Биомембрана Изготовление растворителем-помощь липидного бислоя (SALB) метод

Summary

Мы представляем экспериментальный протокол для формирования поддерживаемый липидный бислой на твердых подложках без использования липидные пузырьки. Покажем способ одностадийного сформировать липидный бислой на диоксид кремния и золота, а также поддерживаемые мембраны с холестерином обогащенного области для различных биологических приложений.

Abstract

Для того, чтобы имитировать клеточные мембраны, поддерживаемой липидный бислой (SLB) является привлекательной платформой, которая позволяет в пробирке исследования мембранных процессов, связанных в то время придания биосовместимости и biofunctionality с твердыми подложками. Спонтанное адсорбции и разрыв пузырьков фосфолипида является наиболее широко используемым методом для формирования SLBS. Тем не менее, в физиологических условиях, слияния пузырьков (VF) ограничена только подмножество липидных композиций и твердых подложках. Здесь мы описываем один шаг общую процедуру называют методом формирования растворителей помощь липидный бислой (САЛБ), чтобы сформировать SLBS, который не требует везикулы. Способ САЛБ включает нанесение липидных молекул на твердую поверхность в присутствии смешивающихся с водой органических растворителей (например, изопропанол) и последующего растворителя обмена с водном буферном растворе, чтобы вызвать образование SLB. Непрерывный процесс обмена растворителя позволяет применениеСпособ в конфигурации проточного подходящей для формирования двухслойной мониторинг и последующих изменений с использованием широкого спектра поверхностных чувствительных биосенсоров. Способ САЛБ может быть использован для изготовления SLBS по широкому кругу гидрофильных твердых поверхностей, в том числе те, которые неразрешимыми слияния пузырьков. Кроме того, это дает возможность изготавливать SLBS, состоящих из липидных композиций, которые не могут быть получены с помощью метода слияния пузырьков. Здесь мы сравним результаты, полученные с SALB и традиционными методами слияния пузырьков на двух иллюстративных гидрофильных поверхностей, диоксид кремния и золота. Для оптимизации условий эксперимента для приготовления высококачественных бислоев, полученных с помощью метода SALB, влияние различных параметров, в том числе типа органического растворителя на стадии осаждения, скорости обмена растворителя и концентрации липидов рассматривается наряду с советы по устранению неисправностей , Формирование поддерживаемых мембран, содержащих высокие фракций холестерина также демоныtrated с методом SALB, выделяя технические возможности техники SALB для широкого диапазона конфигураций мембран.

Introduction

Сплошная поддержке липидный бислой ¹ (SLB) является универсальной платформой, которая сохраняет основные характеристики биомембран, такие как толщина двухслойной, двумерной диффузии липидов и способностью принять ассоциированных с мембранами биомолекул. Из-за сложности природных клеточных мембран, это простая платформа была показана функционировать в качестве платформы для эффективного обучения в пробирке в мембранных процессов, связанных с такими, как плот формирования ^{2, 3} связывания с белками, вирус и вирус связывания частица ^4,5 и сотовый сигнализации ^6. Сформированный в непосредственной близости от твердой подложке, платформа SLB совместим с различными поверхностно-чувствительных методов измерения, такие как полное внутреннее отражение микроскопии (TIRF), Пьезокварцевые-диссипации (QCM-D), и импедансной спектроскопии.

Некоторые методы были разработаны для получения разных типов, в том числе SLBS пузырька воздухаКрах ^{7 и} ближнего пера нанолитографии ^{8 для} субмикронных липидов пятен, спин-покрытие ^{9 для} двухслойных труб и Ленгмюра-Блоджетт (ЛБ) ¹⁰ и слияния пузырьков (VF) ^{11 для} полного Spanning, однослойных покрытий липидного бислоя. Метод В. Ф. состоит из адсорбции небольшие однослойные пузырьки в твердом носителе и последующее спонтанного разрыва и слияния с образованием непрерывной липидный бислой. Тем не менее, в физиологических условиях, разрыв спонтанное пузырьков в основном ограничивается на основе кремния материалов, таких как диоксид кремния, стекла и слюды. Кроме того, разрыв пузырьков не происходит спонтанно в течение пузырьков сложных липидных композиций, таких как те, которые содержат высокие доли холестерина или отрицательно заряженных липидов. В зависимости от системы, разрыв пузырьков может быть вызвано тем, что дополнительно пошива экспериментальных условий, таких как температура ^12, рН раствора ¹³ и солености ¹⁴ осмотического шока ¹⁵ или давлением ^{16 или} добавлением двухвалентных ионов, таких как ^Са2 + ^17. В качестве альтернативы, мембрана-активные АГ пептид может быть введен с целью дестабилизации слоя адсорбированных пузырьков, что приводит к разрыву пузырьков и формирования двухслойной по ряду поверхности ^18-22.

Кроме того, успешное формирование двухслойной требует подготовки хорошо контролируемых населения малых однослойных везикул, которые могут занять много времени, и трудно достичь определенных мембранных композиций. Таким образом, несмотря на его высокую эффективность в оптимальных случаях (например, после обширного замораживания-оттаивания предварительной пузырьков ^23), общее применение слияния пузырьков будет ограничиваться рамками соответствующих субстратов и мембранных композиций.

Способ ^24-28 растворителе при содействии липидный бислой (САЛБ) является альтернативой технология изготовления, которая не требует липидные пузырьки. Метод основан на осаждения OМолекулы липидов F на твердую поверхность в присутствии водорастворимого органического растворителя с последующей постепенной обмена этом растворителе с водным буферным раствором, чтобы вызвать образование SLB. В растворителей стадии обмена, тройной смеси липидов, органическом растворителе, и вода претерпевает фазовый переход серии с увеличением доли воды, что приводит к образованию слоистых структур в фазовых объеме раствора и SLB на твердой подложке. Важно отметить, что это самосборка маршрут обходит необходимость пузырьков разрыва, который, как правило, предельный шаг для превращения адсорбированных пузырьков в SLB. Протокол применим к широкому разнообразию поверхностей в том числе диоксида кремния, оксида алюминия, хрома, индия и олова, оксид и золота. В этой статье и в прилагаемом видео, сравнение липидного отложения в SALB и методов слияния пузырьков представлена. В частности, влияние параметров эксперимента, в том числе концентрации липидов, Скорость потока, и выбор смешивающегося с водой органического растворителя, от качества двухслойной, образованной методом SALB обсуждаются. Аналитическую характеристику изготовленного SLBS осуществляется QCM-D, флуоресцентной микроскопии, и восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) методы. QCM-D мониторинг техника измерения массы поверхности чувствительной, которые с новаторской работы, проведенной Келлер и Kasemo ^29, широко используется для количественного исследования формирование двухслойной. Флуоресцентная микроскопия позволяет осмотр мембраны однородности, а также визуализацию мембранных доменов. Методика FRAP является стандартным инструментом для определения боковой подвижности липидных молекул в SLB, который является существенным свойством жидкостных мембран.

Первая часть этого исследования предполагает QCM-D анализ SALB и методы слияния пузырьков применяется, чтобы попытаться образование двухслойной диоксида кремния и золота. Во второй части,подготовка и характеристика поддерживаемых мембран, содержащих различные концентрации холестерина с использованием метода SALB продемонстрированы и результаты сравнивают с результатами, полученными с помощью метода слияния пузырьков.

Protocol

1. Формирование поддерживаемых липидного бислоя на гидрофильных твердых поддержки

1. Подготовка липидов Маточные растворы 10 мг / мл 1,2-dioleoyl- SN глицеро-3-фосфохолин (ДОФХ) и 1 мг / мл 1,2-dioleoyl- SN глицеро-3-phosphoethanolamine- N - (lissamine родамин В сульфонил) (Rh-PE) растворением соответствующих липидов порошки (соответственно взвешены заранее с аналитическим массового баланса) в изопропаноле раствора.
2. Развести и смешивать растворы в изопропаноле с целью подготовки желаемого липидной смеси в конечной концентрации. Для флуоресцентной микроскопии и FRAP экспериментов, 0,5 мас% Rh-PE должны быть включены в липидной смеси.
3. Вводят липидной смеси в изопропаноле в микрожидкостных канала, пока не будет заполнена.
4. Инкубируйте липидной смеси на поверхности стекла в течение приблизительно 10 мин.
5. Постепенно заменить липидный раствор с водой или буферным раствором с использованием перистальтического насоса при скорости потока очень низкой(10-50 мкл / мин). Кроме того, заменить липидной смеси повторным пипетированием.
6. Промыть канал водой с избыточным буфера, чтобы удалить остаточный изопропанол.

2. Формирование холестерина, обогащенного поддерживаемых мембран

Примечание: твердую поверхность (SiO ₂₎ поддерживает слияния пузырьков, но состав мембраны (высокий уровень холестерина) ингибирует синтез везикул, потому что холестерин, обогащенный везикулы высокой жесткостью при изгибе ^30.

1. Подготовка исходного раствора, содержащего 10 мг / мл липида, DOPC 10 мг / мл холестерина и 1 мг / мл Rh-PE сначала растворением соответствующих порошков в изопропаноле.
2. Повторите шаги 1.2-1.6 с помощью растворы, приготовленные в шаге 2.1.

3. Мембрана Текучесть Анализ

1. Опустить предметное стекло в растворе додецилсульфата натрия (SDS) (1%) в течение 10 мин.
2. Вымойте слайды тщательно деионизированной водой и ополосните остроумиеч этанол.
3. Blow-сухие слайды, используя мягкий поток азота.
4. Expose слайды в кислородной плазме в течение 30 сек при максимальной мощности радиочастотного в плазме кислорода камеры.
5. Снимите защитную пленку из бездонной коммерческой Микрожидкостных камеры (рис 1А), используя пинцет и прикрепите предметное стекло на липкой стороне камеры (рис 1B).
6. Сборка соединителей и труб в впускных и выпускных позиций камеры и поместить микрожидкостных канал на столик микроскопа (рис 1С).
7. Форма флуоресцентно-меченного поддерживает липидный бислой в микрожидкостных канала [Повторите шаг 1 с использованием нужного липидный состав (например, 0,5 мг / мл ДОФХ), включая 0,5 мас% RH-PE в органическом растворителе].
8. Найдите плоскости бислоя с 60X нефти иммерсионного объектива (NA 1.49) для того, чтобы захватить изображения.
9. Возьмите два предварительно отбеливатель изображения, то фото-отбелить 301; м широкий круговой пятно с мВт лазерного луча 532 нм, 100. Перед фотообесцвечивания, разогреть лазер, пока его интенсивность не будет стабильным. Сразу же после фотообесцвечивания, захватить ряд изображений каждую 1 сек в течение 2 мин для того, чтобы следить за восстановление интенсивности флуоресценции на беленой месте.

4. Холестерин Количественное Анализ

1. Подвергать диоксид кремния покрытием кристалл кварца сенсорный чип для кислородной плазмы в течение 30 сек при максимальной мощности радиочастотного в плазме кислорода камеры. Удалить чип из камеры и сразу же установить чип в измерительной камере.
2. Перед экспериментом, сначала получить частоту и рассеивание микросхемы датчика в воздухе, чтобы обеспечить надлежащую установку.
   1. Для коммерческого Вопрос-Sense E1 или Е4 QCM-D инструмент, запустите Q-Софт программу и нажмите кнопку "Приобретение" и выберите "Настройка Измерение".
   2. В новом появившемся окне проверьте 3, 5, 7, 9, 11 и 13 обертоны, а затем нажмите кнопку Найти и запустить, чтобы проверить спектры резонанса. Установите температуру на 24 ° С. Если один или несколько резонансных частот не согласны с ожидаемыми значениями, проверить чип монтажа и повторно выполнить этот шаг до тех пор, соглашение не будет достигнуто.
3. Начало перистальтического насоса и поток буферного раствора (10 мМ Трис, 150 мМ NaCl, рН 7,5) в измерительной камере при скорости потока 100 мкл / мин.
4. В программе, нажмите "приобретение" и выберите "Restart" Измерение для того, чтобы записывать резонансная частота и диссипация энергии сигналов. Повторите этот шаг, пока стабильная базовая линия не получается для частотных и рассеивания сдвигов. Примечание: Для шагов далее, будет дополнительные частоты и рассеивания сдвиги, которые могут быть записаны как функции времени.
5. Вводят изопропанол (без липида) в течение 10 мин.
6. Вводите смесь липидов ДОФХ / холестерина нажелаемый мольное отношение общей концентрации липидов в 0,5 мг / мл в изопропаноле в течение 10 мин.
7. Вводят буфер в течение 20 мин при скорости потока 100 мкл / мин.
8. Вводят раствор 1 мМ метил-бета-циклодекстрина (MβCD), полученного в буфере (расход 100 мкл / мин), пока сигнал частоты достигает стабильного значения.
9. Измерения относительной положительные сдвиги частоты, что вызвано стадии обработки MβCD и рассчитать массу холестерина и DOPC липидов путем преобразования значения; F _чо; F _DOPC в массовых значений с помощью уравнения Сауэрбрей [Δm = - (C / N) × ; F, где С = 17,7 нг / ^см 2, п: обертон].
10. Вычислить мольную долю холестерина в SLB, принимая во внимание молекулярные массы DOPC липидов (786,1 г / моль) и холестерина (386,6 г / моль).

Results

Изготовление поддерживаемых липидного бислоя на гидрофильных подложках.

Методы формирования и В.Ф. SALB были предприняты диоксида кремния и золота и процессов формирования были отслеживать в режиме реального времени с помощью измерительной техники QCM-D. В QCM-D Прибор измеряет изменения в резонансной частоте (Д Р) колеблющейся пьезоэлектрического кристалла кварца при массовой адсорбции на поверхности кристалла. Кроме того, QCM-D Прибор измеряет рассеивание энергии колебаний, чтобы охарактеризовать вязкоупругие свойства (жесткость и мягкость) адслоя. Эксперименты слияния пузырьков проводили, как описано ранее ^31. Вкратце, базовый было впервые установлено для частот и диссипации сигналов в водном буферном растворе [10 мМ Трис, 150 мМ NaCl, рН 7,5; (2А и В)]. Далее, небольшие однослойные везикулы DOPC в липидные том же буфере было впредполагаемыми при Т = 10 мин (стрелка 1) на двуокиси кремния (рис 2А) и золота (рис 2B). Для слияния пузырьков на двуокиси кремния, двухступенчатые кинетика адсорбции наблюдались окончательных изменений в частоте и энергии диссипации -26 (± 1) Гц и 0,3 (± 0,2) × 10 ^{- 6,} соответственно. Эти значения согласуются с образованием на носителе липидный бислой ^29.

Как показано на фиг.2В, добавление везикул решения поверхности золота привело к одновременным уменьшением и увеличением А F и Δ D сигналов, соответственно, пока их значения не достигла -150 (± 10) Гц и (7,5 ± 2) × 10 ^{- 6,} соответственно. Эти значения соответствуют образованию адсорбированного слоя пузырьков. Таким образом, как и ожидалось, А.Н. SLB был не сформирован на золото с помощью метода слияния пузырьков.

ККMD анализ для формирования двухслойной диоксида кремния и золота методом SALB представлен на фиг.2С и D. На диоксид кремния, окончательные А F и Δ D сдвигов -25,6 (± 0,55) Гц и 0,4 ± 0,27 () × 10 ^{- 6,} соответственно, были достигнуты, и эти значения указывают формирование SLB. Похожие диапазоны Д ф и Δ D (Д ф _Au: -27.3 ± 2.7 Гц, Δ D _Au: 0,48 (± 0,26) × 10 ^{- 6)} наблюдались на золото. Эти результаты подтверждают, что метод позволяет САЛБ образование поддерживаемых липидного бислоя на поверхности, которые предотвращают разрыв пузырьков.

Влияние скорости потока растворителя обмена на качество поддерживаемых липидных бислоев.

Для определения оптимальных условий для изготовления высококачественных поддерживаемых липидного бислоя VIметода SALB, влияние концентрации липидов, растворителей обменного курса и выбора органического растворителя были рассмотрены.

Рисунок 3 показывает изменение QCM-D частоты в течение последней стадии протокола SALB, как выполнено на двуокиси кремния на двух разных скоростях потока (100 и 600 мкл / мин) и двух различных концентраций липидов (0,125 и 0,5 мг / мл) ,

При использовании 0,5 мг липида / мл ДОФХ (3А), формирование бислой не зависит от скорости потока и окончательного; F сдвиге примерно -26 Гц была получена на обоих скоростях потока.

В отличие от этого, при использовании более низкой концентрации липидов, количество адсорбированного липида после полного замены растворителя значительно влияет на скорость потока (фиг.3В). При средней скорости потока 100 мкл / мин, формирование двухслойной была завершена (; F вокруг -26 Гц). Тем не менее, в 6 раз выше, скорость потока (600 мкл / мин), полный двухслойная не была сформирована (около -17; F Гц). Эти результаты обеспечивают руководство для выбора правильных экспериментальных условий для успешного формирования двухслойной методом SALB изопропанолом в качестве органического растворителя выбора.

Характеристика поддерживаемых липидных бислоев, полученных из различных концентрации липидов в различных спиртовых растворах.

Липидов концентрация еще один параметр, который влияет на качество SLBS полученный с помощью метода SALB. Флуоресцентная микроскопия показала, что, в 0,05 мг / мл липидов концентрации, лишь единичные, суб-микроскопические структуры липидов были сформированы (рис 4а). С увеличением концентрации липидов, используемые в процедуре SALB, интенсивность флуоресценции липидных структур стала более однородной. В 0,1 мг / мл липида концентрации, были микроскопические липидные пятна хотя структуры не распространяться на все FIELD зрения (4В). Тем не менее, при использовании 0,25 мг / мл липида концентрации, гомогенный липидный бислой был сформирован (фиг.4С). Таким образом, существует минимальная концентрация липидов, необходимых для формирования полного, полный охватывающей SLB.

Влияние концентрации липидов в конечном результате экспериментов SALB также исследовали в более широком диапазоне концентрации липидов (от 0,01 до 5 мг / мл) и в различных органических растворителях (изопропанол, этанол и н-пропанол). Δ F и значения Δ D, соответствующие заключительной стадии в процедуре SALB представлены на рисунке 5.

Мы определили формирование двухслойной основаны на окончательных изменений в частоте и диссипации энергии между -25 и -30 Гц и менее чем 0,5 × 10 ^-6, соответственно. На основании этих критериев, оптимальный диапазон концентрации липидов с образованием поддерживает липидный бислой была определена в пределах от 0,1 до 0,5 мг/ мл в основном зависит от типа органического растворителя. Отклонения в приобретенной Д F и Д D смещается за пределы указанного выше диапазона обусловлено наличием дополнительной массы (например, двухслойные стеки), возникновение не-двухслойных морфологии (например, пузырьки, червеобразные мицеллы), и наличие фрагментированных двухслойных островов с неполным морфологии по подложке.

Хотя процедура САЛБ полученным поддерживаемых липидных бислоев является относительно устойчивым, оптимальная концентрация липидов для формирования высококачественного двухслойного может потребовать настройки в зависимости от конкретных экспериментальных конфигурации. В принципе, существует не только минимальная концентрация липидов, но и в максимальной концентрации липидов, необходимое для оптимального формирования двухслойной через метод SALB. Оптимальный диапазон концентраций зависит от скорости потока и может быть также зависеть от состава подложки и липидов. Эмпирически, во многих случаях, мы Fкруглый, что концентрации липидов в 0,5 мг / мл и скорости потока 100 мкл / мин оптимальный набор условий для формирования однородной поддерживаемой липидный бислой. Тем не менее, в зависимости от состава липидов и поток клеток геометрии последний из которых воздействует на профиль потока в процессе обмена растворителем-дальнейшей оптимизации концентрации липидов может быть необходимо. Таким образом, мы рекомендуем выполнять пилот SALB эксперименты с использованием 0,5 мг / мл липидов концентрацию и оценки качества двухслойной используя QCM-D или флуоресценции методы микроскопии. Если бислои появляются неполной, то концентрация липидов должна быть увеличена с шагом 10% до тех пор, удовлетворительные результаты не будут достигнуты. Если бислой появляется сосуществовать с дополнительными структурами липидов, то концентрация липидов должна быть уменьшена с шагом 10% до удовлетворительных результатов не достигнуто.

Изготовление поддерживаемых липидного бислоя липидов с различными композициями и Different холестерина фракции.

Далее, SALB и VF методы были использованы для формирования холестерина, обогащенного SLBS. Рисунок 6 показывает репрезентативные изображения флуоресценции (100 × 100 мкм) содержащих холестерин, поддерживаемых мембран, полученных методом SALB. Мембраны состоят из круговых областей формы красителя исключены окруженных непрерывной фазы, характеризующейся равномерным флуоресцентным яркости. Темные области увеличился в области повышения холестерина с фракции в липидной смеси предшественника. Далее, измерения FRAP проводились с целью изучения текучесть липидный бислой пленок. Измерения показали, FRAP почти полное восстановление флуоресценции в окружающем фазы, что указывает на боковой подвижности липидов и, следовательно, формирование единого липидный бислой. Так резус-PE разделов преимущественно в жидкой фазе, темные области, скорее всего, состоит из плотных холестерина, обогащенного структур. р>

Для сравнения, изготовление ДОФХ / Чхоль бислоями с использованием метода В. Ф. также пытались. ДОФХ везикулы с увеличением холестерина фракции (10 - 40% мол) получают по методу экструзии везикул. Rh-PE липидов (0,5 мас%) был использован в качестве флуоресцентной метки для визуализации. Рисунок 7 показывает репрезентативные флуоресцентные изображения (100 × 100 мкм) структуры, созданные при инкубации из стеклянных подложек с содержащих холестерин пузырьков. Анализ показал, FRAP образование текучей липидный бислой с использованием пузырьков, содержащих 20% мол ХОЛ или менее. Однако образцы, приготовленные с использованием пузырьков при более высоких фракций холестерина не проявляют восстановление, что указывает на присутствие адсорбированной но неразорвавшихся пузырьков.

Фракцию холестерина, которые в конечном итоге включены в поддерживаемых липидных бислоев количественно как функция фракции холестерина, которые были включены в губы предшественникаID смесь в органическом растворителе в способе SALB или в пузырьках в водном растворе в способе VF. Используя методику QCM-D, формирование бислой контролировали, а затем был добавлен MβCD для того, чтобы извлечь специфически ХОЛ из поддерживаемых липидных бислоев ^32. Потеря массы вследствие удалени холестерина привело к уменьшению абсолютного значения сдвига частоты (| Δ F |), связанного с SLB. Относительные положительные сдвиги частоты, вызванные стадии обработки MβCD показаны на фиг.8А. Мол часть холестерина была рассчитана на основе сдвига частоты, как представлено на фиг.8В.

Холестерин фракции включены в поддерживаемых липидных бислоев, полученных способом SALB почти линейно пропорционально содержанию холестерина в липидной смеси предшественника. Интересно, что уровень холестерина в фракции бислоев получают по способу В. Ф. (везикулы, содержащие до20% мол Чхор) была существенно ниже, чем содержится в пузырьках предшественников. На самом деле, самая высокая доля холестерина, полученный по способу В. Ф. было лишь около 10% мол.

Наблюдение полосы надстройки в β-двухфазного сосуществования области холестерин-фосфолипида поддерживается бислоев.

SALB Эксперименты дополнительно проводили с использованием липидной смеси с еще более высокой фракции холестерина. Когда 4: 6 был использован смесь ДОФХ и холестерина, постепенного расслоения единой жидкой фазы в двух сосуществующих фаз визуализируются в виде ярких полосок в форме доменов на темном (красителя) без учета фона наблюдалось (рис 9). Установлено, что резус-РЕ исключается из богатых холестерином доменах ^33, а следовательно, преобладающих темных областей, которые появились в качестве фона в холестерин, обогащенный области. Образование микронного размера ярких областях на темном фоне в ПриветGH холестерина фракции (> 50 мол%) согласуется с бета области в монослое фазовой диаграммы холестерин / фосфолипиды смесей ^34,35. Кроме того, формирование полосовых доменов, которые возникают от слабого линейного натяжения, предполагает, что смесь вблизи критической точки смешиваемости.

Рисунок 1. Микрожидкостных камера для формирования SALB в подходящей конфигурации для эпифлуоресцентной микроскопии. (А) Коммерческая Микрожидкостных камера, (Б) Стекло покровное прилагается на клейкой стороне камеры, (С) Полный установки на держателе микроскопа с трубки, подключенного в впускные и выпускные порты камеры, и (D) Перистальтический насос используется для контроля скорости замены растворителя. Липиды растворяют в изопропаноле вводят в измерительный chambэ с помощью перистальтического насоса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. QCM-D анализ слияния пузырьков и SALB экспериментов на диоксид кремния и золота субстратов. QCM-D частоты (; F, синий) и рассеивание (ΔD, красный) отзывы на третьем обертона (п = 3) были записаны как Функция времени, в течение липидов адсорбции на (А и С) диоксида кремния, (B) и D золота. Панели А и В представляют метод слияния пузырьков. ДОФХ липидные пузырьки вводили при Т = 10 мин (стрелка 1). Панели С и D. соответствовать способу формирования SALB. Стрелки указывают инъекции буфера (1), изопропанол (2), липидов смесь [0,5 мг / мл липида ДОФХ в изопропаноле; (3)] ​​и любительэ обмен (4). Пунктиром на панели В соответствует контрольном эксперименте, в котором липидный не вводили. Конечные значения; F и ΔD для каждой поверхности указаны. Схемы показывают предлагаемые собранные липидов структуры, как вывод из заключительных частоты и рассеивания сдвигов. Взято из ссылки 24 и используются с разрешения Американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3. Влияние растворителей курсу на процесс формирования SALB. QCM-D сдвиги частот (; F), соответствующий конечной стадии (стрелка 4 на фиг.2С) в методе SALB были измерены на двуокиси кремния на двух разных валютных курсов, 100 и 600 мкл / мин, U петь (А) 0,5 мг / мл и (Б) 0,125 мг / мл липида ДОФХ в изопропаноле. Конечные значения; F также указано, по сравнению с базовой линии в измерительной водном буферном растворе. Взято из ссылки 24 и используются с разрешения Американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4. Порог липидов концентрации для полного формирования SALB эпифлуоресцентной микроскопия слоев липидных на двуокиси кремния, подготовленный с помощью SALB (A) 0,05 мг / мл. (Б) 0,1 мг / мл; и (С) 0,25 мг / мл липида концентрации. Взято из ссылки 26 и используются с разрешения Американского химического общества./files/ftp_upload/53073/53073fig4large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5. Влияние концентрации липидов и органического растворителя на поддерживаемом формирования липидной двухслойной методом SALB. Окончательные изменения QCM-D (A) частоты и (В) рассеивание энергии для экспериментов с использованием SALB различные органические растворители, как функции липидов концентрация. Пунктирные зеленые линии соответствуют ожидаемой частоты и рассеивания сдвигов для полного бислоя (-30 Гц <; F <-25 Гц и ΔD <1 х 10 ^-6). Взято из ссылки 26 и используются с разрешения Американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное Fiфигура.

Рисунок 6. флуоресценции после фотообесцвечивания восстановления анализ поддерживаемых липидных бислоев с различной фракции холестерина, полученных способом SALB на стеклянной подложке. (АЭ) Флуоресцентные микрофотографии бислоев получен с использованием различных фракций холестерина в смеси предшественников. Изображения были записаны сразу (сверху) и 1 мин (средний) после фотообесцвечивания. Темное пятно в центре изображения соответствует photobleached регионе. Масштабные бары 20 мкм. Площадь поверхности гистограммы отдельных доменов красителя исключены в пределах каждого образца также представлены (дно). Взято из ссылки 36 и используются с разрешения Американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7. FRAP анализ содержащих холестерин, поддерживаемых бислоя, подготовленных методом слияния пузырьков. (AD) Флуоресцентные микрофотографии бислоев получен с использованием различных фракций холестерина (от 10 до 40 мол%), в пузырьках предшественников. Изображения были записаны непосредственно (сверху) и 1 мин (нижний) после фотообесцвечивания. Темное пятно в центре изображения соответствует photobleached регионе. Масштабные бары 20 мкм. Взято из ссылки 36 и используются с разрешения Американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 8. Цюйantification холестерина фракции в поддерживаемых липидного бислоя. (А) Положительный QCM-D сдвиг частоты при инъекции 1 мМ MβCD на поддерживаемых липидных бислоев с различной мольные доли холестерина в смеси предшественника (от 0 до 50 мольных%). (Б) мольных процентов холестерина обедненного из бислоев подготовленных SALB и методов слияния пузырьков в зависимости от фракции холестерина в смеси предшественников или везикул. Взято из ссылки 36 и используются с разрешения Американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 9. Время зависит эволюция микроструктуры флуоресценции в поддерживаемом бислоя ДОФХ / Чхоль (4: 6 молярное отношение Контаоцен- ками 0,5% родамин-PE), полученного способом SALB. Единая фаза постепенно фаза отделяется в области сосуществования жидкость-жидкость при полной замены растворителя. Взято из ссылки 37 и используется с разрешения Американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

В этой работе, протокол растворителей обмен представлен в котором липиды в спирте (изопропанол, этанол или н-пропанол) инкубируют с твердой подложкой, а затем спирт заменен постепенно с водным буферным раствором, чтобы вести серию фазовых переходов в конечном итоге производить пластинчатые фазы липидных двойных ^24. Показано, что метод позволяет изготавливать поддерживаемых липидных бислоев на поверхностях, таких как золото, которое неразрешимыми методом слияния пузырьков.

Оптимальный диапазон концентраций липидов (0,1 - 0,5 мг / мл) была определена для полного формирования двухслойной в стандартных форматах экспериментальных проверенных сих пор. При концентрациях липидов ниже 0,1 мг / мл, дискретных, микроскопических пятен бислоями формируется. С другой стороны, при концентрации выше 0,1 мг / мл и меньше, чем 0,5 мг / мл, полное и равномерное бислой формируется. При концентрациях липидов выше этого диапазона, двухслойная жидкость еще формируется Verifiред анализа FRAP, однако, флуоресцентной микроскопии показывает наличие дополнительных структур липида в верхней части двойного слоя. Поразительно, морфология этих дополнительных липидов структур, как определено QCM-D анализа, зависит от спирта, который был использован в ходе стадии инкубации. В случае этанола, относительно высокие Д F Δ и D сдвиги напоминают QCM-D сигнатуру, полученную на адсорбированной пузырьков слоя. При изопропанол или н-пропанол вместо этого используется, Δ F была несколько выше, чем значение ожидаемой для двухслойной (конечная Д F между -30 до -40 Гц), в то время как Δ D была значительно выше. Такие QCM-D реакции можно было бы ожидать в течение длительных структур липида (например, червеобразные мицеллы), выступающие наружу от поверхности мембраны (как видно с помощью флуоресцентной микроскопии в некоторых случаях).

Скорость обмена растворителем является еще одним важным параметром, который может иметь решающее значение, ESPECially, когда более низкие концентрации липидов (например, 0,1 мг / мл) используются. Система быстрой смены растворителя при низкой концентрации липидов может привести к образованию неполных бислоев. В стандартной измерительной камеры, используемой для измерения QCM-D в этой статье (измерительная камера Q-Sense Е4), скорости потока около 100 мкл / мин, были пригодны для высокой воспроизводимостью полного формирования двухслойной. Для проточных с другими геометрии и объема, оптимальный расход может варьироваться и должны быть определены эмпирически на основе этапов, предложенных в настоящем документе.

Кроме того, чтобы сформировать поддерживаемые бислоев на поверхностях, которые неразрешимыми слияния пузырьков, то САЛБ могут быть использованы, чтобы обойти потребность в липидных везикул, которые могут разрыва, открывая тем самым дверь в изготовлении мембран с поддерживаемых сложных композиций. В качестве иллюстративного примера композиции, липидные смеси с высокой долей холестерина были изучены. Холестерин является важным компонентом MammАлеан клеточные мембраны, и его доля может приблизиться к 45-50 мол% от мембранных липидов композиции (например, в эритроцитах). Таким образом, даже простая модель липидного бислоя мембраны, представляющий клеток человека должна включать в себя холестерин.

В то время как слияния пузырьков может быть использовано для изготовления жидкостных бислоев, содержащих только 10-15% холестерина, причем способ включает САЛБ образование жидкостных липидных бислоев, содержащих высокие доли холестерина (до 57% мол, а количественно QCM-D измерений) ^36. Однако, когда уровень холестерина был повышен дополнительно (до 63% мол), полоса-формы домены наблюдались ^37. Сосуществующих домены были жидкость, напоминающая те, в регионе наблюдается бета на фазовой диаграмме монослоя холестерина / фосфолипидов на границе воздух-вода.

В целом, способ САЛБ Показано, что простой и эффективный подход к образуют поддерживаемые бислоев, особенно яN случаев выходит за рамки обычного метода слияния пузырьков. До сих пор, в QCM-D техника и флуоресцентной микроскопии, в основном, используется для характеристики поддерживаемых бислоев, сформированные методом SALB. Заглядывая вперед, широкий диапазон поверхностно-чувствительных методов аналитических измерений, в том числе поверхностного плазмонного резонанса (SPR) ^38, атомно-силовой микроскопии (АСМ) ^39,40, Фурье-ИК-спектроскопии ^41, рентген ^{42 и} нейтронов отражения ^43, может быть использованы для дальнейшего изучения свойств и простые и сложные конфигурации двухслойные подготовить методом SALB. Эти новые возможности открывают двери для большего числа ученых, которые можно исследовать мембраны клеток искусственные, воспользовавшись простой и надежной экспериментальной протокола.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Подложки QCM-D с покрытием из диоксида кремния	QSense AB,  Швеция
Подложки QCM-D с золотым покрытием	QSense AB,  Швеция
Модуль Q-Sense E4	QSense AB,  Шведский
плазменный очиститель, PDC-32G	Harrick Plasma, Итака, Нью-Йорк	PDC-001 (115 В)
1,2-диолеол-<эм>сн-глицеро-3-фосфохолин (ДОПК)	Avanti Polar Lipids	850375P
1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-(лиссамин родамин B сульфонил) (соль аммония) (Rh-PE)	Avanti Polar Lipids	810150P
холестерин	Avanti Polar Lipids	700000P
Метил-&бета;-циклодекстрин	Sigma	C4555
Изопропанол	сигма
Этанол	Sigma
н-пропанол	Сигма
Липкая горка I 0.1 Luer	IBIDI	81128
Наружный локоть 1/8"	Cole-Parmer	30505-70
Силиконовая трубка 1.6  мм ID	IBIDI	10842
Стеклянный покровный колпак No 1,5H, 25 мм x 75 мм	IBIDI	10812
Reglo Digital M2-2/12 Перистальтический насос	Ismatec
Додецилсульфат натрия	Sigma	71725