Мы описываем 3D-модель культуры эпителия молочной железы человека, которая подходит для изучения действия гормонов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Гормон проблематику 3D Культура модель человеческого эпителия молочной железы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
На процесс морфогенеза эпителия молочной железы влияют гормоны. Изучение действия гормонов на эпителий молочной железы с использованием 2D-культур ограничено конечными точками пролиферации клеток и экспрессии генов. Однако в организме морфогенез молочных желез происходит в 3D-среде. Системы 3D-культивирования помогают преодолеть разрыв между монослойной клеточной культурой (2D) и сложностью организма. В данной работе мы описываем 3D-модель культуры эпителия молочной железы человека, которая подходит для изучения действия гормонов. В качестве матрицы используется коммерчески доступная гормонально-чувствительная эпителиальная клеточная линия молочной железы человека, T47D, и коллаген крысиного хвоста типа 1. Эта 3D-модель культуры реагирует на основные маммотропные гормоны: эстрадиол, прогестины и пролактин. Влияние этих гормонов на морфогенез эпителия может наблюдаться после 1- или 2-недельного лечения в зависимости от конечной точки. 3D-культуры могут быть собраны для анализа морфогенеза эпителия, пролиферации клеток и экспрессии генов.
Введение
В отличие от стандартных 2D культур, 3D клеточных культур суррогатных модели позволяют для изучения эпителиального клеточного поведения в физиологически соответствующей контексте, одной напоминающей ткань. 3D культуры молочной железы помогли выяснить многие аспекты развития молочных желез и неоплазии. Тем не менее, большинство моделей культуры 3D доступных в настоящее время являются неподходящими для изучения гормональное действие, поскольку эпителиальные клеточные линии человека, используемые для выполнения этой задачи лишены экспрессии 6,7,9 рецептора гормона.
Здесь мы описываем 3D модель культуры эпителия молочной железы чел....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка реагентов
- Растворите синтетический прогестаген promegestone (R5020) и 17-бета-эстрадиол (Е2) в этаноле, чтобы сделать 10 -3 м растворы. Растворите пролактин в дистиллированной деионизированной водой, чтобы сделать 1 мг / мл маточного раствора. Растворите антиэстроген ICI 182780 в ДМСО сделать 10 -2 М маточного раствора. Храните эти решения при -20 ° С до 6 месяцев.
- Древесный уголь декстрана (CD) раздели сыворотку и CDFBS среду:
- Тепло-инактивации фетальной бычьей сыворотки (FBS) в водяной бане 57 ° C в течение 30 мин.
Примечание: Использовать только промывают стеклянную посуду на оставшуюся часть....
- Тепло-инактивации фетальной бычьей сыворотки (FBS) в водяной бане 57 ° C в течение 30 мин.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 1 приведена процедура для получения гормоночувствительным 3D культур. Эпителиальные структуры наблюдаются в тотальных гелей, культивированных в течение 2 недель в присутствии E2 и в комбинации с другими гормонами. Только отдельные клетки или группы клеток 2-3 присутствуют, когда никакие гормоны не будут добавлены в культуральную среду (CDFBS среднего) (рис.2). Это условие служит в качестве отрицательного контроля.
Клетки в 3D структуры образуют культ.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этой статье мы описываем гормоночувствительную 3D-модель культуры, чтобы проверить действие гормонов на эпителий молочной железы. Реакция на гормоны может быть оценена на уровнях морфологии тканей, пролиферации клеток и экспрессии генов 12. Одним из ограничений этого метода является то, что визуализация в период культивирования ограничена световой микроскопией, поскольку культуры выращиваются в пластиковой нижней пластине. Система 3D-культивирования может быть адаптирована к стеклянным донным пластинам, чтоб.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы высоко ценим редакционных взносы от Шерил Schaeberle. Это исследование было поддержано Avon грантов # 02-2009-093 и 02-2011-095 и NIEHS / NIH ES 08314 до AMS. Этот материал предназначен исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института гигиены окружающей среды наук или Национального института здоровья.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 12-луночные планшеты для культивирования тканей (Falcon) | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 мл полистирольные конические пробирки | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Активированный уголь | Sigma | C-5510 | |
| Кармин квасцы | Sigma | C1022-100G | |
| коллагеназа, тип 3 | Worthington | S0C11784 | |
| Конфокальный микроскоп | Zeiss | LSM510 | оснащен HeNe 633nm лазером |
| Dextran T-70 | Abersham/Pharmacia | 17-0280-01 | |
| DMEM/F-12, HEPES, без фенола красного цвета; | Life Technologies | 11339-021 | Фенол красные среды для гормонального применения |
| DMEM, низкий уровень глюкозы, пируват, без глутамина, без фенола красный | Life Technologies | 11054-020 | Фенол красный без красных сред для гормонального применения |
| 17-&бета;-Эстрадиол | EMD Millipore | 3301 | Растворенный в этаноле |
| Этанол | Koptec | V1001 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Гиклон | SH30070.03 | Для использования с гормонами, необходимо удалить древесный уголь Dextran stripped; |
| Фильтры (115 мл) | Nalgene | 380-0080, 245-0045, 120-0020 | 0,88, 0,45, 0,20 мкм, соответственно; |
| Формалин, 10% | Fisher Scientific | SF93-20 | |
| (200 мМ) | Life Technologies | 25030-081 | |
| ICI 182,780 (фулвестрант) | Sigma Aldrich | I4409-25MG | растворен в |
| микротоме ДМСО | Leica | RM2155 | |
| Среда для встраивания тканей | McCormick Scientific | 39502004 | |
| Пенициллин | Sigma | 7794-10MU | Растворенный в 10 мл дистиллированной деионизированной воды |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Фосфат Буферный Физиологический Раствор pH 7,4 | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | |
| Пролактин | Sigma Aldrich | L4021-50UG | Растворенный в дистиллированной деионизированной воде |
| Промегестон | Перкин Элмер | NLP004005MG | Растворенный в этаноле |
| коллаген крысиного хвоста | Corning | 354236 | Партии могут содержать различные концентрации, обратите внимание соответственно |
| Скальпель | Miltex | 4311 | |
| Полузакрытый настольный тканевый процессор | Leica | TP1020 | |
| Гидроксид натрия | Sigma Aldrich | S5881 | Prepare 1N NaOH стоковый |
| StaticMaster Антистатическая щетка | Amstat | C3500 | |
| Полосатые серологические пипетки | Corning | 4101 | |
| Колбы Т-25 Corning | |||
| Тканевые кассеты | Fisher Scientific | 15-200-403E | |
| Wheaton Флаконы, стекло, 20 мл | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| Ксилол | ВВР | 95057-822 |
Ссылки
- Barnes, C., et al. From single cells to tissues: interactions between the matrix and human breast cells in real time. PLoS ONE. 9, e93325(2014).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
