не должен совпадать с объектом интереса должным образом, повернуть объект и / или увеличить окно, пока все необходимые структуры, не встроены. Нежелательные объекты могут быть удалены позже (ср. Шаг 6.10). Продолжить.
7. Выберите подходящий чAnnel. Уровень детализации Площадь поверхности или диаметр сферы должны быть установлены в соответствии структуры реконструируется. В зависимости от характеристик сигнала, может быть использован как абсолютная интенсивность или Локальный контраст. Как правило, Локальный контраст работает лучше для диффузных сигналов. В любом случае, параметры должны быть отрегулированы отдельно для каждого сигнала или интересующей структуры, соответственно.
8. С помощью инструмента выбора порога реконструировать интересующую структуру.
9. Завершить реконструкцию, нажав на зеленой стрелкой внизу на.
10. Отрегулируйте объект дальше, используя инструмент карандаш, чтобы вырезать и удалить поверхности по мере необходимости. Это возможно только сократить в направлении север-юг, поэтому, наклонить изображение для того, чтобы вырезать нужный объект.
11. Получите измерения объема, площади и интенсивности для каждой поверхности, выбрав статистики, детальной статистике, и средние значения.
12. (Необязательный шаг) Для наблюдения цветные статистики (ср. Рис 2E и F), выберите вкладку цвета соответствующей поверхности и отметьте 'закодированы статистики' вместо 'Base'. будет отображаться несколько вариантов.

Результаты

В следующих параграфах, в качестве примера результаты , иллюстрирующие функциональную нокдаун в POI (Simiate, для получения более подробной информации см ^{16, 17)} с помощью Chariot реагента и интерференция антитела представлены. Полученные результаты показывают, что уменьшенная экспрессия Simiate снижает транскрипционную активность, и, в дозированной зависимым образом, индуцирует апоптоз, что привело показатели смертности более чем на 99%, если применяются более высокие количества антител...

Обсуждение

Здесь мы приводим протокол для изучения значимости уровней экспрессии белка в контроле клеточных функций в дозе ориентировкой. Протокол, описанный позволяет отлаженная манипуляции экспрессии белков в различных типах клеток млекопитающих, в том числе нейронов гиппокампа, следовательно, облегчая детальные исследования функции белка на клеточном уровне.

Хотя РНК - интерференция представляет собой хорошо известную стратегию вниз регламентировать объектов POI, он имеет свои недостатки (ср. ^1...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Chariot	Active Motif	30025	магазин при -20 °deg; C
Нейробазальная среда	Life технологии	21103-049	прогрев до 37°°; C перед использованием
1x B27	Life технологии	17504044	хранить при -20 °° C
L-глютамин	Life technologies	25030-149	магазин при -20° C
Пенициллин и стрептомицин	технологии Life	15140-122	магазин при -20 °°; C
Imaris программное обеспечение	Bitplane	n.a.дорогой	, но не имеющий аналогов
лазерный сканирующий микроскоп	Zeiss	n.a.