Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Гормон проблематику 3D Культура модель человеческого эпителия молочной железы

8.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53098

⸱

7 февраля 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Integrative Physiology and Pathobiology, Tufts University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем 3D-модель культуры эпителия молочной железы человека, которая подходит для изучения действия гормонов.

Аннотация

На процесс морфогенеза эпителия молочной железы влияют гормоны. Изучение действия гормонов на эпителий молочной железы с использованием 2D-культур ограничено конечными точками пролиферации клеток и экспрессии генов. Однако в организме морфогенез молочных желез происходит в 3D-среде. Системы 3D-культивирования помогают преодолеть разрыв между монослойной клеточной культурой (2D) и сложностью организма. В данной работе мы описываем 3D-модель культуры эпителия молочной железы человека, которая подходит для изучения действия гормонов. В качестве матрицы используется коммерчески доступная гормонально-чувствительная эпителиальная клеточная линия молочной железы человека, T47D, и коллаген крысиного хвоста типа 1. Эта 3D-модель культуры реагирует на основные маммотропные гормоны: эстрадиол, прогестины и пролактин. Влияние этих гормонов на морфогенез эпителия может наблюдаться после 1- или 2-недельного лечения в зависимости от конечной точки. 3D-культуры могут быть собраны для анализа морфогенеза эпителия, пролиферации клеток и экспрессии генов.

Введение

В отличие от стандартных 2D культур, 3D клеточных культур суррогатных модели позволяют для изучения эпителиального клеточного поведения в физиологически соответствующей контексте, одной напоминающей ткань. 3D культуры молочной железы помогли выяснить многие аспекты развития молочных желез и неоплазии. Тем не менее, большинство моделей культуры 3D доступных в настоящее время являются неподходящими для изучения гормональное действие, поскольку эпителиальные клеточные линии человека, используемые для выполнения этой задачи лишены экспрессии 6,7,9 рецептора гормона.

Здесь мы описываем 3D модель культуры эпителия молочной железы человека, который подходит для изучения гормона действие 12. Эта модель использует коммерчески доступный гормон реагирует человеческий клеточную линию рака молочной эпителиальных, T47D 3,11,13, которые были первоначально полученную из плеврит, полученной из 54-летней пациентки в с проникающими раком протоков молочной железы. Мы используем крысиного хвоста коллагена типа 1 в качестве матрицы. Эта 3D культЮр модель подходит для изучения действия трех основных mammotropic гормонов (эстрадиола, promegestone (аналог прогестерона), и пролактина) на клетках рака молочной эпителиальных человека. Гормон-индуцированный эпителиальный морфология может быть оценена количественно с течением времени с помощью морфометрического анализа 12.

Необходимости повышения плотности посева дает эти 3D культур должны храниться в течение 2-х недель. К этому времени, разработка структур является достаточным для надежного количественной оценки действия гормонов на эпителиальной морфологии. Гели могут также быть собраны в более ранних временных точках для клеточной пролиферации и экспрессии генов анализов. Кроме того, эта модель подходит для проверки эффектов последовательного гормонального лечения; Например, после обработки эстрадиола в течение первой недели и замены с другими гормона / комбинации гормонов в течение следующей недели. Эффект эстрогенных соединений и антиэстрогены, такие как ICI 182,780, также могут быть стуумер использовании этого 3D культуры модель 12.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка реагентов

  1. Растворите синтетический прогестаген promegestone (R5020) и 17-бета-эстрадиол (Е2) в этаноле, чтобы сделать 10 -3 м растворы. Растворите пролактин в дистиллированной деионизированной водой, чтобы сделать 1 мг / мл маточного раствора. Растворите антиэстроген ICI 182780 в ДМСО сделать 10 -2 М маточного раствора. Храните эти решения при -20 ° С до 6 месяцев.
  2. Древесный уголь декстрана (CD) раздели сыворотку и CDFBS среду:
    1. Тепло-инактивации фетальной бычьей сыворотки (FBS) в водяной бане 57 ° C в течение 30 мин.
      Примечание: Использовать только промывают стеклянную посуду на оставшуюся часть этого протокола.
    2. Рассчитать количество угля, необходимого. Используя 10% больше объема, чем количество сыворотки, чтобы компенсировать смещения, вызванного углем, весят 5% вес / объем активированного порошкообразного угля.
    3. Промыть уголь дважды холодной деионизированной дистиллированной водой с использованием того же объема, что и количества сыворотки. Для каждого мытья Centrifuge при 50 мкг в течение 2 мин для осаждения уголь. Удалить воду между стирок. Добавить 0,5% вес / объем декстран Т-70 до последней углем гранул. Повторное приостановить с дистиллированной деионизированной водой и центрифугируют при 100 х г в течение 5 мин. Аспирируйте воду.
    4. Добавить соответствующий объем сыворотки к осадку и повторно приостанавливать уголь декстрана осадок в сыворотке крови. Инкубируйте, при прокатке (6 оборотов в минуту), при 37 ° С в течение 60 мин. Центрифуга при 2000 х г в течение 20 мин. Если супернатант появляется облачно, повторите центрифугирования; Однако, сыворотка может быть не совсем понятно в это время, но будет очищен в процессе фильтрации.
    5. Смесь фильтруют через 0,80-микронный фильтр, а затем снова через 0,45-микронный фильтр для удаления крупных твердых частиц. Наконец, фильтр-стерилизуют при 0,20-микронный фильтр. Магазин фильтруют CDFBS в стеклянных трубках или Т-25 колб культуры при -20 ° С.
    6. Древесный уголь декстрана Лишенный эмбриональной бычьей среде, содержащей (CDFBS СМИ): смешать 375 мл фенола красного свободной DMEM и 125 мл DMEM/ F-12. Удалить 37,5 мл и заменить его таким же объемом уголь декстрана Stripped эмбриональной телячьей сыворотки. Добавьте 10 6 ед / мл пенициллина и L-глутамин до конечной концентрации 2 мМ. Полученный носитель 75% DMEM, 25% DMEM / F-12, 7,5% Уголь декстран раздели-FBS, 2 мМ L-глутамина, и 10 6 ед / мл пенициллина.
  3. Подготовьте 10X PBS, 1N NaOH и дистиллированной деионизированной воды. Подготовьте достаточным объемом каждого по объему раствора коллагена, необходимого. Стерилизовать все решения от фильтрации. Хранить 10x PBS и стерильной дистиллированной деионизированной воды при 4 ° С в течение до 1 месяца. Не храните раствор 1N NaOH.
  4. Подготовьте раствора коллагена в / мл конечной концентрации 1 мг в соответствии с протоколом для "альтернативная методика гелеобразование для Collagen I, крысиный хвост", предоставленного производителем. Каждый гель изготовлен из 1,5 мл раствора коллагена. Например, приготовить 18,5 мл (0,5 мл для учета потерь во время пипетки) коллагенового раствора, чтобы подготовить12 гели. немедленно Используйте раствора коллагена или держать на льду в течение до 2-3 ч.
  5. Кармин Квасцы краситель:
    1. Объедин ют 1 г Carmine и 2,5 г сульфата алюминия калия в 500 мл дистиллированной воды. Кипение при перемешивании в течение 20 мин. Смотрите внимательно, чтобы избежать выкипания. Регулировка конечного объема обратно до 500 мл дополнительным количеством дистиллированной воды.
    2. Добавить кристалл тимола для антимикробной активности и охватывают бутылку с алюминиевой фольгой для защиты от света. Смесь фильтруют через бумажный фильтр лабораторное класса перед каждым использованием. Повторное решение кармин на срок до трех месяцев. Хранить при комнатной температуре, в защищенном от света.
  6. Раствора коллагеназы: растворить коллагеназы в DMEM / F12, при концентрации 0,125% вес / объем. Не храните это решение.

2. 3D культуры T47D клетки крысы хвост коллагена типа 1 Гели и Гормональное лечение

Примечание: держать стерильные серологические пипетки и наконечники при 4 ° С.

  1. Подготовительномповторно одноклеточного подвеску и выполнить подсчет клеток. культуры Split T47D клеток, прежде чем они достигают 70% слияния. Центрифуга том, содержащий количество клеток, необходимых. Учтите, что один гель должен содержать около 75000 T47D клетки.
  2. Использование холодного пипетки, повторно приостанавливать осадок клеток в соответствующий объем коллагена. Рассмотрим, что каждый гель состоит из 1,5 мл коллагена. Смешайте клетки и коллаген осторожно, чтобы избежать введения пузырьков.
  3. Для предотвращения воздействия статического электричества на распределение клеток, чистить границ, верхнюю и нижнюю часть 12-луночного планшета со статическим снижения кисти после разворачивания пластину. Чтобы избежать накопления статического заряда заряда при контакте с рабочей поверхностью капота, поместите эту пластину поверх другого 12-луночного планшета (заглушку), что также матового со статическим снижения brush.Gently, залить 1,5 мл смеси в каждую лунку 12-луночного планшета.
  4. Место пластины в инкубаторе при 37 ° С в течение 30 мин. Удалить тысе пластины из инкубатора и поместить его обратно в капюшоне.
  5. Использование P200 стерильную наконечник, тщательно отделить гель в нежном круговом движении от границы скважины. Гель также должны отделяться от нижней части скважины.
  6. Развести гормоны в CDFBS сред, которые будут добавлены к лункам. Используйте Е2 и R5020 при конечной концентрации пролактина и 10 -10 м при при 10 -7 М конечной концентрации. В качестве контроля используют CDFBS СМИ без гормонов добавлен, но все еще содержащий наибольший объем ДМСО, равной запасов гормонов, используемых. Убедитесь, что каждая лунка содержит 1,5 мл среды. Поместите 3D культур внутри 37 ° C, 5% CO 2, 100% влажность тканевой культуры инкубатор. Поддерживать культуру в течение 1 или 2 недель, меняя СМИ каждые 2 дня.

3. Гель Обработка для тотальных

  1. Удалить питательных сред и добавить 1,5 мл PBS в каждую лунку.
  2. Передача гель на слайд. Вырезать гель пополам с использованием кривойd хирургическое лезвие. Продолжить обработку с одной половиной и сохранить другую половину для гистологического анализа.
  3. Перенести половину гель для всего смонтировать на слайде. Пусть гель сохнуть в течение 5 мин, а затем передать слайда в Коплин банку, содержащую 10% формалин.
    Примечание: Все инкубации должно быть сделано при комнатной температуре.
  4. Fix гели в Коплин банку на шейкере O / N.
  5. Мытье скользит дважды PBS в течение 10 минут каждый по шейкере. Передача слайды 70% этанола; инкубировать в течение 1 часа на шейкере. Передача слайдов до Carmine Alum O / N.
  6. На следующий день, обезвоживают слайды на шейкере в 70% этанола, 95% этанола и 100% этанола в течение 1 ч каждой. Передача слайды в ксилол дважды в течение 1 ч каждый и держать на качалке. Используйте на основе толуола гистологическая среда монтировать гели и толщиной 1,5 мм покровные.
  7. Изучить тотальных под обычном свете (микроскопа или стереоскоп). Для более детального анализа формы и просвета использовать конфокальной микроскопии и визуализации Carmine краситель Hene 633 нм лазер.

4. Гель Обработка переработки для гистологии анализа

  1. Передача оставшуюся половину геля стеклянную пробирку емкостью 20 мл, содержащую 10% формалин и зафиксировать на шейкере O / N.
  2. Вымойте гели дважды PBS в течение 10 минут каждый по шейкере. Место гели в переработку кассет для парафин.
  3. Передача гели до 70% этанола, инкубируют в течение 1 ч, а затем с 95% этанола в течение 1 ч, менять на свежий 95% этанола в течение 1 ч, 100% EtOH в течение 1 ч, и изменить на свежий 100% этанола в течение 1 часа. В этот момент, гели могут быть сохранены в 100% EtOH O / N при КТ или инкубировали с ксилолом в течение 1 ч, а затем снова в свежем ксилола в течение 1 часа.
  4. Передача кассеты парафином в течение 1 ч при 60 ° С в вакуумном инкубаторе, повторить со свежим парафином в два раза больше.
  5. Заполните пластиковые формы с чистой парафина. Откройте кассету, удалить гель и поместить его в пластиковые формы, содержащий парафин. Пополнить парафином и добавить вершину кассетой, содержащей метку на вершине, и пусть блок круто.
  6. Удалите пластIC плесени и раздел блок с помощью микротома. Получить 5 мкм толстые секции для HE окрашивания и иммуноцитохимия.

5. Экстракция клеток из клеток от гелей, используя коллагеназы Лечение

  1. Удалить гель из колодца и перенести его на чашку Петри, содержащую PBS. Промыть гель кратко.
  2. Передача гель 15 мл пробирку, содержащую 2 мл 0,125% коллагеназы. Внесите вверх и вниз 4-5 раз, чтобы разорвать гель на мелкие кусочки.
  3. Инкубировать при 37 ° С в течение 25 мин (до тех пор, пока гель не растворится и клетки в суспензии)
  4. Добавляют 2 мл сыворотки, дополненной культуральной среде. Сбор клеток путем центрифугирования (1000 XG, 5 мин), отбросить супернатант, вновь приостановить клеток и считать.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рисунок 1 приведена процедура для получения гормоночувствительным 3D культур. Эпителиальные структуры наблюдаются в тотальных гелей, культивированных в течение 2 недель в присутствии E2 и в комбинации с другими гормонами. Только отдельные клетки или группы клеток 2-3 присутствуют, когда никакие гормоны не будут добавлены в культуральную среду (CDFBS среднего) (рис.2). Это условие служит в качестве отрицательного контроля.

Клетки в 3D структуры образуют культ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой статье мы описываем гормоночувствительную 3D-модель культуры, чтобы проверить действие гормонов на эпителий молочной железы. Реакция на гормоны может быть оценена на уровнях морфологии тканей, пролиферации клеток и экспрессии генов 12. Одним из ограничений этого метода является то, что визуализация в период культивирования ограничена световой микроскопией, поскольку культуры выращиваются в пластиковой нижней пластине. Система 3D-культивирования может быть адаптирована к стеклянным донным пластинам, чтоб...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы высоко ценим редакционных взносы от Шерил Schaeberle. Это исследование было поддержано Avon грантов # 02-2009-093 и 02-2011-095 и NIEHS / NIH ES 08314 до AMS. Этот материал предназначен исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института гигиены окружающей среды наук или Национального института здоровья.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
12-луночные планшеты для культивирования тканей (Falcon)Fisher Scientific08-772-29
15 мл полистирольные конические пробиркиFisher Scientific14-959-49D
Активированный угольSigmaC-5510
Кармин квасцыSigmaC1022-100G
коллагеназа, тип 3WorthingtonS0C11784
Конфокальный микроскопZeissLSM510оснащен HeNe 633nm лазером
Dextran T-70Abersham/Pharmacia17-0280-01
DMEM/F-12, HEPES, без фенола красного цвета;Life Technologies11339-021Фенол красные среды для гормонального применения
DMEM, низкий уровень глюкозы, пируват, без глутамина, без фенола красныйLife Technologies11054-020Фенол красный без красных сред для гормонального применения
17-&бета;-ЭстрадиолEMD Millipore3301Растворенный в этаноле
ЭтанолKoptecV1001
Фетальная бычья сывороткаГиклонSH30070.03Для использования с гормонами, необходимо удалить древесный уголь Dextran stripped;
Фильтры (115 мл)Nalgene380-0080, 245-0045, 120-00200,88, 0,45, 0,20 мкм, соответственно;
Формалин, 10%Fisher ScientificSF93-20
(200 мМ)Life Technologies25030-081
ICI 182,780 (фулвестрант)Sigma AldrichI4409-25MGрастворен в
микротоме ДМСО LeicaRM2155
Среда для встраивания тканейMcCormick Scientific39502004
ПенициллинSigma7794-10MUРастворенный в 10 мл дистиллированной деионизированной воды
PermountFisher ScientificSP15-500
Фосфат Буферный Физиологический Раствор pH 7,4Sigma AldrichP3813-10PAK
ПролактинSigma AldrichL4021-50UGРастворенный в дистиллированной деионизированной воде
ПромегестонПеркин ЭлмерNLP004005MGРастворенный в этаноле
коллаген крысиного хвоста Corning 354236Партии могут содержать различные концентрации, обратите внимание соответственно
СкальпельMiltex4311
Полузакрытый настольный тканевый процессорLeicaTP1020
Гидроксид натрияSigma AldrichS5881Prepare 1N NaOH стоковый
StaticMaster Антистатическая щетка AmstatC3500
Полосатые серологические пипетки Corning 4101
Колбы Т-25 Corning 
Тканевые кассетыFisher Scientific15-200-403E
Wheaton Флаконы, стекло, 20 млFisher Scientific03-341-25D 
Ксилол ВВР95057-822
L-глутамин 430168

Ссылки

  1. Barnes, C., et al. From single cells to tissues: interactions between the matrix and human breast cells in real time. PLoS ONE. 9, e93325(2014).
  2. Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen responsive cells in culture. Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 83, 2496-2500 (1986).
  3. Chalbos, D., Vignon, F., Keydar, I., Rochefort, H. Estrogens stimulate cell proliferation and induce secretory proteins in a human breast cancer cell line (T47D). J.Clin.Endocrinol.Metab. 55, 276-283 (1982).
  4. Dhimolea, E., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. The role of collagen reorganization on mammary epithelial morphogenesis in a 3D culture model. Biomaterials. 31, 3622-3630 (2010).
  5. Dhimolea, E., Soto, A. M., Sonnenschein, C. Breast epithelial tissue morphology is affected in 3D cultures by species-specific collagen-based extracellular matrix. J.Biomed.Mat.Res.A. 100, 2905-2912 (2012).
  6. Krause, S., et al. Dual regulation of breast tubulogenesis using extracellular matrix composition and stromal cells. Tissue Eng Part A. 18, 520-532 (2012).
  7. Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. A novel 3D in vitro. culture model to study stromal-epithelial interactions in the mammary gland. Tissue Eng.Part C Methods. 14, 261-271 (2008).
  8. Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. The microenvironment determines the breast cancer cells' phenotype: organization of MCF7 cells in 3D cultures. BMC Cancer. 10, 263-275 (2010).
  9. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat.Methods. 4, 359-365 (2007).
  10. Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression. Int.J.Cancer. , (2014).
  11. Soto, A. M., Murai, J. T., Siiteri, P. K., Sonnenschein, C. Control of cell proliferation: evidence for negative control on estrogen-sensitive T47D human breast cancer cells. Cancer Res. 46, 2271-2275 (1986).
  12. Speroni, L., et al. Hormonal regulation of epithelial organization in a 3D breast tissue culture model. Tissue Eng.Part C Methods. 20, 42-51 (2014).
  13. Vignon, F., Bardon, S., Chalbos, D., Rochefort, H. Antiestrogenic effect of R5020, a synthetic progestin in human breast cancer cells in culture. J.Clin.Endocrinol.Metab. 56, 1124-1130 (1983).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Трехмерная модель культурыгормон-чувствительные клеткиэпителий молочной железыклетки T47Dколлаген из хвоста крысыобработка эстрадиоломобработка прогестиномобработка пролактиномэпителиальный морфогенезпролиферация клеток
Гормон проблематику 3D Культура модель человеческого эпителия молочной железы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.