Методическая статья

Методы подавления бактериального Pyomelanin Производство и определить соответствующую увеличению чувствительности к окислительному стрессу

7.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53105

⸱

31 августа 2015 г.

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Wisconsin Milwaukee

В этой статье

Краткое содержание

Бактериальная выработка пиомеланина приводит к повышению устойчивости к окислительному стрессу и вирулентности. Мы сообщаем о методах, которые могут быть использованы для определения ингибирования продукции пиомеланина и анализа результирующего повышения чувствительности к окислительному стрессу у бактерий, а также определения минимальной ингибирующей концентрации антибиотика (MIC).

Аннотация

Пиомеланин — это внеклеточный красно-коричневый пигмент, производимый несколькими видами бактерий и грибов. Этот пигмент образуется в результате пути катаболизма тирозина и способствует повышению устойчивости к окислительному стрессу. Продукция пиомеланина у Pseudomonas aeruginosa снижается дозозависимым образом за счет лечения 2-[2-нитро-4-(трифторметил)бензоил]-1,3-циклогександионом (NTBC). Мы описываем метод титрования с использованием нескольких концентраций NTBC для определения концентрации препарата, который снижает или прекращает выработку пиомеланина в бактериях. Метод титрования имеет легко поддающийся количественной оценке результат, заметное снижение продукции пигмента с увеличением концентрации препарата. Мы также описываем метод микротитровальной пластины для определения минимальной ингибиторной концентрации антибиотика (MIC) у бактерий. Этот метод использует минимум ресурсов и может быть легко масштабирован для тестирования нескольких антибиотиков в одном микротитровом планшете для одного штамма бактерий. Анализ MIC может быть адаптирован для проверки влияния соединений, не содержащих антибиотики, на рост бактерий в определенных концентрациях. Наконец, мы описываем метод тестирования чувствительности бактерий к окислительному стрессу путем включения H2O2 в агаровые пластины и обнаружения множественных разведений бактерий на пластинах. Чувствительность к окислительному стрессу проявляется в уменьшении количества и размера колоний при различных разведениях на планшетах, содержащих H2O2 по сравнению с контролем без H2O2. Для анализа пятен окислительного стресса используется минимум ресурсов и низкие концентрацииH2,O2. Важно отметить, что он также обладает хорошей воспроизводимостью. Этот анализ пятнистых пластин может быть адаптирован для проверки чувствительности бактерий к различным соединениям путем включения соединений в агаровые пластины и характеристики результирующего роста бактерий.

Введение

Pseudomonas aeruginosa - это грамотрицательная бактерия, которая производит различные пигменты, включая пиомеланин, красно-коричневый пигмент, который помогает обеспечить защиту от окислительного стресса1-4 и связывает различные соединения, включая аминогликозидные антибиотики5-7. Продукция пиомеланина вызвана дефектом в пути катаболизма тирозина4,8, либо в результате делеций или мутаций гена, кодирующего гомогентизат 1,2-диоксигеназу (HmgA)1,9, либо в результате дисбаланса в различных ферментах в этом пути10. Гомогентизат накапливается из-за инактивации HmgA, секретируется и окисляется с образованием пиомеланина11. Производство пиомеланина может быть прекращено или снижено дозозависимым образом путем обработки гербицидом 2-[2-нитро-4-(трифторметил)бензоил]-1,3-циклогександионом (NTBC)12, который ингибирует 4-гидроксифенилпируватдиоксигеназу (Hpd) в пути катаболизма тирозина13. Hpd необходим для образования гомогентизата, а значит и пиомеланина11.

Мы подробно описываем три метода, которые были важны в наших исследованиях лечения NTBC штаммами P. aeruginosa, продуцирующими пиомеланин. Эти методы включают титрование НТБК для определения концентраций, которые устраняют или уменьшают выработку пиомеланина в лабораторных и клинических штаммах, продуцирующих пиомеланин, определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) антибиотиков при лечении бактерий НТБК и результирующую чувствительность к окислительному стрессу при лечении НТБХ.

Разработанный нами тест титрования служит двум целям. Во-первых, анализ позволит пользователю определить, может ли NTBC отменить или уменьшить выработку пиомеланина в изучаемой бактерии и в каких концентрациях. Это позволит пользователю определить чувствительность к NTBC, поскольку разные штаммы бактерий могут иметь разную чувствительность к этому соединению, как это наблюдается у P. aeruginosa12. Во-вторых, анализ титрования NTBC позволит пользователю определить подходящую концентрацию NTBC для использования в последующих анализах, таких как анализ антибиотиков MIC и анализ реакции на окислительный стресс, если цель состоит в том, чтобы отменить или уменьшить выработку пиомеланина и определить эффекты восстановления пигмента.

Анализ титрования работает, потому что видимая разница в производстве пиомеланина может быть видна в штаммах, обработанных NTBC, и различия в производстве пиомеланина зависят от дозы12. Кроме того, этот метод может быть применен для изучения других соединений, которые могут устранять или усиливать выработку пигмента у бактерий.

Антибиотики MICs используются для определения чувствительности бактерий к антибиотикам. Существует несколько методов определения MIC, включая агаровые разбавляющие планшеты и бульонные разведения14. Разведение бульона можно проводить в небольших пробирках или в 96-луночном микротитровальном планшете. Описанный здесь метод определения MIC с помощью микротитровой пластины позволит пользователю тестировать широкий спектр антибиотиков с использованием минимальных ресурсов. Анализ обеспечивает воспроизводимость, а также гибкость в отношении количества антибиотиков и штаммов, тестируемых этим методом. Кроме того, с включением NTBC в анализ, пользователь может определить, изменяет ли элиминация или снижение выработки пиомеланина чувствительность к антибиотикам у бактерий, продуцирующих пиомеланин.

Реакцию бактерий на окислительный стресс можно проверить несколькими способами. Наиболее распространенными описанными методами являются либо жизнеспособные подсчеты бактерий, подвергнутых окислительному стрессу в течение определенного периода времени1, либо дисковые диффузионные анализы окислительного стресса15. Эти методы, как правило, используют высокие концентрации окислительных стрессоров для изучения эффектов окислительного стресса у бактерий, и результаты могут быть весьма вариабельными между биологическими репликами. Анализ жизнеспособного количества также имеет тенденцию использовать больше агаровых пластин, чем другие методы. В описанном нами анализе с помощью точечной пластины используются низкие концентрацииH2,O2, что позволяет пользователю проверить реакцию на окислительный стресс нескольких штаммов с использованием минимального количества пластин. Анализ также последовательно воспроизводим между техническими и биологическими репликами. Поскольку пиомеланин участвует в устойчивости к окислительному стрессу, включение NTBC в анализ позволяет пользователю определить влияние элиминации производства пиомеланина на устойчивость к окислительному стрессу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Приготовление культуральных сред, антибиотики, и 2- [2-нитро-4- (трифторметил) бензоил] -1,3-циклогександиона (NTBC)

  1. Сделайте отвар LB (1% триптона, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,25% NaCl в H 2 O) и аликвоту в соответствующих объемах. Стерилизовать в автоклаве. Хранить при комнатной температуре.
  2. Сделайте 100 мл LB-агар (1% триптонового, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,25% NaCl, 1,5% агар в H 2 O) в 250 мл колбах. Стерилизовать в автоклаве и хранить при комнатной температуре. Убедитесь, что агар расплавляют перед заливкой в ​​пластинах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Колбы, содержащие 100 мл LB-агар даст 4 пластины. Количество LB агаре могут быть изменены, чтобы соответствовать числу пластин, необходимых для анализа.
  3. Сделать PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мм KCl, 10 мМ Na 2 HPO 4, 2 мМ KH 2 PO 4) 16. Стерилизация в автоклаве или фильтрацией и хранят при комнатной температуре.
  4. Подготовка к антибиотикам растворы для гентамицина, канамицина, А.Н.д тобрамицин.
    1. Подготовьте соответствующие антибиотики концентрации акций для P. Штаммы, содержащие палочка 100 мг / мл гентамицина в дозе 30 мг / мл канамицина и 10 мг / мл тобрамицина. Растворить антибиотики в воде, стерилизуют фильтра (0,2 мкм) и хранят при температуре 4 ° С. Alter антибиотики и концентрации в зависимости от изучаемого бактерии.
  5. Подготовьте растворы NTBC. Растворите 10 мг NTBC в 400 мкл ДМСО. Это дает концентрацию 75,9 мМ NTBC. Храните NTBC растворы при температуре -20 ° C. Оттаивания растворах при комнатной температуре при необходимости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разные источники NTBC имеют различия в растворимости. Определить подходящий автомобиль, в котором распускать NTBC на основе рекомендаций производителя и скорректировать Шаг 1,5 соответственно.

2. NTBC титрования бактериальных штаммов

  1. Настройка ночных культур штаммов для тестирования. Добавить 2 мл LB бульона до 16 х 150 мм пробирку(Один за деформации) и прививку с 1 изолированных колонии от каждого штамма. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С с аэрацией на культуре ткани ротатора в воздушном инкубаторе.
  2. На следующий день, готовить титрования NTBC в LB бульоне. Используйте первоначальный диапазон от 0 до 900 мкМ NTBC, так как различные штаммы имеют различия в чувствительности к NTBC.
    1. Добавить 1 мл LB бульона 4 до 5 пробирок (16 х 150 мм) на линию.
    2. Добавьте исходный раствор NTBC (75,9 мм) до пробирках (16 х 150 мм) в диапазоне концентраций. В таблице 1 для концентраций NTBC и соответствующих объемов фондовых добавить 1 мл LB бульоне.
  3. Измерьте оптическую плотность 600 из ночных культур. Вымойте культур, прежде чем принимать OD 600 показания по ликвидации pyomelanin присутствует в средствах массовой информации.
    1. Вымойте культур путем центрифугирования 1 мл культуры в микроцентрифуге при 16000 мкг в течение 2 мин. Удалить супернатант и любые свободно осажденные клетки смикропипетки и ресуспендируют осадок клеток твердой в 1 мл LB.
  4. Привить титрования пробирки при OD 600 0,05. Рассчитать количество промытого культуры, необходимой для инокуляции пробирки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте мыть культур для прививок, так как pyomelanin не должны присутствовать.
  5. Инкубируют при титровании трубки в течение примерно 24 ч при 37 ° С с аэрацией, используя культуры ткани ротатор в воздушном инкубаторе.
  6. Сфотографировать титрования трубы и сравнивать производство пигмента внутри и между штаммами, чтобы определить количество NTBC использовать для ВПК и окислительного стресса анализов. Использование OD 600 показания для определения количества клеток в pyomelanin свободного культурального супернатанта и определить плотность клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отношение ОД 600 pyomelanin в культуральной супернатанта клеток может быть рассчитана для количественного различия в pyomelanin производства после лечения с NTBC.

3. Антибактериальная Минимальная Inhibiтори концентрацию (МИК) Анализ в 96-луночных планшетах

  1. Настройка ночных культур штаммов для испытания в LB и без NTBC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывается с помощью репрезентативной уровень 300 мкМ NTBC. Соответствующий уровень NTBC быть использованы при операции 2.6.
    1. Добавить 300 мкм NTBC 2 мл LB. Добавить эквивалентный объем носителя (ДМСО) 2 мл LB для условия не NTBC.
    2. Использование стерильных зубочистки, привить трубки с одной изолированной колонии бактерий. Там будет одна культура с NTBC и одна культура не NTBC для каждого штамма. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С с аэрацией, используя культуры ткани ротатор в воздушном инкубаторе.
  2. На следующий день, чтобы LB + NTBC и LB + ДМСО мастер решения для настройки MIC анализа. Добавить NTBC в концентрации 600 мкМ, как это будет разбавлен в два раза, когда посевной материал добавляется, получая конечную концентрацию 300 мкМ.
    1. Чтобы проверить один antibiушные для одного штамма, добавить 600 мкм NTBC 2 мл LB и смешать, чтобы сделать главное решение NTBC. Добавить эквивалентный объем носителя (ДМСО) в 2 мл LB и смешать, чтобы сделать не NTBC главное решение. Используйте эти решения для создания антибиотиков растворы, а также для создания серии разбавления в 96-луночных планшетах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Препараты мастер решение даст дополнительный решение для учета ошибок пипеток. Мастер растворы можно масштабировать вверх или вниз по мере необходимости в зависимости от количества антибиотиков и штаммов.
  3. Подготовка к антибиотикам решения в мастер-решений LB + NTBC или LB + ДМСО.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация антибиотика в этих растворов должен быть двойной финал требуемой концентрации. Достаточно раствор должен быть передать 100 мкл четырех скважин на 96-луночный планшет.
    1. Подготовьте гентамицин +/- NTBC маточного раствора при 64 мкг / мл. Для того, чтобы это решение, добавить 0,288 мкл гентамицин складе (100 мг / мл) до 450мкл LB + NTBC или LB + ДМСО мастер решение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальная концентрация гентамицина для Р. палочки PAO1 32 мкг / мл.
    2. Сделайте канамицин +/- NTBC маточного раствора в 256 мкг / мл. Для того, чтобы это решение, добавьте 3.84 мкл канамицина (30 мг / мл), 450 мкл LB + NTBC или LB + ДМСО мастер решений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальная концентрация канамицина для Р. палочки PAO1 128 мкг / мл.
    3. Подготовка тобрамицин +/- NTBC маточного раствора на 8 мкг / мл. Для того, чтобы это решение, добавить 0,36 мкл тобрамицина складе (10 мг / мл), 450 мкл LB + NTBC или LB + ДМСО мастер решений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для P. палочки PAO1, максимальная концентрация тобрамицина в 4 мкг / мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: антибиотики и концентрации могут быть скорректированы для бактерий быть проверены.
  4. Добавить 100 мкл каждого 2x раствором антибиотика с четырех скважин в 96-луночный планшет. Поместите эти решения в ряд А. Для examplе, гентамицин должен быть помещен в А1-А4, канамицин должны быть помещены в A5 через A8, и тобрамицин должны быть помещены в A9 через A12. См фиг.1А для диаграммы 96-луночного планшета, созданной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько антибиотики могут быть проверены в одной тарелке, но только один штамм должен быть проверен на плите, чтобы устранить потенциал для перекрестного заражения от других штаммов.
  5. Добавьте 50 мкл мастер раствора LB + NTBC или LB + ДМСО строкам B-Н от 96-луночного планшета. Убедитесь, что одна плита LB + NTBC и один пластина LB + ДМСО. Смотрите рисунок 1А.
    1. Используйте LB + NTBC для антибиотиков в LB + NTBC. Используйте LB + ДМСО для антибиотиков в LB + ДМСО.
  6. Использование микропипетки выполнять два раза серийных разведений антибиотиков путем передачи 50 мкл раствора из ряда А грести Б. Смешивают раствор, изменить советы пипетки, и передавать 50 мкл раствора, из ряда В грести C. Повторите для remainiнг строк. После разбавления ряда G, удалить 50 мкл раствора из этой строки и выбросить. Используйте строку H как без контроля антибиотиков для бактериального роста. Смотрите рисунок 1В.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый хорошо в рядах от А до G в настоящее время содержит 50 мкл антибиотика в LB + NTBC или LB + ДМСО на 2X конечный целевой концентрации. Ряд Н содержит LB + NTBC или LB + ДМСО без каких-либо антибиотиков.
  7. Измерьте оптическую плотность 600 из ночных культур. Вымойте все культуры, прежде чем принимать OD 600 показания по ликвидации pyomelanin присутствующих в средствах массовой информации.
    1. Вымойте культур путем центрифугирования 1 мл культуры в микроцентрифуге при 16000 мкг в течение 2 мин. Удалить супернатант с микропипетки и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл LB.
  8. Развести в одночасье 2.75x10 культур в 5 КОЕ / мл в LB.
    Примечание: Предположим, что один OD 600 блок является эквивалентом 1х10 9 КОЕ / мл для P. палочки. ОД в КОЕ / мл преобразований может быть Different в других бактерий.
  9. Добавить 50 мкл разбавленного бактериальной культуры к соответствующему скважины.
    Примечание: культур, выращенных в NTBC должны быть добавлены к лункам, содержащим NTBC и культуры, выращенные в ДМСО должны быть добавлены к лункам, содержащим ДМСО. Смотрите рисунок 1В.
    1. Добавить бактерии трех скважин на каждого штамма и концентрации антибиотика. Добавить 50 мкл LB с четвертой скважины, чтобы действовать в качестве контроля для бактериального заражения. Смотрите рисунок 1В.
    2. Используйте микропипетки многоканальный привить скважин. Убедитесь, что пипетки советы в нижней части скважины при добавлении прививочный для предотвращения загрязнения соседних скважин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление бактериальной культуры в лунки будет разбавлять антибиотика и NTBC концентраций, два раза.
  10. Накройте 96-луночных планшетах с парафином и инкубируют примерно 24 ч при 37 ° С. Инкубируют 96-луночных планшетах в статике, в воздушном инкубаторе.
  11. Исследоватьпластины для роста бактерий в скважинах. МИК представляет собой наименьшую концентрацию антибиотика, в которой нет роста бактерий не наблюдается для всех трех повторностей каждого штамма.
    1. Визуально проверьте пластину для роста или читать с помощью ридере набор для OD 600.

4. Пятно планшете для окислительного стресса ответ

  1. Настройка ночных культур штаммов для испытания в LB с и без NTBC как описано на стадии 3.1.
  2. На следующий день, готовить агаром LB, содержащих H 2 O 2 в качестве окислительного стресса. 2 О 2 концентрации в диапазоне Н от 0 до 1 мм является хорошей отправной точкой.
    1. Растопить агар колб фунт. Классные СМИ примерно 50 ° C при комнатной температуре.
    2. Добавить H 2 O 2, непосредственно к охлаждаемой среде при требуемой концентрации. Вихревые колбы перемешать. В таблице 2 концентрации H 2 O 2и объемы концентрированной H 2 O 2, чтобы добавить. Эти значения основаны на 100 мл агара LB.
    3. Налейте пластин сразу после добавления Н 2 О 2 и пламя поверхность, чтобы удалить пузырьки. Выход 4 пластин в 100 мл LB-агар. Отметить пластины с концентрацией Н 2 О 2.
    4. Место пластин выявленные в капюшоне биологических потока с вентилятора, работающего в течение 30 мин, чтобы удалить лишнюю влагу из пластин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пластины В этот же день готовы. Несоблюдение этого требования может привести к несогласованности данных.
      Примечание: Окислительные стресс-такие как паракват может быть заменен на H 2 O 2 в этом анализе. Концентрации, используемые для других окислительных стрессовых может отличаться от тех, которые используются для H 2 O 2.
  3. Вымойте и измерить OD 600 из ночных культур, как описано в шаге 3.7.
  4. Нормализовать ОП 600 всего ночь у.е.ltures к низкой стоимости для набора штаммов проходят испытания. П. палочки обычно имеет OD 600 приблизительно 2,5 при выращивали в течение ночи в LB + NTBC или LB + ДМСО.
    1. Определить объем культуры, необходимой для разбавления культуры к низкой OD 600 в общем объеме 1 мл. Например, если культура имеет OD 600 из 3 и самое низкое OD 600 для множества штаммов 2,5, выполнить следующий расчет: (2.5) (1 мл) = (3) (х). х = 0,833 мл. 0,833 мл культуры будут размещены в пробирке.
    2. Рассчитать количество LB + NTBC (300 мкМ) или ДМСО LB +, необходимого для доведения объема культуры до 1 мл. Для примера, на этапе 4.4.1, количество LB + NTBC или LB + ДМСО добавляли к культуре будет 0,167 мл (1 мл общий объем - 0,833 мл культуральной). Сделать исходные растворы LB + NTBC и LB + ДМСО использовать для этих разведений на основе объема, необходимого для разбавления все штаммы.
    3. Смешайте культуру и LB + NTBC или LB + ДМСО встряхиванием.
  5. Для поддержания культуры в постоянной концентрации NTBC или ДМСО, выполните десять раз серийные разведения нормированных ночных культур в PBS + NTBC или PBS + ДМСО.
    1. Сделать акции решения PBS + NTBC и PBS + ДМСО. Для одного набора разведений для одного штамма, смешайте 300 мкм NTBC или эквивалентный объем ДМСО с получением PBS, чтобы общий объем 720 мкл. Масштаб этих запасов вверх или вниз в зависимости от того, сколько штаммы испытываются.
    2. Этикетка микроцентрифужную трубы для 10 -1 через 10 -7 разведений. Серийными Добавить 90 мкл PBS + NTBC или PBS + ДМСО в соответствующие пробирки. Используйте PBS + NTBC для штаммов, выращенных в LB + NTBC и использовать PBS + ДМСО для штаммов, выращенных в LB + ДМСО.
    3. Добавить 10 мкл культуры к соответствующему 10 -1 разведения трубки. Смешайте встряхиванием и передачи 10 мкл разведения 10 -1 до 10 -2 разбавления трубки. Повторяйте, пока все разведения не было Перфоrmed. Изменить пипетки советы между разведениями.
  6. Местная 5 мкл 10 -3 до 10 -7 разведения на LB + H 2 O 2 в двух экземплярах пластин для каждого штамма. Используйте кончик пипетки одну если пятна высевают из самых разбавить до наименьшего разбавленной (10 -7 до 10 -3). Не наклоняйте или наклонить тарелку, пока жидкость не высохнет в тарелку.
  7. Инкубируйте пластин в течение 24-48 ч при 37 ° С (воздух) инкубатора, в зависимости от штамма.
    ПРИМЕЧАНИЕ: П. палочки PAO1 будет иметь хорошие размера колонии на LB после 24 часов инкубации. Выдержите штаммов, пока они не колониям примерно тот же размер, как PAO1.
  8. Сфотографировать пластины, используя ПЗС-камеры над transluminator. При желании, редактировать фотографии для контраста и культуры на того же размера. Подсчитайте количество колоний в каждом месте, чтобы определить изменения в чувствительности к окислительному стрессу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

NTBC титрования

Титрования NTBC были использованы для определения, если NTBC смог сократить производство pyomelanin в P. палочки, а также определить концентрацию NTBC, что исключает или снижает pyomelanin продукцию для использования в дополнительных анализов. Там может быть изменения в уровнях производства pyomelanin в различных повторений, но общие тенденции остаются неизменными. NTBC титрования анализ также может быть изменен, чтобы проверить другие соединения, которые мо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метод титрования NTBC, описанный в данном протоколе, позволит пользователю определить, может ли NTBC снизить или устранить выработку пиомеланина у бактерий, а также определить требуемую концентрацию NTBC. Наиболее важным этапом в анализе титрования NTBC является определение диапазона концентраций NTBC для использования в анализе. Различные штаммы P. aeruginosa имеют различную чувствительность к NTBC, и лабораторные штаммы могут быть более чувствительны к NTBC, чем клинические изоляты12 (рис. 2...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы благодарят Дару Франк и Кэрри Харвуд за их щедрый вклад в сорта. Исследовательский фонд Университета Висконсина в Милуоки имеет патент No 8 354 451; с заявлениями, направленными на лечение или ингибирование прогрессирования инфекции микроорганизма у пациента путем введения соединения, ингибирующего 4-гидроксифенилпируватдиоксигеназу, такого как 2-[2-нитро-4-(трифторметил)бензоил]-1,3-циклогександион (NTBC). Изобретателями являются Грэм Моран и Панг Хе. Это исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения (R00-GM083147). Библиотека транспозонов P. aeruginosa Вашингтонского университета поддерживается NIH P30 DK089507.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-[2-нитро-4-(трифторметил)бензоил]-1,3-циклогександион (NTBC)Сигма-ОлдричSML0269-50 мгТакже называется нитизиноном. Растворим в ДМСО.
H2O2Sigma-Aldrich216763-100ML30 мас.% H2O.  Стабильный.
ГентамицинГолд BioG-400-100Растворимый в H2O.  Фильтр простерилизовать.
КанамицинFisher ScientificBP906-5растворим в H2O.  Фильтр простерилизовать.
ТобрамицинSigma-AldrichT4014-100MGрастворим в H2O.  Фильтр простерилизовать.

Ссылки

  1. Rodriguez-Rojas, A., et al. Inactivation of the hmgA of Pseudomonas aeruginosa to pyomelanin hyperproduction, stress resistance and increased persistence in chronic lung infection. Microbiology. 155, 1050-1057 (2009).
  2. Keith, K. E., Killip, L., He, P., Moran, G. R., Valvano, M. A. Burkholderia cenocepacia Produces a Pigment with Antioxidant Properties Using a Homogentisate Intermediate. J Bacteriol. 189, 9057-9065 (2007).
  3. Schmaler-Ripcke, J., et al. Production of Pyomelanin, a Second Type of Melanin, via the Tyrosine Degradation Pathway in Aspergillus fumigatus. Appl Environ Microbiol. 75, 493-503 (2009).
  4. Turick, C. E., Knox, A. S., Becnel, J. M., Ekechukwu, A. A., Milliken, C. E. Properties and Function of Pyomelanin. Biopolymers In Tech. Elnashar, M. , 449-472 (2010).
  5. Bridelli, M. G., Ciati, A., Crippa, P. R. Binding of chemicals to melanins re-examined: adsorption of some drugs to the surface of melanin particles. Biophys Chem. 119, 137-145 (2006).
  6. Barza, M., Baum, J., Kane, A. Inhibition of antibiotic activity in vitro by synthetic melanin. Antimicrob Agents Chemother. 10, 569-570 (1976).
  7. Nosanchuk, J. D., Casadevall, A. Impact of Melanin on Microbial Virulence and Clinical Resistance to Antimicrobial Compounds. Antimicrob Agents Chemother. 50, 3519-3528 (2006).
  8. Arias-Barrau, E., et al. The Homogentisate Pathway: a Central Catabolic Pathway Involved in the Degradation of L-Phenylalanine, L-Tyrosine, and 3-Hydroxyphenylacetate in Pseudomonas putida. J Bacteriol. 186, 5062-5077 (2004).
  9. Ernst, R. K., et al. Genome mosaicism is conserved but not unique in Pseudomonas aeruginosa from the airways of young children with cystic fibrosis. Environ Microbiol. 5, 1341-1349 (2003).
  10. Sanchez-Amat, A., Ruzafa, C., Solano, F. Comparative tyrosine degradation in Vibrio cholerae The strain ATCC 14035 as a prokaryotic melanogenic model of homogentisate-releasing cell. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 119, 557-562 (1998).
  11. Hunter, R. C., Newman, D. K. A Putative ABC Transporter, HatABCDE, Is among Molecular Determinants of Pyomelanin Production in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 192, 5962-5971 (2010).
  12. Ketelboeter, L. M., Potharla, V. Y., Bardy, S. L. NTBC treatment of the pyomelanogenic Pseudomonas aeruginosa isolate PA1111 inhibits pigment production and increases sensitivity to oxidative stress. Curr Microbiol. 69, 343-348 (2014).
  13. Kavana, M., Moran, G. R. Interaction of (4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase with the Specific Inhibitor 2-[2-Nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione. Biochemistry. 42, 10238-10245 (2003).
  14. Andrews, J. M. Determination of minimum inhibitory concentrations. J Antimicrob Chemother. 48, 5-16 (2001).
  15. Nikodinovic-Runic, J., Martin, L. B., Babu, R., Blau, W., O'Connor, K. E. Characterization of melanin-overproducing transposon mutants of Pseudomonas putida F6. FEMS Microbiol Lett. 298, 174-183 (2009).
  16. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , 3 edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  17. Roy-Burman, A., et al. Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections. J Infect Dis. 183, 1767-1774 (2001).
  18. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 14339-14344 (2003).
  19. Youngchim, S., Pornsuwan, S., Nosanchuk, J. D., Dankai, W., Vanittanakom, N. Melanogenesis in dermatophyte species in vitro during infection. Microbiology. 157, 2348-2356 (2011).
  20. Khajo, A., et al. Protection of Melanized Cryptococcus neoformans Lethal Dose Gamma Irradiation Involves Changes in Melanin's Chemical Structure and Paramagnetism. PLoS ONE. 6, e25092(2011).
  21. Hancock, R. E. W. Hancock Laboratory Methods. , University of British Columbia, Department of Microbiology and Immunology. British Columbia, Canada. Available from: http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

NTBCPseudomonas aeruginosa

Похожие статьи