Методическая статья

Метку без Методика пространственно-временных изображений из одной клетки секрета

DOI:

10.3791/53120

⸱

23 ноября 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1Materials Science and Technology, Naval Research Laboratory, 2Center for Bio/Molecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inter-сотовой связи является критическим для управления различными физиологические активности внутри и за пределами клетки. Эта статья описывает протокол для измерения пространственно-временную природу отдельных выделений клеток. Для достижения этой цели, междисциплинарный подход используется, которая объединяет без наклеек наноплазмонике зондирования с изображений живых клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Межклеточная связь является неотъемлемой частью сложной системы, которая помогает в поддержании основных клеточных функций. В результате сбой в работе такой сигнализации может привести ко многим нарушениям. Чтобы понять передачу сигналов от клетки к клетке, важно изучить пространственную и временную природу секретируемых молекул из клетки, не нарушая местную окружающую среду. Для изучения секреции белка были разработаны различные анализы, однако эти методы, как правило, основаны на флуоресцентных зондах, которые нарушают соответствующие сигнальные пути. Чтобы преодолеть это ограничение, требуется техника без этикеток.

В этой статье мы описываем создание и применение технологии локализованной плазмонной резонансной томографии поверхности (LSPRi) без меток, способной обнаруживать белковые выделения из одной клетки. Плазмонные наноструктуры литографически наносятся на стандартную стеклянную защитную крышку и могут возбуждаться с помощью видимого света на коммерчески доступных световых микроскопах. Наноструктурами покрыта лишь небольшая часть покровного стекла, и поэтому этот метод хорошо подходит для комбинирования распространенных методов, таких как флуоресцентная и светопольная визуализация.

В этом протоколе используется междисциплинарный подход, который включает в себя нанопроизводство сенсора и последующую биофункционализацию, характеристику кинетики связывания лиганда и аналита, интеграцию чипа и живых клеток, а также анализ измеренного сигнала. В целом, эта технология позволяет использовать общий подход без меток к картированию клеточных секреций и корреляции их с реакциями близлежащих клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Интер-сотовой связи имеет решающее значение для регулирования многих физиологических деятельности внутри и вне клетки. Разнообразие белков и пузырьков может быть секретируется, которые впоследствии вызывают сложные клеточные процессы, такие как дифференциации, заживления ран, иммунного ответа, миграции и пролиферации. 1-5 Неисправности межклеточных сигнальных путей были вовлечены в многочисленных расстройств, включая рак, атеросклероз и диабет, чтобы назвать несколько.

Оптимальное клеток секреции анализа должен быть способен в пространстве и времени отображения секретируемый белок, представляющий интерес, не нарушая соответствующие сигнальные пути. Таким образом, причинно-следственные связи между концентрацией профилей и ответа принимающих клеток может быть выведено. К сожалению, многие из наиболее часто используемых флуоресцентных основе методов не отвечают этим критериям. Флуоресцентные слитые белки могут быть использованы, чтобы пометить аналит Within клетку, но могут нарушить секреторный путь, или если секретируемый, приводит к диффузного свечения вне клетки, которые трудно оценить количественно. Флуоресцентные immunosandwich основе анализы наиболее часто используемые методы для обнаружения клеточных выделений, но как правило, требуют изоляции отдельных клеток. 6-11 Кроме того, введение чувствительного антитела, как правило, останавливается или заканчивает эксперимент и размер этикетки антител, 150 кДа IgG, является препятствием для передачи сигнала.

Из-за этих блок-постов, предпочтительно, чтобы методика этикетки свободной быть использованы для белковых изображения выделений и среди существующих меток, свободных технологий поверхностного плазмонного резонанса (SPR) и локализованы поверхностного плазмонного резонанса (LSPR) датчики являются превосходными кандидатами. 12-17 Это Датчики были широко используется для исследования связывания аналита белков, экзосомы и других биомаркеров. 18-24 В случае LSPR, плазмонного nanostructures можно рисунком литографически на покровные стекла и возбуждается с помощью видимого света с помощью стандартных конфигураций микроскопии широко местах. Из-за их наноразмерных след, большинство стеклянной подложке доступна общих методов визуализации, таких как светлого поля и флуоресцентной микроскопии делает эти зонды хорошо подходит для интеграции с живых клеток микроскопии. 25-28 Мы показали измерения в реальном времени антител из гибридом выделениями клеток с использованием функционализированного золотые плазмонных наноструктур с пространственными и временными решениями 225 мс и 10 мкм, соответственно. Базовая конфигурация чип показано на рисунке 1. 28 Путь Выход свет микроскопа разделить между ПЗС-камеры, используемой для съемки и волоконно-оптической сочетании спектрометра для количественного определения дробного заполнения данного массива наноструктур (рис 2 ).

Protocол представлены в этой статье описывает экспериментальную конструкцию для реального времени измерения одиночных клеток выделениями одновременно мониторинга реакцию клеток с использованием стандартного ярко-микроскопии. Мультидисциплинарная подход включает изготовление наноструктур, функционализации наноструктур для высоким сродством связывания аналитов, оптимизацию поверхности для как минимизации неспецифического связывания и характеризующей константы кинетической скорости с использованием коммерческого поверхностного плазмонного резонанса (SPR) инструмента, интеграции клеточных линий на подложку, и анализа изображений и спектральных данных. Мы ожидаем, эту технику, чтобы быть технологией для пространственно-временных карт сотовых выделениями и их причинно-следственных связей с получением клеток.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Изготовление наноструктур

  1. Выбрать диаметром 25 мм покровные стекла с толщиной около 170 мкм из (№ 1.5) в качестве субстратов для нанофабрикации.
  2. Погрузитесь покровные в пираньи решение (3: 1 соотношении серной кислоты и перекиси водорода) в течение не менее 6 ч. Вымойте пираньи, смоченную покровное с обильным количеством сверхчистых 18,2 МОм деионизированной дистиллированной воды (DDW).
    ВНИМАНИЕ: Пиранья кислоты бурно реагирует с органическими материалами и должны быть обработаны с особой тщательностью.
  3. Депозит 10 нм хрома тонкая пленка на покровные испарением электронным пучком, чтобы избежать последствий обязанности во время структурирования и визуализации наноструктур.
  4. Спин первый слой резиста бислой, состоящий из этиллактат метилметакрилата (MMA_EL6) сополимера при 2000 оборотов в минуту в течение 45 с, а затем выпекать при 150 ° С. Спин второй слой поли-метилметакрилата (950PMMA_A2) в 3000 оборотов в минуту в течение 45 с, то выпекать при 180 ° С.
  5. Стукп двухслойная противостоять с помощью электронно-лучевой литографии (EBL) на 25 кВ с площадью дозе 300 мкКл / см 2. Разработка в изопропиловом спирте (IPA) / метилизобутилкетон (МИБК): 2/1 и промыть в ИПС.
  6. Депозит Ti (5 нм) / Au (80 нм) пленки на подложке с использованием электронно-лучевой испаритель.
  7. После осаждения золота, поднимите сополимер бислой противостоять путем замачивания субстрата в ацетоне в течение 4 ч.
  8. Проверьте подложку с использованием сканирующего электронного микроскопа (SEM), чтобы подтвердить форму и размер наноструктуры, удалить остатки хрома от подложки с помощью влажного травления с использованием CR-7 травителя в течение 60 секунд при комнатной температуре, а затем промыть в DDW.
  9. Дизайн расстояние от центра до центра массива в 33 мкм, чтобы оставить место для клеток изображений между массивами. Шаблон наноструктуры в 20 х 20 шаблон для каждого массива с шагом 300 нм с использованием писателя электронной луча. Каждый чип содержит 300 массивов с типичной наноструктур измерении высоты 80 ± 2,5 нм и 70 нм ± 2,5 Diameтер.
  10. Проверка подмножество массивов с использованием атомно-силового микроскопа (АСМ) для проверки размера и однородности.
  11. Приложить опорное кольцо, обычно кремний, к задней части покровного стекла с помощью УФ-отверждения эпоксидной смолы.

2. Чип очистки и применение самоорганизующихся монослоя

  1. Для очистки и регенерации фишки, плазменный золы при мощности 40 Вт в 300 мТорр смеси 5% водорода, 95% аргона в течение 45 с после очистки камеры в течение 5 мин при тех же условиях.
  2. Функционализации золотых наноструктур сразу после плазменной озоления путем погружения в микросхему двухкомпонентной этанольного раствора тиола, состоящий из 3: отношение SH- 1 (СН 2) 8 -eg 3 -OH (СПО) и компонент либо амином или карбоксильную функциональную группу, а именно, SH- (СН 2) 11 -eg 3 -NH 2 (SPN) или SH- (СН 2) 11 -СООН -eg 3 (SPC).
  3. Оставьте Chip Мнеп тиольное решение O / N, чтобы сформировать самоорганизующуюся монослой (SAM).
  4. Промойте чип с этанолом и сухой с азотом.
  5. При необходимости хранить функционализированный чип до 2 недель при 4 ° С.
  6. Готовое реагировать SPN или SPC компонент с лигандом с использованием химии в зависимости от лиганда выбора (см. Ниже)
    Примечание: чипы можно регенерировать и повторно функционализирован десятки раз. Данный чип может быть использован для периодов, которые варьируются от 6 месяцев до более года. Спектры измерены на данном массиве надежно воспроизводятся после неоднократных регенерации по плазменной озоления с последующим biofunctionalization. 29

3. Поверхность Функционализация и Кинетическая характеристика

Примечание: Используйте функционализированную чип в коммерческом SPR инструмента охарактеризовать кинетические константы скорости между лигандом и анализируемым, а также для изучения сопротивления SAM неспецифической бinding. Существует широкий диапазон скоростей потока и микрофлюидных конструкций, которые позволяют для эффективного поверхности функционализации. Так как мы имеем в продаже SPR мы стандартизированы вокруг своих рекомендованные расхода. Отметим, что эти скорости потока характерно для всех СРП инструментов и так не являются ограничительными. ППР инструмент не является необходимостью, так как все функционализации может быть сделано непосредственно на чипе LSPR, но это сократить рабочую нагрузку, потому что это мультиплексный инструмент в то время как наша LSPR Микрожидкостных установки нет.

  1. Функционализировать коммерческий голый золотую фишку с SAM, как описано в разделе 2.
  2. При использовании на основе SPC SAM, активировать карбоксильную группу с 1: 1 смесью 133 мМ 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид (EDC) и 33 мМ N -hydroxysuccinimide (NHS) в DDW в течение 10 минимум
  3. Проспрягайте активированную карбоксильную группу с антителом / интересующего лиганда на 300 сек при скорости потока 30 мкл / мин. Подготовка лигандов врН 6 фосфатный буфер, как правило,, но это может варьироваться в зависимости от молекулы.
  4. После конъюгации лиганда, расход 0,1 М этаноламин в фосфатно-солевом буфере (PBS) в качестве шага деактиватора на 300 сек при скорости 30 мкл / мин. Этаноламин помогает свести к минимуму неспецифическое связывание.
  5. Представьте анализируемого вещества при скорости потока 100 мкл / мин с использованием диапазона концентраций и расчета кинетических констант скорости, используя программное обеспечение кинетический анализ.
  6. Если неспецифическое связывание проблематично, увеличить соотношение SPO в SPC или SPN.

4. LSPR Общие настройки

  1. Настройки Микроскоп:
    1. Используйте 100 Вт Галогенные лампы для освещения Келера образца. Используйте длинный фильтр (обычно 593 нм отсечки) на пути света, чтобы устранить длины волн, которые не вносят вклад в резонансной сдвига (рис 2).
    2. Для сбора данных LSPRi, использовать инвертированный микроскоп с 40х нефти immersioп цель (1,4 НС) и термоэлектрическим охлаждением 16 бит ПЗС-камеры.
    3. Поместите светоделитель на выходной порт микроскопа, чтобы получить снимки и спектры одновременно.
    4. Установите контролем температуры микроскопа этап до 37 ° C и уравновешивают в течение 4 ч.
    5. Включение дополнительного узла инкубации на микроскопе, чтобы регулировать концентрацию CO 2 и влажности на уровне 5% и 95%, соответственно.
  2. Подготовка Чип и монтаж:
    1. Функционализировать чип LSPR, как описано в разделе 2 с оптимальными двухкомпонентных SAM соотношениях, определяемых из СРП экспериментов.
    2. Загрузите чип в выполненного на заказ микрожидкостных держателя следующим образом. Поместите фишку на алюминиевой нижней части. Бутерброд чип между этой нижней части и силиконовой прокладкой и прозрачной пластиковой верхней части. Используйте 4 винта, чтобы зафиксировать узел.
    3. Для типичного SPC-приложение, тиол, капельный слой 300 мкл смеси 1: 1 смесира 133 мМ EDC и 33 мМ NHS в DDW, чтобы активировать карбоксильные группы компонента НПЦ тиольного.
    4. Подождите в течение 10 мин и вручную промыть поверхность 10 мМ PBS.
    5. Проспрягайте активированную карбоксильную группу с лигандом (обычно это антитело или фрагмент антитела), представляющие интерес по капли покрытия 300 мкл раствора лиганда.
    6. Подождите в течение 30 мин и вручную промыть 10 мМ PBS.
    7. Капельный слой 300 мкл 0,1 М этаноламина в PBS на чипе, чтобы минимизировать неспецифическое связывание. Подождите в течение 10 мин.
    8. Промыть этаноламин ФБР, содержащим 0,005% Tween 20 (PBS-T20).
    9. Поместите кусок кварца выше чипа, чтобы уменьшить колебания в данных, относящихся к меняющуюся мениска.
    10. Держите чип мокрый с PBS-T20 буфера при монтаже на микроскопе.
    11. Поместите чип сборки LSPR твердо в нагретой держателя образца этап и приложите микрожидкостных трубки.
    12. Прикрепите Microfluidics шланги к сборке и бу потокаffer (или сыворотки свободных средств массовой информации для сотовых исследований) до стационарного состояния достигается.
    13. Дайте сборки и микроскоп для уравновешивания в течение, по меньшей мере 2 ч.
    14. Совместите чип, используя джойстик так, чтобы центральная массив в соответствие с волоконно-оптической спектроскопии. Спектроскопические данные берутся с помощью спектрометра и программное обеспечение спектрального анализа.
    15. Держите массивы в фокусе в течение всего эксперимента с помощью программного обеспечения автофокус, Zeiss выдержка Фокус или эквивалентную автофокусом устройство.

5. LSPR изображений анти-с-Мус выделениями из 9Е10 клеток гибридомы

Примечание: Линия клеток гибридомы использовали для этого исследования выражают анти-с-Myc антитела конститутивно и, следовательно, не требуют химической триггер

  1. Функционализировать наноструктур с с-Мус пептида. Это имеет значение K D 1,77 нм для анти-с-Myc антител, секретируемых клон 9Е10 клеток гибридомы.
  2. Культура клеток гибридомы в Completе ростовой среде с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% антибиотика в Т75 колбы при 37 ° С в 5% СО 2. Поддержание плотности клеток 4 × 10 5 клеток / мл.
  3. Для секреции клеток исследований, на пеллетах клетки из Т75 колбы путем центрифугирования, дважды промывали средой RPMI-1640, свободных средств массовой информации в сыворотке крови (SFM), чтобы удалить выделяемые антитела и регулировать плотность клеток до 4 × 10 6 клеток / мл.
  4. Урожай клетки и тест на жизнеспособность до введения их в на LSPR чипов.
  5. Введение 50 мкл раствора клеточной вручную на чипах LSPR с помощью микропипетки. После нескольких минут от 25 до 50 клетки прилипают к поверхности чипов LSPR.
  6. Смыть оставшиеся клетки в растворе свежей SFM с помощью микрожидкостных системы перфузии.
  7. Выберите массивы LSPR для визуализации, которые близки, в течение 10 мкм, но не дублируют друг друга с клетками.
  8. Чтобы гарантировать, что сигнал является специфичным для секретируемого анти-с-Мус Антибodies ввести культуры клеток с и без антител, присутствующих, а также с антителами, но с их сайтов связывания заблокированных присутствии концентрации насыщающего с-Мус пептида в растворе.
  9. Калибровка датчиков в конце каждого прохода с насыщающей раствора анти-с-Myc антител (250 нм). Это помогает в нормализации реакцию датчиков и определить дробного заполнения на основе biofunctionalization профиль каждого прогона.
  10. Исправьте дрейф в X и Y направлении, используя выравнивание изображения программное обеспечение.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В типичной живой клетки исследования секреции есть несколько режимов сбора данных происходит. На рисунке 3 показан накладку на LSPRi образ, который подчеркивает квадратные массивы, и освещается в проходящем свете изображение, которое подчеркивает ячейку в левом нижнем углу. Данные обычно собираются в течение 3-ч с последующим введением раствора насыщающего аналита для расчета нормализации, описанного ниже. Флуоресцентный изображений также может быть интегрирован в процедуру сбора данных автоматизированной коммутации куба фильтра. На рисунке 4 клетке окрашенных флуоресцентным красителем родамин мембраны DHPE проявляет ламеллиподий, как расширения (стрелки). Если такие расширения были пересекаться с массивами они дать ложно-положительный результат на секрецию белка. Наличие нескольких режимов съемки могут помочь выявить такие случаи.

Рисунок 5 показывает спектрометрии данные до и кормеэр введение раствора насыщающего (400 нМ) купленных анти-с-Myc антитела к С-Myc функционализированных массивов. Клетки не присутствовали в этом эксперименте. Спектр отображает как красное смещение и увеличение интенсивности. Разница между площадей под двумя кривыми приводит к увеличению интенсивности изображения в режиме массива LSPRi на ПЗС-камеры. Нелинейная подход мере анализа данных площадей была разработана, чтобы вывести дробную размещение поверхностных лигандами из спектров. 30,31

В конце эксперимента, значения насыщенный интенсивности (т.е. дробно размещение ≈ 1) используются для вычисления нормализованной ответ для каждого массива, используя следующую формулу:

Где нормированная интенсивность в момент времени Т, начальная интенсивность в начале эксперимента, конечный насыщенного интенсивности и измеренная интенсивность массива в момент времени T

Нормированные значения от двух массивов показано на фиг.6. Один массив был в пределах 10 мкм клетки под следствием то время как другие, использовали в качестве контроля, были расстоянии 130 мкм от клетки. Внезапное увеличение в нормализованном ответ массива ближайшего к клеточной по отношению к плоской характеристикой массива управления указывает на локализованной вспышке секретируемых антител.

figure-results-1
Рисунок 1. Датчик дизайн. Рисунок с изображением геометрию типичного эксперимента живой клетки секреции. Ячейки (синий сфероид) наносят на чип к LSPR который содержит массивы золота biofunctionalized наноструктур. В увеличенного изображения, клеточной секреции интерес, в данном случае, как антител, показанных Y-образный молекул, измеряется как они связываться с поверхностьюфункционализованного наноструктур. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2. Оптическая установки. Светящаяся свет от галогенной лампы сначала фильтруется долго фильтра (LP). Свет линейно поляризованным (Р1) и освещает образец с помощью 40X / 1.4 Н.А. цели. Рассеянный свет собирали целью и пропускают через скрещенные поляризатор (Р2). Разветвитель 50/50 луча (БС) вставляется в пути света, собранной для одновременного анализа спектроскопических и образов. Вверху справа:. Атомно-силовой микроскопии изображение 9 отдельных наноструктур, разделенных шагом 300 нм Пожалуйста, нажмите здесьЧтобы смотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3. Живая сотовый LSPRi Исследование. Объединенный проходящего света и LSPRi изображение, показывающее один клетки гибридомы (внизу слева), окруженный 12 массивов. Это контраст улучшенное изображение. Масштабная линейка составляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4. живых клеток флуоресценции исследования. Флуоресцентный ложное цветное изображение из одного гибридомной клетки окрашивают родамин-DHPE, что мембрана краситель. В люминесцентной режиме визуализации массивов как правило, не видны, однако, поблизости массив наблюдается здесь ABне хватает площади в правом нижнем углу. Клетка может быть видно, чтобы отделить от массива, хотя щупальца, как расширений (возможно филоподий или ламеллиподий) оказываемое наружу из клеток (стрелки). Масштабная линейка составляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 5. Спектральный модальности. Спектры, полученные из С-Myc функционализированного массива до и после введения 400 нм раствора анти-с-Myc антител. Нет клетки не были представлены в данном исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-6 Рисунок 6. Single Cell секреции. Ответ из массива, расположенного в 15 мкм одной клетки и одного расположенного 130 мкм от (контроль). Масштабная линейка составляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод визуализации LSPR, описанный в этой работе, имеет множество преимуществ по сравнению с более традиционными методологиями обнаружения клеточной секреции. Во-первых, временное разрешение нашего метода составляет порядка секунд, в то время как коммерческая альтернатива, иммунопесчаный анализ, известный как EliSpot, имеет типичное временное разрешение от 2 до 3 дней. 7,32 В результате мы смогли устранить внезапные изменения в скорости секреции белка, подобные показанным на рисунке 6. Во-вторых, наличие матриц, распределенных по чипу, позволяет отслеживать секретируемый сигнал в пространстве и времени, что позволяет проводить более строгие сравнения с моделями секреции клеток, основанными на диффузии. Кроме того, массивы, подобные показанному на рисунке 6 , могут быть использованы для вычитания глобальных изменений в изображении, которые обычно возникают из-за инструментальных факторов, таких как дрейф фокуса. В-третьих, наша методика не требует модификации ячеек. При желании эксперимент может включать широко используемые метки, такие как флуоресцентные белки, но если есть опасения, что такие метки могут негативно повлиять на жизнеспособность клеток или гомеостаз, то безметочный характер нашего подхода не требует. В-четвертых, используя спектроскопические данные, мы продемонстрировали, что можно рассчитать количественную информацию о фракционной заполняемости поверхностно связанных лигандов.

Существует множество альтернативных методов получения металлических наночастиц по сравнению с EBL. Тем не менее, мы обнаружили, что EBL обеспечивает значительную гибкость для оптимизации наноструктуры и размеров матрицы для наилучшего соответствия оптике и исследуемым ячейкам. Также важным является тот факт, что чипы могут быть легко регенерированы путем плазменного озоления. Таким образом, типичный чип можно использовать десятки раз. Детали биофункционализации должны быть изменены для конкретного применения. Представленный здесь протокол конъюгировал поверхность с относительно небольшими лигандами c-myc пептида. Более крупные лиганды, такие как цельные антитела, обычно требуют большего расстояния и, следовательно, более высокого соотношения SPO к SPN/SPC. Тем не менее, хорошо сформированный слой SAM необходим для предотвращения неспецифического связывания в экспериментах с живыми клетками. Как правило, аналиты с большей молекулярной массой легче обнаруживаются с помощью LSPR. Таким образом, в своем одноклеточном проявлении этот метод может быть неподходящим для обнаружения секреции небольших белков, таких как цитокины.

Текущая установка была использована для изучения отдельных неадгезивных клеток. Существует значительное количество секретируемых сигнальных белков и везикул, к которым результаты, представленные в данной работе, непосредственно применимы. Например, раково-эмбриональный антиген (РЭА), который уже несколько десятилетий является диагностическим маркером рака. Известно, что клетки рака толстой кишки секретируют РЭА со скоростью тысячи молекул/клет/час, а молекулярная масса составляет 180 кДа, что превышает молекулярную массу антител IgG. Считается, что РЭА участвует в аутокринных и паракринных сигнальных путях, но пространственно-временная природа этих секреций никогда не измерялась. Наша методика может напрямую ответить на эти сигнальные вопросы. Продолжением этой работы будет измерение пространственно-временного характера секреции CEA из отдельных клеток. 33 Будущая работа также будет сосредоточена на интеграции LSPRi с двумерными и трехмерными клеточными культурами адгезивных клеток. Благодаря включению мультиплексных матриц, способных обнаруживать ряд секретируемых белков параллельно, этот метод может открыть новое окно в клеточную секрецию и то, как она влияет на соседние клетки.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Джорджа Андерсона за полезные комментарии и дискуссии. Эта работа была поддержана Институтом нанонауки Военно-морской исследовательской лаборатории и премией Национального исследовательского совета Research Associateship Award.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрыть.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
25  мм диаметром стеклянные покровные стеклаBioscience Tools CSHP-No1.5-25  170&mn; 5 и микро; m является оптимальным
ПолиметилметакрилатMicrochemPMMA 950 A4
Этиллактат метилметаакрилатMicrochemMMA EL6
Электронно-лучевой испарительTemescalFC-2000
Электронно-лучевая литографияRaithSeries 150
ЭтанолSigma-Aldrich459836
ацетонSigma-Aldrich320110
CR-7 хромовый травительCyantekCR-7
Сканирующий электронный микроскопZeissUltra 55
Атомно-силовой микроскопVeecoNanoscope III
Система плазменного озоленияTechnicsSeries 85 RIE
SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO)ProchimiaTH 001-m8.n3-0.2
SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC)ProchimiaTH 003m11n3-0.1
SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN)ProchimiaTH 002-m11.n3-0.2
Система поверхностного плазмонного резонансаBioradXPR36
Голая золотая крошкаBioradGLC Плазмаозоленная для удаления монослоя
1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимидThermo22980
N-гидроксисукцинимид (NHS)Thermo24510
Пентиламин-Биотин         Thermo21345
ЭтаноламинSigma-AldrichE9508
NeutraavidinThermo31000
Фосфатный буферный растворThermo28374
Tween 20Sigma-AldrichP2287
Инвертированный микроскопZeissAxio ObserverМикроскоп оснащен 40-кратным масляным иммерсионным объективом; CO2 и инкубация влажности от Pecon GmbH
CCD камераHamamatsuOrca R2Термоэлектрически охлаждаемая (16 бит)
СпектрометрOcean OpticsQE65Pro
SpectrasuiteOcean Opticsверсия1.4
c-myc пептид HyNic TagSolulinkSP-E003
моноклональное антителопротив c-mycSigma-AldrichM4439
Hybridoma клеточная линияATCCCRL-1729
Антимикотический раствор антибиотика (100×)Sigma-AldrichA5955
Сыворотка свободная среда RPMI 1640 Инвитроген  11835-030 
Фетальная бычья сывороткаATCC30-2020
Родамин DHPELife TechnologiesL-1392

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Exosomes: Small vesicles participating in intercellular communication. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 44, 11-15 (2012).">Ludwig, A. -K., Giebel, B. Exosomes: Small vesicles participating in intercellular communication. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 44, 11-15 (2012).
  2. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 445-457 (2009).">Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 445-457 (2009).
  3. Regulation of immune responses by TGF-beta. Annual Review of Immunology. 16, 137-161 (1998).">Letterio, J. J., Roberts, A. B. Regulation of immune responses by TGF-beta. Annual Review of Immunology. 16, 137-161 (1998).
  4. Regulation of wound healing by growth factors and cytokines. Physiological Reviews. 83, 835-870 (2003).">Werner, S., Grose, R. Regulation of wound healing by growth factors and cytokines. Physiological Reviews. 83, 835-870 (2003).
  5. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. Journal of Investigative Dermatology. 127, 998-1008 (2007).">Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. Journal of Investigative Dermatology. 127, 998-1008 (2007).
  6. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. Journal of the American Chemical Society. 129, 1959-1967 (2007).">Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. Journal of the American Chemical Society. 129, 1959-1967 (2007).
  7. A Fluorospot assay to detect single T lymphocytes simultaneously producing multiple cytokines. Journal of Immunological Methods. 283, 91-98 (2003).">Gazagne, A., et al. A Fluorospot assay to detect single T lymphocytes simultaneously producing multiple cytokines. Journal of Immunological Methods. 283, 91-98 (2003).
  8. Polyfunctional responses by human T cells result from sequential release of cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1607-1612 (2012).">Han, Q., et al. Polyfunctional responses by human T cells result from sequential release of cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1607-1612 (2012).
  9. Multidimensional analysis of the frequencies and rates of cytokine secretion from single cells by quantitative microengraving. Lab on a Chip. 10, 1391-1400 (2010).">Han, Q., Bradshaw, E. M., Nilsson, B., Hafler, D. A., Love, J. C. Multidimensional analysis of the frequencies and rates of cytokine secretion from single cells by quantitative microengraving. Lab on a Chip. 10, 1391-1400 (2010).
  10. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nature Medicine. 17, 738-743 (2011).">Ma, C., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nature Medicine. 17, 738-743 (2011).
  11. Real-time single-cell imaging of protein secretion. Scientific Reports. 4, (2014).">Shirasaki, Y., et al. Real-time single-cell imaging of protein secretion. Scientific Reports. 4, (2014).
  12. On chip real time monitoring of B-cells hybridoma secretion of immunoglobulin. Biosensors and Bioelectronics. 26, 2728-2732 (2011).">Milgram, S., et al. On chip real time monitoring of B-cells hybridoma secretion of immunoglobulin. Biosensors and Bioelectronics. 26, 2728-2732 (2011).
  13. New trends in instrumental design for surface plasmon resonance-based biosensors. Biosensors & Bioelectronics. 26, 1815-1824 (2011).">Abbas, A., Linman, M. J., Cheng, Q. A. New trends in instrumental design for surface plasmon resonance-based biosensors. Biosensors & Bioelectronics. 26, 1815-1824 (2011).
  14. Detection of a Few Metallo-Protein Molecules Using Color Centers in Nanodiamonds. Nano Letters. 13, 3305-3309 (2013).">Ermakova, A., et al. Detection of a Few Metallo-Protein Molecules Using Color Centers in Nanodiamonds. Nano Letters. 13, 3305-3309 (2013).
  15. A nanoscale optical blosensor: Sensitivity and selectivity of an approach based on the localized surface plasmon resonance spectroscopy of triangular silver nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 124, 10596-10604 (2002).">Haes, A. J., Van Duyne, R. P. A nanoscale optical blosensor: Sensitivity and selectivity of an approach based on the localized surface plasmon resonance spectroscopy of triangular silver nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 124, 10596-10604 (2002).
  16. Electron spin resonance of nitrogen-vacancy centers in optically trapped nanodiamonds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 13493-13497 (2012).">Horowitz, V. R., Aleman, B. J., Christle, D. J., Cleland, A. N., Awschalom, D. D. Electron spin resonance of nitrogen-vacancy centers in optically trapped nanodiamonds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 13493-13497 (2012).
  17. LSPR-based nanobiosensors. Nano Today. 4, 244-251 (2009).">Sepulveda, B., Angelome, P. C., Lechuga, L. M., Liz-Marzan, L. M. LSPR-based nanobiosensors. Nano Today. 4, 244-251 (2009).
  18. Biological and chemical gold nanosensors based on localized surface plasmon resonance. Gold Bulletin. 40, 240-244 (2007).">Barbillon, G., et al. Biological and chemical gold nanosensors based on localized surface plasmon resonance. Gold Bulletin. 40, 240-244 (2007).
  19. Multiple label-free detection of antigen-antibody reaction using localized surface plasmon resonance-based core-shell structured nanoparticle layer nanochip. Analytical Chemistry. 78, 6465-6475 (2006).">Endo, T., et al. Multiple label-free detection of antigen-antibody reaction using localized surface plasmon resonance-based core-shell structured nanoparticle layer nanochip. Analytical Chemistry. 78, 6465-6475 (2006).
  20. Label-free detection of peptide nucleic acid-DNA hybridization using localized surface plasmon resonance based optical biosensor. Analytical Chemistry. 77, 6976-6984 (2005).">Endo, T., Kerman, K., Nagatani, N., Takamura, Y., Tamiya, E. Label-free detection of peptide nucleic acid-DNA hybridization using localized surface plasmon resonance based optical biosensor. Analytical Chemistry. 77, 6976-6984 (2005).
  21. A localized surface plasmon resonance biosensor: First steps toward an assay for Alzheimer's disease. Nano Letters. 4, 1029-1034 (2004).">Haes, A. J., Hall, W. P., Chang, L., Klein, W. L., Van Duyne, R. P. A localized surface plasmon resonance biosensor: First steps toward an assay for Alzheimer's disease. Nano Letters. 4, 1029-1034 (2004).
  22. Supported lipid bilayer formation and lipid-membrane-mediated biorecognition reactions studied with a new nanoplasmonic sensor template. Nano Letters. 7, 3462-3468 (2007).">Jonsson, M. P., Jonsson, P., Dahlin, A. B., Hook, F. Supported lipid bilayer formation and lipid-membrane-mediated biorecognition reactions studied with a new nanoplasmonic sensor template. Nano Letters. 7, 3462-3468 (2007).
  23. A regeneratable, label-free, localized surface plasmon resonance (LSPR) aptasensor for the detection of ochratoxin A. Biosensors & Bioelectronics. 59, 321-327 (2014).">Park, J. H., et al. A regeneratable, label-free, localized surface plasmon resonance (LSPR) aptasensor for the detection of ochratoxin A. Biosensors & Bioelectronics. 59, 321-327 (2014).
  24. A single molecule immunoassay by localized surface plasmon resonance. Nanotechnology. 21, (2010).">Mayer, K. M., Hao, F., Lee, S., Nordlander, P., Hafner, J. H. A single molecule immunoassay by localized surface plasmon resonance. Nanotechnology. 21, (2010).
  25. Label-free cell-based assay using localized surface plasmon resonance biosensor. Analytica Chimica Acta. 614, 182-189 (2008).">Endo, T., Yamamura, S., Kerman, K., Tamiya, E. Label-free cell-based assay using localized surface plasmon resonance biosensor. Analytica Chimica Acta. 614, 182-189 (2008).
  26. Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion. Analytical Chemistry. 83, 4393-4406 (2011).">Huang, Y. X., Cai, D., Chen, P. Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion. Analytical Chemistry. 83, 4393-4406 (2011).
  27. Integrated Nanoplasmonic Sensing for Cellular Functional Immunoanalysis Using Human Blood. ACS Nano. 8, 2667-2676 (2014).">Oh, B. R., et al. Integrated Nanoplasmonic Sensing for Cellular Functional Immunoanalysis Using Human Blood. ACS Nano. 8, 2667-2676 (2014).
  28. Quantitative Imaging of Protein Secretions from Single Cells in Real Time. Biophysical Journal. 105, 602-608 (2013).">Raphael, M. P., Christodoulides, J. A., Delehanty, J. B., Long, J. P., Byers, J. M. Quantitative Imaging of Protein Secretions from Single Cells in Real Time. Biophysical Journal. 105, 602-608 (2013).
  29. A New Methodology for Quantitative LSPR Biosensing and Imaging. Analytical Chemistry. 84, 1367-1373 (2011).">Raphael, M. P., et al. A New Methodology for Quantitative LSPR Biosensing and Imaging. Analytical Chemistry. 84, 1367-1373 (2011).
  30. Quantitative LSPR imaging for biosensing with single nanostructure resolution. Biophysical Journal. 104, 30-36 (2013).">Raphael, M. P., et al. Quantitative LSPR imaging for biosensing with single nanostructure resolution. Biophysical Journal. 104, 30-36 (2013).
  31. A new methodology for quantitative LSPR biosensing and imaging. Analytical Chemistry. 84, 1367-1373 (2012).">Raphael, M. P., et al. A new methodology for quantitative LSPR biosensing and imaging. Analytical Chemistry. 84, 1367-1373 (2012).
  32. Modulation of single-cell IgG secretion frequency and rates in human memory B cells by CpG DNA, CD40L, IL-21, and cell division. Journal of Immunology. 183, 3177-3187 (2009).">Henn, A. D., et al. Modulation of single-cell IgG secretion frequency and rates in human memory B cells by CpG DNA, CD40L, IL-21, and cell division. Journal of Immunology. 183, 3177-3187 (2009).
  33. Soluble Carcinoembryonic Antigen Activates Endothelial Cells and Tumor Angiogenesis. Cancer Research. 73, 6584-6596 (2013).">Bramswig, K. H., et al. Soluble Carcinoembryonic Antigen Activates Endothelial Cells and Tumor Angiogenesis. Cancer Research. 73, 6584-6596 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

LSPRi

Похожие статьи