Методическая статья

Слой за слоем Коллаген осаждения в микрофлюидных Устройства для стабилизации Microtissue

DOI:

10.3791/53078

⸱

29 сентября 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Engineering in Medicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Hospitals for Children-Boston

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Создание функциональных микротканей в микрофлюидных устройствах требует стабилизации фенотипов клеток путем адаптации традиционных методов культивирования клеток к ограниченным пространственным размерам микроустройств. Модификация коллагена позволяет слой за слоем осаждать ультратонкие коллагеновые сборки, которые могут стабилизировать первичные клетки, такие как гепатоциты, в качестве микрофлюидных моделей тканей.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя микрофлюидика обеспечивает тщательный контроль клеточного микроокружения, культивирование клеток в микрофлюидных устройствах может быть challenging. 3D культивирование клеток в гелях с коллагеном I типа помогает стабилизировать морфологию и функцию клеток, что необходимо для создания микрофлюидных моделей тканей в микроустройствах. Перевод традиционных методов 3D-культивирования для планшетов для культивирования тканей в микрофлюидные устройства часто затруднен из-за ограниченных размеров канала. В этом методе мы описываем технику модификации нативного коллагена I типа для получения поликатионных и полианионных коллагеновых растворов, которые могут быть использованы с послойным осаждением для создания ультратонких коллагеновых ансамблей поверх клеток, культивируемых в микрофлюидных устройствах. Эти тонкие слои коллагена стабилизируют морфологию и функцию клетки, как показано на примере первичных гепатоцитов, что позволяет в долгосрочной перспективе культивировать микроткани в микрофлюидных устройствах.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя микрофлюидика позволяет осуществлять тщательный контроль над клеточным микроокружением, культивирование клеток, особенно первичных клеток, в микрофлюидных устройствах может быть сложной задачей. Многие традиционные методы культивирования клеток были разработаны для поддержания и стабилизации функции клеток при культивировании в планшетах для культивирования тканей, но перевод этих методов на микрофлюидные устройства часто бывает затруднительным.

Одним из таких методов является культивирование клеток на коллагеновых гелях или зажатых между ними в качестве модели физиологической трехмерной клеточной среды. Коллаген I типа является одним из наиболее часто используемых белков для биоматериалов из-за его повсеместного присутствия во внеклеточном матриксе, естественного изобилия, надежных мест прикрепления клеток и биосовместимости. 2 Многие клетки получают пользу от 3D-культуры с коллагеном, в том числе раковые клетки3,45, микрососудистые эндотелиальные клетки6 и гепатоциты7. В то время как использование коллагеновых гелей легко в открытых форматах, таких как планшеты для культивирования тканей, ограниченные размеры канала и закрытый характер микрофлюидных устройств делают использование жидкостей с гелем нецелесообразным без блокировки всего канала.

Чтобы преодолеть эту проблему, мы объединили метод послойного осаждения8 с химическими модификациями нативных растворов коллагена для создания ультратонких коллагеновых сборок поверх клеток, культивируемых в микрофлюидных устройствах. Эти слои могут стабилизировать морфологию и функцию клеток, подобно коллагеновым гелям, и могут быть нанесены на клетки в микрофлюидных устройствах без блокирования каналов с полимеризованным матриксом. Целью этого метода является модификация нативного коллагена для создания поликатионных и полианионных коллагеновых растворов и стабилизация клеток в микрофлюидной культуре путем нанесения на клетки тонких сборок коллагенового матрикса. Этот метод был использован для стабилизации морфологии и функции первичных гепатоцитов в микрофлюидных устройствах. 9

Хотя ранее сообщалось о послойном осаждении природных и синтетических полиэлектролитов10 для покрытия гепатоцитов в культуре планшетов11,12 и в качестве посевного слоя для гепатоцитов в микрофлюидных устройствах13,14, этот метод описывает нанесение чистого коллагенового слоя поверх гепатоцитов, имитируя методы 3D-культивирования коллагена. В этом протоколе мы используем гепатоциты в качестве примера клеток, которые можно поддерживать с помощью 3D-слоев коллагена. Многие другие типы клеток, которые получают преимущества от 3D-культивирования коллагена, могут также извлечь пользу из культивирования после послойного осаждения ультратонкой сборки коллагенового матрикса.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Приготовление раствора Родной растворимый коллаген

  1. Подготовка или приобрести 200 мг подкисленной, растворимого типа, коллагена из хвостов крыс на 1-3 мг / мл с использованием стандартных протоколов выделения, как сообщает Piez др. 15
  2. Шкала количество исходного материала на основе желаемого конечного объема модифицированных растворов коллагена. Приблизительно 25-30 мл сделать метилированных и 25-30 мл сукцинилированных решений коллаген, каждый по 3 мг / мл, от 200 мг растворимого нативного коллагена.

2. Коллаген Метилирование

  1. Развести 100 мг нативного, подкисленной (рН 2-3) раствора коллагена в концентрации 0,5 мг / мл ледяной стерильной воде и держать на льду раствор, чтобы предотвратить гелеобразование.
  2. Доводят рН раствора коллагена 9-10 с несколькими каплями 1 N NaOH и перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Соблюдайте коллагена осадок, в результате чего решение стать облачно.
  3. Спин вниз осажденного раствора коллагена при 3000 г в течение 25 мин. Четкое гелеобразный осадок должен быть виден в нижней части трубы. Аспирируйте и надлежащим образом распоряжаться надосадочной жидкости.
  4. Ресуспендируют осажденного коллагена в 200 мл метанола с 0,1 N HCl и оставляют реакционную метилирование происходить при перемешивании при комнатной температуре в течение 4 дней. Коллаген не растворяются, но должны распадаться на мелкие кусочки, которые видны сделают решение облачность.
  5. После метилирования, центрифуги раствор при 3000 х г в течение 25 мин для осаждения метилированный коллаген. Аспирируйте и распоряжаться подкисленный метанол супернатанта.
  6. Растворить метилированный коллаген в 25 мл стерильной PBS в, давая концентрации приблизительно 3 мг / мл, с повторным пипетированием и фильтруют раствор через клеточный фильтр 60 мкм. Доводят рН раствора до 7,3-7,4 с помощью 20 мкл с шагом в 1 N NaOH.
  7. Оценить concentratioн раствора с использованием коммерческих крыса коллагена ELISA набор или набор гидроксипролина анализа. Развести решение 3 мг / мл стерильного PBS с.
  8. Стерилизацию метилированный решение коллагена путем передачи его в стеклянный флакон с завинчивающейся крышкой, тщательно отводками 3 мл хлороформа в нижней части бутылки, позволяют бутылка для установки O / N при 4 ° С, а затем асептически удалить и хранить Верхний слой, который является метилированный коллаген.
  9. Хранить раствор при 4 ° С для использования в течение 1 месяца.

3. Коллаген Сукцинилирование

  1. Развести другой 100 мг нативного, подкисленной (рН 2-3) раствора коллагена в концентрации 0,5 мг / мл ледяной стерильной воде и держать на льду раствор, чтобы предотвратить гелеобразование.
  2. Доводят рН раствора коллагена 9-10 с несколькими каплями 1 N NaOH и перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Коллаген должны ускорить, в результате чего решение стать облачно.
  3. Растворите 40 мг SucCinic ангидрид (0,4 мг на мг коллагена) в 10 мл ацетона (1/20 объема раствора коллагена). Медленно (приблизительно 0,5 мл шагом) добавить эту смесь к раствора коллагена при перемешивании при непрерывном мониторинге рН. Поддержание рН выше 9,0, добавляя 1 или 2 капли 1 N NaOH, как рН 9,0 подходы.
  4. Продолжить перемешивание при комнатной температуре в течение 120 мин после добавления всех нтарного ангидрида в ацетоне. Соблюдайте решение стать ясно, как сукцинилированный коллагена растворяется. Периодически проверяйте, чтобы обеспечить рН остается выше 9,0.
  5. Доводят рН раствора до 4,0 с помощью 20 мкл с шагом 1 N HCl. Соблюдайте решение облачно снова, как сукцинилированный коллагена осаждается.
  6. После сукцинилированием, центрифуги решение в 3000 × г в течение 25 мин для осаждения сукцинилированных коллагена. Аспирируйте и распоряжаться подкисленной супернатанта непрореагировавшего ангидрида янтарной кислоты.
  7. Растворите сукцинилированных коллагенав 25 мл стерильной PBS, дающих концентрации приблизительно 3 мг / мл, при повторном пипеткой, и фильтрации раствора через ячейки сетчатого фильтра 60 мкм. Доводят рН раствора до 7,3-7,4 с помощью 20 мкл с шагом в 1 N NaOH.
  8. Оценка концентрации раствора с использованием коммерческого коллагена крысы ELISA набор или набор для анализа гидроксипролина. Развести решение 3 мг / мл стерильного PBS с.
  9. Стерилизацию сукцинилированных решение коллагена путем передачи его в стеклянный флакон с завинчивающейся крышкой, тщательно отводками 3 мл хлороформа в нижней части бутылки, позволяют бутылка для установки O / N при 4 ° С, а затем асептически удалить и хранить Верхний слой, который является сукцинилированный коллагена.
  10. Хранить раствор при 4 ° С для использования в течение 1 месяца.

4. Проверка коллагена Изменения

  1. Подготовка 1 мл пробы из каждой из нативных, метилированных и сукцинилированных решений коллагеновых и разбавить до концentration 0,1 мг / мл стерильной воды для чистого водорода титрованием ионов. Далее разбавить буфер, по крайней мере 1000-кратного диализом против воды через 10 кДа отсечки membraneusing 3 раствора изменяется по крайней мере 4 ч каждой.
  2. Отрегулируйте рН растворов до 7,3 с небольшими количествами NaOH и HCl. Использование рН 7,3 в качестве произвольного ссылке, выполнить ионов водорода титрованием на каждом из образцов, как описано Танфорду 16 для создания кривых титрования для нативных, метилированных и сукцинилированных решений коллагена.
  3. Участок изменения рН на единицу объема добавленной кислоты по сравнению с количеством связанного ионов Н + на молекулу. Высокий уровень рН "амино" диапазон должен показать сдвиг в сукцинилированного коллагена к нейтральной точке (потеря аминогрупп) и низким рН "карбоксильной" диапазон должен показать левый поворот метилированного коллагена (потерю карбоксильных групп ) и сдвиг вправо в сукцинилированного коллагена (прирост в карбоксильной группес), по сравнению с нативного коллагена.
  4. Оценка эффективности реакции сукцинилирования путем определения% аминогрупп в нативного коллагена заменен сукцинилирования использованием 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты (TNBA) колориметрическим методом, в соответствии со стандартными протоколами 17,18.

5. Изготовление микрофлюидных устройств и сотовых Раздают

  1. Изготовить микрожидкостных устройств, используя стандартные методы 9. Используйте реплики формования PDMS от SU-8 мастеров на кремнии, определенной с помощью фотолитографии для создания микрожидкостных клеточной культуры камеры с 100 мкм в высоту, ширину 0.4-1.5 мм, 1-10 мм и длиной каналов для роста клеток.
  2. Используйте чистящее средство в плазме для окисления поверхности устройства и стекло, а затем нажмите вместе, чтобы связью. После стерилизации устройства под воздействием УФ света в течение не менее 30 мин, заполнить камеру с 50 мкг / мл фибронектина в стерильной PBS и инкубируют при 37 ° С в течение 45 мин.
  3. Семенной устройство с клетками, такими как первичный крысы или человека гепатоцитов, которые требуют коллагена гель для стабилизации фенотипа или состояния дифференцировки. Мы используем 20 мкл свежевыделенных первичной гепатоцитов крысы 7,19 или коммерчески доступных криоконсервированных гепатоцитов первичных человеческих высевают в 14 × 10 6 клеток / мл в устройстве.
  4. Разрешить клетки приложить на 4-6 часа, а затем промыть одиноких клетки и заменить обшивки СМИ с ростом массовой информации. Выдержите O / N, чтобы обеспечить полное ячейку распространения и создать сливающийся монослой клеток.

6. Слой за слоем Коллаген осаждения

  1. В ламинарном потоке капот культуры ткани, готовят достаточных объемов метилированных и сукцинилированных коллагеновых растворов в течение 10 приложений каждого раствора на устройстве, а также несколько миллилитров сред. Держите решения на льду. Мы используем 20 мкл (в 10-15 раз общий объем устройства) коллагена в слое на устройство.
  2. Бытьхлопкоочистительное с метилированной (поликатионной) раствор, альтернативный промывки устройства 20 мкл метилированных и затем сукцинилированный растворов коллагена, ожидая 1 мин между каждым приложением. Промойте устройству в общей сложности 10 раз в растворе, который должен занять около 20 минут. Работают быстро, чтобы свести к минимуму количество времени, клетки без средств массовой информации.
  3. Заметим, коллаген медленно накапливаются на входе / выходе в зависимости от его размера. Если сопротивление возрастает потока жидкости, промойте устройство один или два раза со средствами массовой информации, а затем продолжить наслоение.
  4. После нанесения всех слоев, промыть устройство в два раза свежей средой и вернуться в инкубатор. В зависимости от типа клеток, внеклеточный матрикс-индуцированных морфологических изменений, таких как повышенной поляризации в гепатоцитах, должны быть видны в течение нескольких часов.
  5. Подготовка репрезентативных устройства для электронной микроскопии с использованием стандартных методов 9 до проверки присутствия коллагеновой матрицеУзел сверху культивируемых клеток.

7. Стабилизация клеточной фенотипа и функции

  1. Изображение морфология клеток, жизнеспособность, и полярность с помощью стандартных методов типа клеток. Для гепатоцитов, собирать изображения в течение 14 дней, используя фазового микроскопа, LIVE / DEAD для окрашивания жизнеспособность и CMFDA краситель для апикальной поляризации, чтобы продемонстрировать последствия отложения коллагена.
  2. Для морфологии клеток, промойте устройство через входное отверстие с помощью пипетки 20 мкл PBS, чтобы ополоснуть, вводят 20 мкл PBS, и изображение устройства с помощью фазово-контрастной микроскопии.
  3. Для получения немедленной / DEAD окрашивания, промыть устройство через входное отверстие пипеткой с 20 мкл PBS, чтобы смыть, инъекционные 20 мкл LIVE / DEAD красящим раствором с DAPI подготовлен в соответствии с инструкциями изготовителя, инкубировать в течение 30 мин при 37 ° С, промыть Устройство снова 20 мкл PBS, и изображение устройства с помощью флуоресцентной микроскопии.
  4. Для желчных CanaliCuLi окрашивание, промойте устройство через входное отверстие с помощью пипетки 20 мкл PBS, чтобы ополоснуть, вводят 20 мкл 2 мкМ CMFDA красящим раствором с DAPI подготовлен в соответствии с инструкциями изготовителя, инкубировать в течение 30 мин при 37 ° С, промыть устройство снова 20 мкл PBS, и изображение устройства с помощью флуоресцентной микроскопии.
  5. Сбор отработанных массовой информации и измерения клеточных метаболических продуктов на соответствующих временных точках в течение срока культуры для определения функции клеток. Для гепатоцитов, измеряют количество альбумина и мочевины в истощенных средах.
  6. Выполнение конечных функциональных анализов на самих клеток, таких как оценки уровней активности фермента, окрашивание антителом или анализа РНК. Для гепатоцитов, вызывают и измерить цитохрома Р450 деятельности или фазы II спряжения фермент глутатион S-трансферазы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Родной коллаген может быть изменен с помощью метилирования и Сукцинилирование создать поликатионные и полианионные коллагеновые решения для использования в слой за слоем осаждения. Сукцинилирование модифицирует Е-аминогрупп нативного коллагена с сукцинил групп, и метилирование изменяет карбоксильных групп нативного коллагена с метильной группы (фиг.1А). Эти модификации белка коллагена боковых цепей аминокислот изменить кривые рН титрование растворов. Сукцинилирование уменьшает количество аминогрупп и ув...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ультратонкие чистый коллаген сборки могут быть нанесены на заряженных клеток или материальных поверхностей с использованием слой за слоем отложение модифицированных коллагенов. Результаты этого исследования показывают, что метилирование и Сукцинилирование из нативного коллагена создать поликатионные и полианионные решения коллагена (Рисунок 1), которые могут быть использованы с слой за слоем техники на хранение ультратонких коллагеновый матрикс сборок на клетки (рис 2) или других заряже...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами от Национальных институтов здравоохранения, включая грант консорциума микрофизиологических систем от Национального центра развития трансляционных наук (UH2TR000503), стипендию Рут Л. Киршштейн Национальной исследовательской службы (F32DK098905 для WJM) и награду за путь к независимости (DK095984 для AB) от Национального института диабета, болезней пищеварительной системы и почек.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
коллаген типа I, крысиный хвостLife TechnologiesA1048301вариант для концентрированного коллагена крысиного хвоста
коллаген типа I, крысиный хвостSigma-AldrichC3867-1VLвариант для концентрированного коллагена крысиного хвоста
коллаген типа I, крысиный хвостEMD Millipore08-115вариант для концентрированного коллагена крысиного хвоста
коллаген типа I, крысиный хвостR%D Systems3440-100-01вариант для концентрированного коллагена крысиного хвоста
янтарный ангидридSigma-Aldrich239690-50Gсукцинилирование реагент
безводный метанолSigma-Aldrich322415-100MLреагент метилирования
гидроксид натрияSigma-AldrichS5881-500GpH осадок реагент
соляная кислотаSigma-Aldrich320331-500MLРеагент для определения рН
Коллаген крысы I типа ИФАChondrex6013Опция для определения содержания коллагена
Набор для анализа гидроксипролинаSigma-AldrichMAK008-1KTОпция для определения содержания коллагена
для анализа гидроксипролинаQuickzyme BiosciencesQZBtotcol1опция для определения содержания коллагена
Набор

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pedersen, J. A., Swartz, M. A. Mechanobiology in the third dimension. Ann Biomed Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).
  2. Glowacki, J., Mizuno, S. Collagen scaffolds for tissue engineering. Biopolymers. 89 (5), 338-344 (2008).
  3. Vescio, R. A., et al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. PNAS. 84, 5029-5033 (1987).
  4. Chandrasekaran, S., Guo, N. -h, Rodrigues, R. G., Kaiser, J., Roberts, D. D. Pro-adhesive and chemotactic activities of thrombospondin-1 for breast carcinoma cells are mediated by α3β1 integrin and regulated by insulin-like growth factor-1 and CD98. J Biol Chem. 274 (16), 11408-11416 (1999).
  5. Chen, S. S., et al. Multilineage differentiation of rhesus monkey embryonic stem cells in three‐dimensional culture systems. Stem Cells. 21 (3), 281-295 (2003).
  6. Whelan, M. C., Senger, D. R. Collagen I initiates endothelial cell morphogenesis by inducing actin polymerization through suppression of cyclic AMP and protein kinase A. J Biol Chem. 278 (1), 327-334 (2003).
  7. Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration. Biotechnol Prog. 7 (3), 237-245 (1991).
  8. Decher, G. Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites. Science. 277, 1232-1237 (1997).
  9. McCarty, W. J., et al. A novel ultrathin collagen nanolayer assembly for 3-D microtissue engineering: Layer-by-layer collagen deposition for long-term stable microfluidic hepatocyte culture. TECHNOLOGY. 2 (01), 67-74 (2014).
  10. Swierczewska, M., et al. Cellular response to nanoscale elastin-like polypeptide polyelectrolyte multilayers. Acta Biomater. 4 (4), 827-837 (2008).
  11. Kim, Y., Larkin, A. L., Davis, R. M., Rajagopalan, P. The design of in vitro liver sinusoid mimics using chitosan-hyaluronic acid polyelectrolyte multilayers. Tissue Eng Pt A. 16 (9), 2731-2741 (2010).
  12. Larkin, A. L., Rodrigues, R. R., Murali, T., Rajagopalan, P. Designing a Multicellular Organotypic 3D Liver Model with a Detachable, Nanoscale Polymeric Space of Disse. Tissue Eng Pt C. 19 (11), 875-884 (2013).
  13. Kidambi, S., et al. Patterned Co‐Culture of Primary Hepatocytes and Fibroblasts Using Polyelectrolyte Multilayer Templates. Macromol Biosci. 7 (3), 344-353 (2007).
  14. Janorkar, A. V., Rajagopalan, P., Yarmush, M. L., Megeed, Z. The use of elastin-like polypeptide-polyelectrolyte complexes to control hepatocyte morphology and function in vitro. Biomaterials. 29 (6), 625-632 (2008).
  15. Piez, K. A., Eigner, E. A., Lewis, M. S. The Chromatographic Separation and Amino Acid Composition of the Subunits of Several Collagens*. Biochemistry. 2 (1), 58-66 (1963).
  16. Tanford, C. The interpretation of hydrogen ion titration curves of proteins. Adv Protein Chem. 17, 69-165 (1962).
  17. Cayot, P., Tainturier, G. The quantification of protein amino groups by the trinitrobenzenesulfonic acid method: a reexamination. Anal Biochem. 249 (2), 184-200 (1997).
  18. Kakade, M. L., Liener, I. E. Determination of available lysine in proteins. Anal Biochem. 27 (2), 273-280 (1969).
  19. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Layer by Layer AssemblyHepatocyte CultureCollagen ModificationMethylated CollagenSuccinated CollagenCell PolaritySecretory FunctionThin Collagen Layers

Похожие статьи