Протокол трехмерной конфокальной морфометрического анализа астроцитов

Summary

Астроциты в ЦНС изменяют свои функциональные и структурные свойства в ответ на вредные раздражители. В данном отчете представлен протокол оценки морфологии трехмерных астроцитов при заболеваниях или после терапевтических вмешательств.

Abstract

В глиальных клеток в головном мозге, астроциты имеют различные функциональные роли в центральной нервной системе. В присутствии вредных раздражителей, астроциты изменять их функциональные и структурные свойства, состояние называется реактивной астроглиоз. Здесь протокол для оценки морфологических свойств астроцитов представлена. Этот протокол включает в себя количественную оценку 12 различных параметров, т.е. площади поверхности и объема ткани, покрытой астроцитов (астроцитов территории), всего астроцитов в том числе филиалов, теле клетки и ядра, а также общую длину и количество ветвей, интенсивность флуоресценции иммунореактивности антител, используемых для обнаружения астроцитов, и астроцитов плотности (номер / 1000 мкм ^2). Для этого были созданы трехмерные (3D) изображения конфокальной микроскопии, и программное обеспечение для анализа 3D-изображения, такие как был использован Volocity 6.3 для измерений. Крыса ткани мозга подвергается бета-амилоида _1-40 1-40) с или без терапевтического вмешательства была использована, чтобы представить способ. Этот протокол также может быть использован для анализа 3D морфометрического других клеток из или в естественных условиях или в пробирке условий.

Introduction

В здоровом центральной нервной системы (ЦНС), астроциты играют важную роль в регуляции кровотока, обмена веществ, энергии синаптической функции и пластичности, и внеклеточной иона и нейромедиатор гомеостаза ^1-3. Кроме того, астроциты реагируют на различные стимулы и вредных аномальных условиях, таких как травма, инфекция, ишемии или нейродегенерации через реактивной астроглиоза которая характеризуется гипертрофией, пролиферации и функционального ремоделирования астроцитов ^4,5.

Реактивный астроглиоз может разработать воспалительную реакцию и процесс ремонта в ткани и, следовательно, могут влиять на клинические результ....

Protocol

Это исследование было проведено в соответствии с политикой, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных (NIH), утвержденных Этического комитета Ирана университета медицинских наук (Тегеран, Иран) по.

1. Животные, хирургия и Образцы Препараты

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка ткани мозга для 3D конфокальной микроскопического анализа.

1. Разделить животных случайным образом на две группы: A & beta; _1-40 -injection (N = 8), и A & beta; _1-40 -injection с лечением генистеин (N = 8); управлять генистеин (10 мг / кг разбавленного в носителем, таким как полиэтоксилирован....

Results

В этом разделе представлены некоторые примеры качественных и количественных наблюдений, произведенных 3D анализа морфометрического. Для полных результатов всех 12 упомянутых ранее параметров, пожалуйста, посетите наш предыдущей публикации ^10.

Качественные наблюдения

Астроциты выставлены тонкие ветви или толстые, что, как правило, долго в Ар _1-40 вводили крысам (Рисунок 1). Несколько небольших звездчатые астроциты в форме с к.......

Discussion

В текущем протоколе, мы использовали 3D конфокальной морфометрии оценить 12 различных параметров, которые были связаны с астроцитов морфологии. Для этой цели гиппокампа ткани крыс с A & beta; _{1-40 -} были использованы индуцированного астроглиоза, с или без предварительной обработки генистеин качестве противовоспалительного агента. С помощью 3D-изображений и морфометрического программное обеспечение, мы смогли показать влияние генистеина на астроглиоза т.е. морфологии астроцитов.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Амилоид бета 1-40	Сигма Олдрич	79793	Держать в -70 ° C
Genistein	Sigma Aldrich	446-72-0	держать в -20 ° C
поликолональные антитела кролика против глиального фибриллярного кислого белка	DAKO	Z0334
щелочной фосфат-конъюгированный свиной анти-кроличьи антитела IgG	DAKO
жидкий постоянный постоянный хромоген	DAKO	K0640
жидкий постоянный красный субстрат	буфер DAKO	K0640
Cremophor EL	Sigma Aldrich	27963	Полиэтоксилированное касторовое масло - Шаг 1.1
LSM 700 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия	Carl Zeiss
Volocity 6.3	Perkin Elmer Inc.,
Анализ изображений 2000	Tekno Оптический
стреотаксический аппарат	Stoelting
Graph pad Prism 5	Graph pad software Inc.