Это упрощенное применение прижизненной микроскопии брыжеечных вен у мышей может быть использовано в различных моделях воспаления для наблюдения за лейкоцитарно-эндотелиальными и тромбоцитарно-лейкоцитарными взаимодействиями.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Прижизненные микроскопия лейкоцитов и тромбоцитов эндотелиальных лейкоцитов-взаимодействия в мезентериальных вен у мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Прижизненные микроскопия является методом, который может быть использован для исследования различных процессов в различных регионах и сосуды в живых животных. В этом протоколе мы опишем прижизненный микроскопии брыжейки вен. Это может быть выполнено в течение короткого периода времени с воспроизводимыми результатами, показывающими, лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия в естественных условиях. Мы описываем воспалительный настройки после ЛПС эндотелия. Но в этой модели можно применить различные типы воспалительных состояний, как бактериальных, химических или биологических и исследовать введение препаратов и их прямое воздействие на живом и его влияние на лейкоцитов. Этот протокол был успешно применен к ряду различных обработок мышей и их воздействие на воспалительную реакцию в сосудах. Здесь, мы опишем визуализацию лейкоцитов и тромбоцитов флуоресцентно маркировка их с родамина 6G. Кроме того, любая конкретная изображений может быть реrformed помощью целенаправленных флуоресцентно меченных молекул.
Введение
Целью данного протокола является описание упрощенную методику прижизненной микроскопии брыжейки вен в живых мышей для прямого наблюдения лейкоцитов-эндотелиальной и лейкоцитов тромбоцитов взаимодействий при воспалительных процессах.
Прижизненные микроскопии был разработан для изучения лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия в естественных условиях под воспалительных состояний 1,2, что не тривиальна, но важно для понимания воспалительной лейкоцитов и функции. Метод, который мы описали в этом протоколе был разработан на основе ранее опубликованных изданий. Подобно визуализации тромбоцитов включение в растущем тромба 3 и параллельно с тем, что было опубликовано ранее 4, выводили брыжейки вена рассмотрены передаваемой световой микроскопии. Есть различные другие модели внутри витал микроскопии, такие как кремастер мышцы крыс 5 или печени мыши и крысы 6.
Прижизненные микроскопия брыжейки вены была разработана и применяется в предыдущих исследованиях несколько групп. Мы использовали эту технику, чтобы наблюдать различия в лейкоцитов между мышами дикого типа и триптофана hydroxylase1 (Tph1) - / - мышей, которые дефицитный ненейронных серотонина и сравнили результаты мышам, чьи тромбоцитов серотонина фармакологически истощены долгосрочной перспективе ингибитор приложение избирательного обратного захвата серотонина флуоксетин 7. Мы также исследовали лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия после острого лечение флуоксетином 8.
В этом протоколе мы ориентируемся на прижизненной микроскопии брыжейки вен, потому что эта модель может быть выполнена быстро, и позволяет действительные измерения лейкоцитов-эндотелиальной и тромбоцитов лейкоцитов взаимодействий. Это гораздо более сложным и трудоемким в прижизненной микроскопии других органов, таких как кости, печени, кожи или мышц кремастер. Режимл описано здесь идеально подходит для воспроизводимого оценки воспалительного взаимодействия клетка-клетка после challengeing его с воспалительным стимулом, таким как внутрибрюшинной инъекции ЛПС.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с немецким законом о защите животных (TierSchG). Мыши были размещены и обрабатываются в соответствии с надлежащей практикой животных, как это определено FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) и тела национального благосостояния животных GV-СОЛАС (www.gv-solas.de/index.html). Благосостояния комитет животных из Университета Фрайбурга, а также местные органы власти (Regierungspräsidium Фрайбург) одобрил все эксперименты на животных.
1. Животное Обработка, подготовка и индукция воспаления
- Использование 4 - 6 недельных самцов мышей с массой от 16 - 20 г. Примечание: Если мыши старшего возраста или тяжелее они представляют лишний жир, окружающий сосуд, ограничивая микроскопическую наблюдение.
- Стерилизовать все инструменты и микроскоп таблицу до операции.
- Вводят 20 мг / кг ЛПС (липополисахарида) внутрибрюшинно 4 ч до микроскопии в живой мыши, чтобы вызвать бактериальную Inflammвания.
- Prewarm 0,9% солевой раствор в водяной бане при 37 ° С для увлажнения пластиковую камеру и брыжейки ткани.
- Обезболить мышь с внутрибрюшинной инъекции кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (5 мг / кг) непосредственно перед процедурой микроскопии. Альтернативные анестезия может быть использован, например, 2% изофлуран ингаляции. Подтвердите правильное обезболивания по потере ответ на рефлекторной стимуляции (палец или хвост щепотку с твердым давления).
- Депилировать живот с помощью бритвы и удалить распущенные волосы марлей, насыщенной 70% этанола.
- Применить ветеринар мазь на глазах мыши, чтобы предотвратить сухость, а под наркозом.
2. Хирургическое
- Стерилизовать живота с помощью 70% этанола. Этот метод не является стерильным способом и может привести к летальному исходу в конце эксперимента.
- Выполните средний лапаротомии: Откройте кожи живота с помощью небольших, изогнутые щипцы и маленькие ножницы. Определить EPIgastrical сосуды и откройте брюшины в области белой линии, чтобы защитить сосуды.
- Нанесите несколько капель физиологического раствора, предварительно нагретой в брюшную полость, чтобы сохранить ткани влажным.
- Этикетка лейкоцитов и тромбоцитов флуоресцентно путем введения 50 мкл родамина 6G (1 мг / мл) ретро-орбитально, как описано выше 9,10.
- Экстериоризироваться петлю ileumand поместить его в чашку Петри с диаметром 10 см и убедитесь, что держать ткань влажной путем применения 37 ° C, предварительно нагретую физиологический раствор (0,9%) каждую минуту.
3. Прижизненные микроскопия
- Место мыши под микроскопом и привести брыжейки вену с диаметром 200 - 300 мкм в центре зрения. Выберите судно без каких-либо видимых жировых обстановке.
- Не прикасайтесь брыжейки сосуды, тем самым избегая стимуляции эндотелия. Ручка подвздошной петли осторожно.
- Представьте клеток эндотелия-взаимодействий в кровис перевернутым или прямого микроскопа и камеры с использованием программного обеспечения микроскопа. Запись в крови клеток эндотелия-взаимодействия в течение 1 мин в 4 различных вен на мышь.
- Эвтаназии мышь смещением шейных позвонков после завершения экспериментов изображений.
4. Анализ
- Провести анализ в автономном режиме и ослеплен по всем параметрам. Провести анализ с использованием любого подходящего программного обеспечения.
- Подтвердите стабильные и interindividually сопоставимые условия кровотока в пора разрешением кино-клипов (максимальная частота кадров), направленные на просвете потока клеток крови.
- Определить число лейкоцитов прокатки. Therefor проведите вертикальную линию через вену и рассчитывать все лейкоциты, пересекающие эту линию в 1 мин.
- Определить скорость прокатки путем измерения времени одна лейкоцитов необходимо пройти расстояние 50 мкм, а стабильно прокатки на эндотелий. Для этого нарисуйте две вертикальные линии на расстоянии 50 мкм тhrough вены.
- Измерьте время представитель лейкоцитов должен получить от одной линии к other.Calculate скорость лейкоцитов путем деления 50 мкм в течение времени, необходимого (мкм / с).
- Измерьте адгезию лейкоцитов в поле 0,04 мм 2. Чтобы сделать это, нарисуйте квадрат с длиной стороны 200 мкм в вену.
- Граф твердым приверженцем лейкоцитов, определенные как не видимым движением в течение 30 сек, в течение этой площади.
- Подсчитайте количество тромбоцитов, связанных с одной лейкоцитов количественно тромбоцитов лейкоцитов взаимодействий.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Обзор экспериментальных условий, описанной в данном протоколе показано на рисунке 1. Это показывает, мышь с экстериоризированного подвздошной петли и его сосудов, которое можно наблюдать в прижизненной микроскопии. Рисунок 2 показывает определенную степень активации в необработанных животных вследствие Сама процедура. Но почти нет медленно прокатки или фирма адгезию лейкоцитов по сравнению с ЛПС-обработанных мышей. На фиг.2 также показаны различные результаты прижизненн...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом мы расскажем подготовку и исполнение прижизненной микроскопии брыжейки вен мышей в естественных условиях. Этот метод дает нам возможность наблюдать лейкоцитов-эндотелиальной и тромбоцитов эндотелиальных взаимодействий 11 непосредственно в живом организме.
В качестве первого ответа на воспаление эндотелия активируется и взаимодействует с лейкоцитами и тромбоцитами, в результате прокатки, адгезии и переселения 12. Но лейкоциты и тромбоциты взаимодействуют ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (DU 1190/3-1).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Родамин 6G | Сигма-Олдрич | 989-38-8 | |
| Липополисахариды из Escherichia coli 055:B5 | Sigma-Aldrich | L2637 |
Ссылки
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).
- Atherton, A., Born, G. V. Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls. The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).
- Duerschmied, D., et al. Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17). Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).
- Chauhan, A. K., et al. ADAMTS13: a new link between thrombosis and inflammation. The Journal of experimental medicine. 205, 2065-2074 (1084).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).
- Duerschmied, D., et al. Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice. Blood. 121, 1008-1015 (2013).
- Herr, N., et al. Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice. PloS one. 9, e88316(2014).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab animal. 40, 155-160 (2011).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab animal. 37, 26-32 (2008).
- Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I. Immune functions of platelets. Thrombosis and haemostasis. 112, 678-691 (2014).
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure. European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).
- Sarma, J., et al. Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes. Circulation. 105, 2166-2171 (2002).
- Sumagin, R., Sarelius, I. H. TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
