Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Протокол трехмерной конфокальной морфометрического анализа астроцитов

8.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53113

⸱

11 декабря 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical and Experimental Medicine, Linköping University, 2Neurophysiology Research Center, Shahed University, 3Cellular and Molecular Research Center, Iran University of Medical Sciences, 4School of Advanced Technologies in Medicine, Iran University of Medical Sciences

В этой статье

Краткое содержание

Астроциты в ЦНС изменяют свои функциональные и структурные свойства в ответ на вредные раздражители. В данном отчете представлен протокол оценки морфологии трехмерных астроцитов при заболеваниях или после терапевтических вмешательств.

Аннотация

В глиальных клеток в головном мозге, астроциты имеют различные функциональные роли в центральной нервной системе. В присутствии вредных раздражителей, астроциты изменять их функциональные и структурные свойства, состояние называется реактивной астроглиоз. Здесь протокол для оценки морфологических свойств астроцитов представлена. Этот протокол включает в себя количественную оценку 12 различных параметров, т.е. площади поверхности и объема ткани, покрытой астроцитов (астроцитов территории), всего астроцитов в том числе филиалов, теле клетки и ядра, а также общую длину и количество ветвей, интенсивность флуоресценции иммунореактивности антител, используемых для обнаружения астроцитов, и астроцитов плотности (номер / 1000 мкм 2). Для этого были созданы трехмерные (3D) изображения конфокальной микроскопии, и программное обеспечение для анализа 3D-изображения, такие как был использован Volocity 6.3 для измерений. Крыса ткани мозга подвергается бета-амилоида 1-40 1-40) с или без терапевтического вмешательства была использована, чтобы представить способ. Этот протокол также может быть использован для анализа 3D морфометрического других клеток из или в естественных условиях или в пробирке условий.

Введение

В здоровом центральной нервной системы (ЦНС), астроциты играют важную роль в регуляции кровотока, обмена веществ, энергии синаптической функции и пластичности, и внеклеточной иона и нейромедиатор гомеостаза 1-3. Кроме того, астроциты реагируют на различные стимулы и вредных аномальных условиях, таких как травма, инфекция, ишемии или нейродегенерации через реактивной астроглиоза которая характеризуется гипертрофией, пролиферации и функционального ремоделирования астроцитов 4,5.

Реактивный астроглиоз может разработать воспалительную реакцию и процесс ремонта в ткани и, следовательно, могут влиять на клинические результаты терапевтического вмешательства. Соответственно, астроциты получили внимание от невролога в течение последних десятилетий в качестве потенциальных мишеней для терапевтических вмешательств для различных заболеваний, влияющих на ЦНС.

Астроциты, как правило, имеют форму севрюга с хорошо дefined ветви, которые распространились по всему сомы 6. В болезненном состоянии в головном мозге, астроцитов ветвей становится запутанным и показать опухшие концы 7, например, в присутствии бета-амилоида (Ар).

Данная статья представляет собой протокол для анализа 3D изображения астроцитов, полученных с помощью конфокальной микроскопии. Были измерены Двенадцать различных количественных параметров для каждого астроцитов: участки поверхности и объемы территории астроцитов (ткани, покрытой с помощью астроцитов), вся клеток (в том числе филиалы), клетки тела, и ядра; общая длина и количество ветвей; интенсивность флуоресценции антител, используемых для обнаружения астроцитов; а плотность астроцитов (номер / 1000 мкм 2). Для этого мы использовали срезы головного мозга у крыс, подвергшихся intrahippocampal инъекции А 1-40 с или без лечения генистеин как противовоспалительное вещество. Описанный протокол может быть использован для морфометрического ANalysis различных типов клеток в пробирке или в естественных условиях в различных условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Это исследование было проведено в соответствии с политикой, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных (NIH), утвержденных Этического комитета Ирана университета медицинских наук (Тегеран, Иран) по.

1. Животные, хирургия и Образцы Препараты

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка ткани мозга для 3D конфокальной микроскопического анализа.

  1. Разделить животных случайным образом на две группы: A & beta; 1-40 -injection (N = 8), и A & beta; 1-40 -injection с лечением генистеин (N = 8); управлять генистеин (10 мг / кг разбавленного в носителем, таким как полиэтоксилированное касторовое масло) через желудочный зонд 1 ч до операции.
  2. Обезболить животных кетамином (100 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг). Подтвердите правильное анестезии отсутствием вывода рефлекса после щипать палец. Используйте мазь на глаза во время операции, чтобы предотвратить сухость.
  3. Поместите животных в стереотаксической аппарата и бритья головы. Применить НОРРешение ине для очистки кожи головы перед разрезом и сохранить в месте эксплуатации стерильной во время операции, чтобы уменьшить риск инфекции. Вводите A & beta 1-40 стереотаксически (4 мкл) в гиппокампе в -3.5 мм кзади от темени, ± 2 мм латеральнее средней линии, и -2.8 мм ниже твердой мозговой оболочки, в соответствии с мозга крысы атласа 8. Для стереотаксической метода см предыдущую публикацию 9.
  4. Послеоперационного наблюдения / ухода, пока животные не в полной мере осознают, чтобы обеспечить комфорт животных. Держите животных теплая во время восстановления, и не возвращаюсь их в клетку с другими животными до полного выздоровления. Обратите внимание на любой признак инфекции у животных после операции.
  5. Обезболить животных глубоко кетамином (150 мг / кг) через три недели после операции. Выполните transcardial фиксацию путем перфузии животных с 0,9% физиологического раствора с последующим 4% параформальдегида в 0,1 М PBS (рН = 7,4), а затем удалить и исправить мозг, как описано в 10 </ SUP>.
  6. После исправить мозги в 4% параформальдегида в течение 2-3 дней при температуре 4 ° C.
  7. Вставить ткани в парафиновых блоков с использованием ткани вложение оборудования и избежать недозаполнения или более заполнения кассеты, так как это может помешать правильной выравнивания или срезов. Обратите внимание на ориентацию ткани в парафин блока.
    Примечание: гиппокампе крыс, например, близка к задней части полушария. Таким образом, ткань должна быть встроена таким образом, что секционирования начинается в задней части мозга. Используйте Paxinos атлас 8 в качестве руководства для достижения желаемого анатомическое строение.
  8. Поместите микротом от сквозняков или дверных проемов, так как движения воздуха сделать обработку участков сложных.
  9. Используйте разделы с толщиной ≥20 мкм, как эта глубина с необходимо производить Z-Stack изображения полных астроцитов. Не используйте первые пару разделов, так как они могут иметь нежелательные толщину из-за теплового еXpansion.
  10. Поместите секции на поверхности теплой водой (5 ± 2 ° С ниже температуры плавления парафина для) достаточно долго, чтобы сгладить разделов.
    Примечание: В течение расширение участка может нарушить морфологию структуры. Используйте маленькую кисть, чтобы тщательно передачи разделов. Соберите два-три секции на каждом слайде.
  11. Храните слайды в стойку в вертикальном положении и дайте им высохнуть при 37 ° С в течение нескольких часов или O / N.

2. Иммуногистохимия

  1. Deparaffinize разделы ксилола, 2 х 10 мин, и увлажняет через градиента алкоголя (99,8%, 95% и 70%, 10 мин каждый) и PBS.
  2. Инкубируйте с антителами против глиальных фибриллярного кислого белка (GFAP), разведенным 1: 1500 в PBS, содержащий 0,25% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 0,25% Triton X-100 и 3,5% нормальной сыворотки (O / N при 4 ° С).
  3. Вымойте разделы в PBS в течение от 3 х 5 мин.
  4. Выдержите со средним щелочной фосфата-сопряженных antibodieс в течение 1 часа (1: 100, 21 ° С, разбавляли в PBS).
  5. Вымойте секций в PBS в течение от 3 х 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы вымыть разделы должным образом после вторичных антител к минимуму фоновое окрашивание.
  6. Выдержите разделы в темноте с жидким Постоянного Красной хромогена (15-20 мин). Примечание: Приготовьте раствор не более чем на 30 мин перед использованием.
  7. Вымойте разделы в PBS в течение от 3 х 5 мин.
  8. Наконец, окрашивает ядра с 4-6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI; 1: 500, разбавленный в PBS) до покрытия-скольжения. Хранить слайды в холодильник 24-48 ч перед микроскопией.

3. конфокальной микроскопии

ПРИМЕЧАНИЕ: Для количественной оценки (см ниже), выберите астроцитов с ясно видимой DAPI окрашенных ядра с минимальной перекрытия ветви, чтобы уменьшить риск ошибок. Производство изображений Z-Stack является трудоемким. Будьте терпеливы и не останавливаются во время обработки. Вертикальный конфокальной лазерной сканирующей микроскоп UСЭД для создания 3D-изображения с астроцитов.

  1. Положите слайд на микроскопа стадии, и выберите цель 63x.
  2. Откройте программное обеспечение визуализации и нажмите системы Start. Щелкните на вкладке Locate. Перейти к Связать и выберите GFP настроить нужную свет.
  3. Откройте затвор, чтобы отражать свет. Найти рефлектора Revolver на правой стороне затвора и выберите цвет, который должен быть отражен астроцитами (зеленый, красный или фиолетовый); красный цвет (FSet20 WF) здесь был использован.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте сосредоточиться картину непосредственно в окуляр микроскопа.
  4. Чтобы найти лучший фокус, нажмите на все закрыты, поставить микроскоп штифт в режиме, и нажмите на вкладку Измерение.
  5. Нажмите на смарт-установки на вкладке приобретения; открывает окно. Выберите нужный флюорофор (т.е. DAPI и Alexa Fluor 555, в текущем проекте) из списка. Цвет выбирается автоматически.
  6. Нажмите на лучший сигнал, и Применить, а затем нажмите на Установить экспозицию; компьютер будет автоматически установить параметры экспозиции.
  7. Для оптимизации изображения, перейдите к окну каналов. Снять Track2, выделите Track1 и нажмите на Живом. Сфокусируйтесь на изображении, если это необходимо.
  8. В окне каналов настроить следующие ключи; нажмите на 1AU автоматически оптимизировать крошечное отверстие. Это очень важно сделать этот шаг иначе конфокальные изображения будет неоптимальным. Отрегулируйте усиление, чтобы иметь лучший интенсивность (сохранить этот параметр ниже 800, чтобы уменьшить дополнительный шум). Наконец, установите цифрового усиления между 2 и 3.
  9. Снять Track1, нажмите на дорожки2 и повторите шаг 3,8 для дорожки2. Тогда не жить.
  10. Перейти к окну Mode Приобретение. Улучшение имиджа за счет оптимизации размера рамки и усреднения. Для того, чтобы изменить размер кадра, чтобы перейти X * Y и выберите 1024 х 1024. Выберите медленную скорость, чтобы создать лучшее изображение.
  11. Перейти к усреднению и выберите номер ≥4. Это значение усреднение указывает на количество просмотров, которые будут усреднены для Producе полученное изображение. Теперь нажмите на кнопку оснастки и сохранить захваченное изображение 2D.
  12. Для 3D визуализации, отметьте пункт Z-Stack под смарт-Setup вызывает окно Z-Stack, чтобы открыть.
  13. Установите первую и последнюю позиции для Z-Stack, то есть на глубину ячейки. Сначала щелкните на Живом. Затем используйте фокусировки диск микроскопа, чтобы сосредоточиться на самой верхней позиции астроцитов в ткани, где Z-Stack является, чтобы начать. Нажмите на Set First. Затем фокус вплоть до самого низкого положения астроцитов в ткани, где Z-сканирования Стек должна быть прекращена. Нажмите на Set Last. Тогда не жить.
  14. Выберите интервал; 1,01 мкм используется в данном исследовании; Выбирая интервал может быть сделано путем нажатия на Optimal, чтобы установить количество срезов.
  15. Нажмите кнопку Пуск эксперимента. Сохранение изображений, как только сканирование завершено. Это изображение будет использоваться для измерения следующих параметров: площади поверхности и объема территории астроцитов, вся астроцитов в том числе бюстгальтерnches, тело клетки, и ядро.
  16. Приобретать 2D-изображения, используя 10X 20X или цель, как описано в шагах 3.6-3.11. Это изображение может использоваться для измерения интенсивности флуоресценции иммунореактивности антител и плотности астроцитов (число / 1000 мкм 2).

4. астроцитов плотность и GFAP + Интенсивность флуоресценции

  1. Откройте 20X 2D-изображения. Нажмите на Histo (Hisogram) на левой стороне окна изображения.
  2. Для расчета плотности астроцитов, выбрать три последовательных полей зрения под 20-кратным цели. Подсчитайте количество астроцитов, которые демонстрируют четкое сому с минимумом, перекрытия филиалы в областях.
  3. Для количественной оценки интенсивности флуоресценции, выберите подходящий инструмент (прямоугольник или круг) на сноске окна изображения, и выбрать область для измерения. Обратите внимание, что среднее значение и стандартное отклонение появляется автоматически в соответствии с изображением. В текущем исследовании, 0,7 мм 2 прямоугольная область между улбыл использован iatum и медиальная лопасть зубчатой ​​извилине.

5. астроцитов Отрасли

  1. Для количественной оценки длины и общее количество филиалов, использовать 3D-изображения (приобретенные с 20X) в программном обеспечении анализа изображения. Нарисуйте линию вручную по длине каждой ветви выбранного астроцитов. Затем выберите инструмент измерения-что специализируется для измерения длины линии. Для того, чтобы определить число филиалов, выберите кол-инструмент для подсчета количества памятке.

6. Объем и площадь поверхности

ПРИМЕЧАНИЕ: Маркировка структуру вручную в программном обеспечении 3D анализа изображений требует внимания и подготовки. Практика несколько раз, прежде чем начать эксперимент.

  1. Для количественной оценки объема и площади поверхности астроцитов ядра, сомы, тела клетки и территории, передать 3D изображения (приобретенные в шагах 3.1-3.16) в 3D программного обеспечения для анализа изображений, таких как Volocity 6.1.
  2. Откройте программное обеспечение и создать новыйбиблиотека. Перетащите все изображения в левой серой колонки в новой библиотеке. Затем выберите один 3D-изображение. Справа, есть различные каналы с различными цветами. Включите одного канала, представляющего интерес; Например синий канал для DAPI при измерении ядро. Изменение яркости вручную, чтобы получить оптимальный контраст.
  3. Выберите в меню Сервис, перейдите сделать громкость и производить один 3D-изображение из изображений Z-стека. Нажмите кнопку Свойства в меню Правка и быть уверенным, что X, Y и Z представлены свойства; в противном случае это невозможно осуществить анализ 3D.
  4. Нажмите на иконку Freehand РИО инструмента на панели инструментов. Для измерения объемной и поверхностной площадью астроцитов ядра нарисовать линию вокруг DAPI-меченого ядра.
  5. Для измерения громкости и площадь поверхности тела астроцитов клеток нарисовать линию вокруг сомы исключая отраслей.
  6. Для измерения громкости и площадь поверхности всей астроцитов (клеток тела в том числе филиалы) нарисовать линию вокруг сомы, следующий заПоверхность всех отраслях.
  7. Для оценки громкости и площадь поверхности территории астроцитов нарисовать линию между кончиками ветвей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нажмите Удалить на клавиатуре, чтобы стереть ненужные рисунки.
  8. Нажмите на меню Измерения в верхней части окна изображения, чтобы создать протокол измерения; открывает окно, содержащее различные инструменты.
  9. Перетащите Найти объекты в верхней части окна (панели). Описательное имя для населения 1, выберите соответствующий цвет и нажмите на измерения. Откроется другое окно.
  10. Выберите параметр, т.е., объем или площадь поверхности. Нажмите на кнопку OK. Данные появятся в таблице.
  11. Чтобы сохранить данные нажмите на меню измерения и выберите Сделать измерения пункт.
  12. Выберите новый пункт измерения вызывается из открывшемся окне. Затем дать имя данных и нажмите кнопку ОК.
  13. Наконец, экспортировать данные в статистике программ, таких как графика панели или преуспеть программу. Используйте Т-тест для анализа данных, затем построить 2D грАФС.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом разделе представлены некоторые примеры качественных и количественных наблюдений, произведенных 3D анализа морфометрического. Для полных результатов всех 12 упомянутых ранее параметров, пожалуйста, посетите наш предыдущей публикации 10.

Качественные наблюдения

Астроциты выставлены тонкие ветви или толстые, что, как правило, долго в Ар 1-40 вводили крысам (Рисунок 1). Несколько небольших звездчатые астроциты в форме с к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В текущем протоколе, мы использовали 3D конфокальной морфометрии оценить 12 различных параметров, которые были связаны с астроцитов морфологии. Для этой цели гиппокампа ткани крыс с A & beta; 1-40 - были использованы индуцированного астроглиоза, с или без предварительной обработки генистеин качестве противовоспалительного агента. С помощью 3D-изображений и морфометрического программное обеспечение, мы смогли показать влияние генистеина на астроглиоза т.е. морфологии астроцитов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Эта работа была поддержана грантами от Совета графства в Östergötland, (Швеция) и клеточной и молекулярной исследовательского центра в Иране университета медицинских наук (Тегеран, Иран).

Благодарности

Авторам нечего раскрыть.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Амилоид бета 1-40Сигма Олдрич79793Держать в -70 ° C
GenisteinSigma Aldrich446-72-0держать в -20 ° C
поликолональные антитела кролика против глиального фибриллярного кислого белкаDAKOZ0334
щелочной фосфат-конъюгированный свиной анти-кроличьи антитела IgGDAKO
жидкий постоянный постоянный хромогенDAKOK0640
жидкий постоянный красный субстратбуфер DAKOK0640
Cremophor ELSigma Aldrich27963Полиэтоксилированное касторовое масло - Шаг 1.1
LSM 700 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопияCarl Zeiss
Volocity 6.3Perkin Elmer Inc.,
Анализ изображений 2000Tekno Оптический
стреотаксический аппаратStoelting
Graph pad Prism 5Graph pad software Inc.

Ссылки

  1. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
  2. Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).
  3. Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).
  4. Pekny, M., Nilsson, M. Astrocyte activation and reactive gliosis. Glia. 50 (4), 427-434 (2005).
  5. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
  6. Anderova, M., et al. Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).
  7. Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).
  8. Paxinos, G., Watson, C. A stereotaxic atlas of the rat brain. , Academic. New York. (1998).
  9. Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat. J Vis Exp. (65), e4079(2012).
  10. Bagheri, M., et al. Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study. PloS One. 8 (10), e76526(2013).
  11. Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices. J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).
  12. Kulkarni, P. M., et al. Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images. J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).
  13. Wagner, D. C., et al. Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury. Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

3DVolocityGFAP
Протокол трехмерной конфокальной морфометрического анализа астроцитов
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.