Методическая статья

Раннее проникновение вируса Анализы для идентификации и оценки антивирусных соединений

31.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53124

⸱

29 октября 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chinese Medicine, Taipei Medical University Hospital, 2Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 3Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 4Division of Hematology and Oncology, Department of Internal Medicine, Taipei Medical University Hospital, 5Department of Internal Medicine, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 6Graduate Institute of Medical Sciences, College of Medicine, Taipei Medical University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол, который исследует конкретные этапы проникновения вируса для выявления и оценки новых противовирусных агентов.

Аннотация

Клеточные системы полезны для обнаружения противовирусных агентов. Анализ жизненного цикла вируса, особенно ранних стадий проникновения, позволяет использовать механистический подход к выявлению и оценке противовирусных агентов, нацеленных на конкретные этапы проникновения вируса. В данном отчете описаны методы изучения вирусной инактивации, прикрепления вируса и проникновения/слияния вируса в качестве противовирусных анализов для этих целей с использованием вируса гепатита С в качестве модели. Эти анализы должны быть полезны для открытия новых антагонистов/ингибиторов для раннего проникновения вируса и помочь расширить область применения противовирусных препаратов-кандидатов для дальнейшей разработки лекарств.

Введение

Вирусные инфекции представляют собой постоянную угрозу общественному здоровью и являются важной причиной эпидемических заболеваний, заболеваемости и смертей во всем мире. Конкретные способы борьбы с вирусными инфекциями включают разработку вакцин и противовирусную терапию. Несмотря на то, что усилия по вакцинации оказались успешными в иммунизации против нескольких вирусов, многие вирусные патогены, включая вирус денге (DENV), цитомегаловирус человека (HCMV), вирус гепатита C (HCV), вирус иммунодефицита человека (HIV) и респираторно-синцитиальный вирус (RSV), остаются без защитной вакцины. Противовирусные препараты, с другой стороны, играют важную роль в лечении этих вирусных инфекций в условиях недоступности профилактических вакцин. Однако на сегодняшний день доступно лишь несколько лицензированных и экономически эффективных противовирусных препаратов по сравнению с количеством вирусных патогенов, угрожающих общественному здоровью. Что еще более важно, в связи с ростом числа поездок по всему миру и быстрой урбанизацией ситуация усугубляется рисками вспышек эпидемий, вызванных возникающими/вновь возникающими вирусными инфекциями, которые заносятся в районы некоренного населения6. Недавние вспышки, вызванные вирусом тяжелого острого респираторного синдрома (SARS), вирусами гриппа (H1N1, H5N1, H3N2 и H7N9), DENV, вирусом Западного Нила (ВЗН), вирусом кори (MV), вирусом ближневосточного респираторного синдрома (MERS) и вирусом Эбола6-12, относятся к числу примеров, отражающих необходимость разработки противовирусных препаратов в условиях недоступности иммунизации и/или лечения. Кроме того, всегда существует потенциальный риск возникновения лекарственно-устойчивых инфекций при использовании используемых в настоящее время противовирусных препаратов. Таким образом, непрерывная разработка и расширение сферы применения противовирусных препаратов для этих появляющихся/вновь возникающих вирусных инфекций необходимы для обеспечения более эффективных стратегий ведения и защиты здоровья населения.

Большинство противовирусных терапий состоят из противовирусных препаратов прямого действия (ПППД), которые нацелены на определенный вирусный белок или кофактор, опосредующий важные этапы в жизненном цикле вируса. Например, аналог нуклеозида Ацикловир ингибирует ДНК-полимеразу вируса герпеса, ингибиторы протеазы Боцепревир и Телапревир антагонизируют NS3 ВГС, а Осельтамивир и Занамивир являются ингибиторами нейраминидазы, блокирующими высвобождение частиц вируса гриппа из инфицированных клеток13-15. Тем не менее, существует очень мало лицензированных ингибиторов проникновения вируса, включая энфувиртид, который нацелен на HIV gp41 для предотвращения слияния, и маравирок, который блокирует корецептор CCR5 ВИЧ, тем самым предотвращая проникновение вируса16. Изучение новых антагонистов/ингибиторов проникновения вируса может помочь обеспечить дополнительные терапевтические средства для профилактического или терапевтического использования, например, в сочетании с другими противовирусными препаратами с другим механизмом действия для лучшего лечения вирусных инфекций17-19.

Идентификация противовирусных препаратов может включать в себя структурный дизайн лекарств и стратегию, основанную на скрининге кандидатов. Методы оценки противовирусной активности тестируемых препаратов включают биохимические анализы ферментативной активности и оценку с помощью клеточных систем20-23. В клеточных системах жизненный цикл вируса может быть разделен на отдельные стадии инфекции, такие как события входа (прикрепление, слияние, раскрытие оболочки), фаза репликации (репликация вирусного генома и трансляция белка) и выход вириона (сборка, созревание и высвобождение). Поскольку анализы могут быть адаптированы для исследования каждой конкретной стадии с использованием различных инструментов и методов, этот подход позволяет идентифицировать/исследовать потенциальные кандидаты на противовирусные препараты со специфическим механизмом действия, нацеленным на конкретную анализируемую стадию. Например, для анализа влияния лекарственного препарата конкретно на свободные вирусные частицы до их связывания с клеткой-хозяином можно провести «анализ вирусной инактивации». В этом анализе вирусу дают инкубироваться с испытуемым препаратом, а затем разбавляют для титрования препарата перед заражением монослоя клетки. Дополнительные этапы, такие как прикрепление вируса и стадии входа/слияния, также могут быть проанализированы индивидуально, путем изменения температуры во время инфекции. Для многих оболочечных вирусов проникновение/слияние вирусов на мембране клетки-хозяина значительно облегчается при 37 °C, но обычно исключается при 4 °C, что не влияет на связывание вируса24-29. Наконец, использование репортерных вирусов или клеточных систем может облегчить эти исследования и обеспечить проведение высокопроизводительного анализа.

Ранее мы использовали клеточный подход и анализировали раннее проникновение различных оболочечных вирусов для изучения противовирусных соединений, которые потенциально противодействуют вирусному проникновению30,31. В настоящем описании описаны различные используемые методы, включая инактивацию вируса, прикрепление вируса и анализ проникновения/слияния вируса.

Протокол

Примечание: Убедитесь, что все процедуры, связанные с культурой клеток и вирусную инфекцию проводятся в сертифицированных биобезопасности капюшонами, которые подходят для уровня биобезопасности образцов обрабатывается. Для целей описания протоколов, Gaussia репортера люциферазы с метками ВГС используется в качестве модели вируса 32. В контексте представительных результатов, соединения chebulagic кислоты (CHLA) и punicalagin (МОПС) используются в качестве кандидатов противовирусных, которые нацелены на вирусные гликопротеин взаимодействие с клеточной поверхности гликозаминогликанов в течение раннего вирусного входа шаги 31. Гепарин, который, как известно мешать ввода многих вирусов 30,31,33,34, используется в качестве положительного контроля лечения в таком контексте. Для основного фона по методам вирусологических, распространения вирусов, определения титра вируса, и выражение инфекционной дозы в бляшкообразующих единиц (БОЕ), сосредоточиться единиц (БОЕ) или множественность заражения (МВД), читатель вновьпривилегированных ссылаться 35. Для предыдущих примерах и оптимальных условиях, используемых для вирусов, показанных в представительных результатов, отсылая читателя к ссылкам 30-32,36-39, а также деталей, перечисленных в таблице 1, рис 1А, 2А и рис.

1. Культура клеток, соединение Подготовка и соединение цитотоксичность

  1. Выращивают соответствующую клеточную линию для системы вирусной инфекции, которые будут проанализированы (таблица 1). Для HCV, растут Ха-7,5 клеток в модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 200 Ед / мл пенициллина G, 200 мкг / мл стрептомицина и 0,5 мкг / мл амфотерицина В.
  2. Подготовка тестовых соединений и управления с использованием их соответствующих растворителей, например, растворить CHLA и Мопс в диметилсульфоксиде (ДМСО); подготовки гепарин в стерильной бидистиллированной воды. Для всех последующих разведений, используйте питательные среды.
    Примечание: окончательное ОБОГАЩЕНИЯРацион ДМСО в тест-соединение лечения является менее 1% в экспериментах; 1% ДМСО входит в качестве отрицательного контроля лечения в анализах для сравнения.
  3. Определить цитотоксичность испытуемых соединений (например, CHLA и Мопсом) на клетки для вирусной инфекции с помощью жизнеспособность клеток определяющую реагентом, таким как ХТТ (2,3-бис [2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил] -5-ил) карбонил] -2Н-тетразолия гидроксида):
    1. Для ВГС, семена Хух-7,5 клеток в 96-луночного планшета (1 × 10 4 клеток на лунку) и инкубировать при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатора в O / N, чтобы получить монослой.
    2. Применение контроля ДМСО (1%) или увеличение концентрации испытуемых соединений CHLA и PUG (напр. 0, 10, 50, 100 и 500 мкм) с культурой скважин в трех экземплярах.
    3. Инкубируют при 37 ° С в течение 72 ч, а затем выбросить среды в пластине и промыть клетки с 200 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) дважды.
    4. Добавить 100 мкл assayinг раствора из ХТТ основе набора в пробирке токсикологии анализа в каждую лунку и инкубируют планшеты при 37 ° С в течение еще ​​3 ч, чтобы позволить ХТТ формазана производства.
    5. Определить оптическую плотность с помощью микропланшет-ридера в тестовом волны 492 нм и длине волны сравнения 690 нм.
    6. Рассчитывают процент выживших клеток по следующей формуле: Жизнеспособность клеток (%) = В / В × 100%, где "в" и "В" относятся к поглощению испытуемых соединений и контроля растворителя (EX 1% ДМСО. ) процедуры, соответственно. Определить концентрацию 50% клеточной цитотоксичности (CC 50) испытуемых соединений с аналитическим программным обеспечением, такие как GraphPad Prism в соответствии с протоколом производителя.

2. Считывание вирусной инфекции

Примечание: считывание вирусной инфекции зависит от используемой системы вируса и может включать такие методы, как налет анализов или МЭАряя репортер сигналы от репортеров-тегами вирусов. Способ диагностики инфекции репортер-ВГС на основе люциферазы активности описан ниже.

  1. Собирают супернатанты от инфицированных скважин и уточнить при 17000 х г в микроцентрифуге в течение 5 мин при 4 ° С.
  2. Смешайте 20 мкл тестируемого супернатанта к 50 мкл субстрата люциферазы из анализа люциферазы комплект Gaussia и непосредственно измерить с люминометра в соответствии с инструкциями изготовителя.
  3. Экспресс инфекционность вируса гепатита как журнал 10 относительных световых единицах (RLU) для определения вирусной ингибирование (%) и вычислить 50% эффективную концентрацию (EC 50) испытуемых соединений против инфекции HCV, используя алгоритмы из программного обеспечения GraphPad Prism в соответствии с протоколом производителя.

3. Анализ вирусной инактивации

Примечание: Примеры инкубационного периода и вирусные дозы для различных Вирусыповторно перечислены на фиг.1А. Более высокие концентрации вируса также могут быть проверены путем увеличения МВД / ОРП.

  1. Семенной Ха-7,5 клеток в 96-луночный планшет (1 × 10 4 клеток на лунку) и инкубируют при 37 ° С в 5% СО 2 инкубаторе O / N, чтобы получить монослой.
  2. Инкубируйте тестируемых соединений или управления (окончательные концентрации: CHLA = 50 мкМ; МОПС = 50 мкМ; гепарин = 1000 мкг / мл; ДМСО = 1%) с частицами HCV при 37 ° С (фиг.1А, "Long-Term" ) в соотношении 1: 1. Например, для вирусной посевного 100 мкл, содержащей 1 х 10 4 ФФУ, добавить 100 мкл рабочего разведения в 100 мкМ CHLA; это дает лечение CHLA в конечной концентрации 50 мкМ.
  3. Развести смесь вирус-наркотиков, чтобы "субтерапевтическая" (неэффективной) концентрации испытуемых соединений. Например, неэффективная концентрация CHLA и PUG против ВГС на 1 мкМ 31; следовательноэто требует 50-кратное разбавление смеси вируса лекарственной которые могут быть выполнены с 9,8 мл базальной среды (среды для культивирования клеток с 2% FBS).
    Примечание: Разбавление до субтерапевтическом концентрации предотвращает значительное взаимодействие между тестируемыми соединениями и поверхности клетки-хозяина и позволяет исследовать эффект лечения на вирионов бесклеточных. Заметим, что это разбавление зависит от противовирусного ответа дозы испытуемых соединений против конкретного вирусной инфекции, и определяется перед выполнением этой конкретной анализа 31.
  4. Для сравнения, смешать с вирусом испытуемых соединений и сразу не развести (не инкубационный период) к югу от терапевтической концентрации до заражения (рис 1А ", краткосрочный рейтинг").
  5. Добавить 100 мкл разбавленной смеси ВГС лекарственной на Huh-7,5 монослоя клеток (количество вируса в настоящее время находится 1 х 10 2 ФФУ; конечная МВД = 0,01) и инкубируют в течение 3 ч при 37 ° С, чтобы позволить вирусныйадсорбции.
  6. После инфекции, удалить разбавленный инокулята и осторожно мыть скважин с 200 мкл PBS в два раза.
    Примечание: Выполните моет осторожно, чтобы избежать подъема клеток.
  7. Применение 100 мкл минимальной среды в каждую лунку и инкубируют при 37 ° С в течение 72 ч.
  8. Анализ полученного инфекции путем анализа супернатанта на активность люциферазы, как описано в "2. Считывание вирусной инфекции.

4. Вирусный Приложение Анализ

Примечание: Примеры инкубационного периода и вирусной дозы для различных вирусов, перечислены на фиг.2А, "Приложение". Более высокие концентрации вируса также могут быть проверены путем увеличения МВД / ОРП.

  1. Семенной Ха-7,5 клеток в 96-луночный планшет (1 × 10 4 клеток на лунку) и инкубируют при 37 ° С в 5% СО 2 инкубаторе O / N, чтобы получить монослой.
  2. Предварительно охладить монослоев клеток в планшеты при 4 ° С FOR 1 ч.
  3. Совместное лечение клеток с инокулята HCV (MOI = 0,01) и тестируемые соединения или управления (конечные концентрации являются: CHLA = 50 мкМ; МОПС = 50 мкМ; гепарин = 1000 мкг / мл; ДМСО = 1%) при 4 ° С в течение 3 ч. Например, в вирус инокулята, содержащего 90 мкл 1 × 10 2 ФФУ, добавить 10 мкл готового раствора 500 мкМ CHLA; это дает лечение CHLA в конечной концентрации 50 мкМ и инфекцию ВГС в МВД = 0,01 на клеточный монослой.
    Примечание: Важно провести эксперимент при 4 ° С, так как это позволяет вируса связывания, но исключает запись, которая наиболее эффективно происходит при температуре 37 ° С. Выполнение добавление вирусных и тестируемых соединений на льду и последующий инкубации в 4 ° C холодильником для того, чтобы поддерживать температуру на уровне 4 ° C.
  4. Удалить супернатант и осторожно мыть клеточный монослой с 200 мкл охлажденного льдом PBS дважды.
    Примечание: Выполните моет осторожно, чтобы избежать подъема клеток <./ LI>
  5. Применение 100 мкл минимальной среды в каждую лунку и инкубируют при 37 ° С в течение 72 ч.
  6. Анализ полученного инфекции путем анализа супернатанта на активность люциферазы, как описано в "2. Считывание вирусной инфекции.

5. Вирусный входа / Fusion Анализ

Примечание: Пример инкубационного периода и вирусной дозы для различных вирусов перечислены на фигуре 2a 'входа / Fusion ". Более высокие концентрации вируса также могут быть проверены путем увеличения МВД / ОРП.

  1. Семенной Ха-7,5 клеток в 96-луночный планшет (1 × 10 4 клеток на лунку) и инкубируют при 37 ° С в 5% СО 2 инкубаторе O / N, чтобы получить монослой.
  2. Предварительно охладить монослоев клеток в планшеты при 4 ° С в течение 1 часа.
  3. Инфицировать клетки с HCV (MOI = 0,01) при 4 ° С в течение 3 ч. Например, можно использовать вирусную прививочный 100 мкл, содержащую 1 х 10 2 ФФУ.
    Примечание: Выполните Аддиции вирусной посевного материала на льду и последующего инкубации в 4 ° C холодильником, чтобы поддерживать температуру в 4 ° С, что позволяет вирусной связывания, но не запись.
  4. Удалить супернатант и осторожно мыть монослоев клеток с 200 мкл охлажденного льдом PBS дважды.
    Примечание: Выполните моет осторожно, чтобы избежать подъема клеток.
  5. Treat лунки тестовых соединений или управления (конечные концентрации являются: CHLA = 50 мкМ; МОПС = 50 мкМ; гепарин = 1000 мкг / мл; ДМСО = 1%) и инкубируют при 37 ° С в течение 3 ч. Например, добавьте 10 мкл рабочего разведения 500 мкМ CHLA 90 мкл среды, перемешать, и лечить скважин; это дает лечение CHLA в конечной концентрации 50 мкМ.
    Примечание: Переход от 4 ° С до 37 ° С в настоящее время облегчает вирусную событие входа / сварки и, следовательно, позволяет оценить эффект испытуемых соединений по этой "конкретной стадии.
  6. Аспирируйте наркотиков, содержащих супернатант и удаления не усвоенывнеклеточные вирусы либо промыванием 200 мкл цитратного буфера (50 мМ цитрат натрия, 4 мМ хлорида калия, рН 3,0) или PBS. Применение 100 мкл минимальной среде перед инкубацией при 37 ° С в течение 72 ч.
  7. Анализ полученного инфекции путем анализа супернатанта на активность люциферазы, как описано в "2. Считывание вирусной инфекции.

Результаты

На рисунке 1, "вирусная инактивация анализ" было проведено с целью изучить ли два конкретных природных соединений CHLA и мопс может инактивировать различные вирусов с оболочкой в бесклеточной государства и предотвратить последующую инфекцию. Ответ на дозу цитотоксичность и противовирусную этих соединений были определены перед выполнением механистическую исследование 31. Эти вирусы были предварительно обработаны испытуемыми соединениями, а затем смеси вирус-лекарственное средство разбавляли до суб-терапевтических концентраций, прежде чем прививки на соответствующий монослоя клеток для каждого вируса системы. Как показано на рисунке 1, и CHLA и МОПС-видимому, взаимодействуют с вирионов бесклеточных, в результате чего необратимых эффектов, которые защищали клеточный монослой из последующего инфицирования. Два испытания соединения достигается почти 100% -ное ингибирование против HCMV, ВГС и DENV-2, в то время как 60 а - 80% блок наблюдалось против М.В. и RSV. Эти результаты suggТекущая что CHLA и мопс есть прямое воздействие на этих свободных вирусных частиц по их инактивации и нейтрализации инфекционность.

На рисунке 2, привязанность и ввода / слияния анализы были проведены для изучения эффекта CHLA и PUG против этих ранних вирусных событий входа связанных с HCMV, ВГС, DENV-2, М., и RSV. Оба CHLA и мопс эффективно предотвратить связывание исследуемых вирусов на соответствующей клетке-хозяине, как показано ингибирование на полученной вирусной инфекции (рис 2, '' Attachment: светло-серый бар). Ингибирующий эффект на вложение вируса от обоих соединений были похожи HCMV (Фигура 2В), HCV (фиг.2с), DENV-2 (рис 2D) и РСВ (рис 2F), от 90 - 100%. С другой стороны, МОПС оказались более эффективными, чем CHLA против MV связывания (рис 2E), со скоростью ингибирования от TWO соединения различной между 50 - 80%. Лечение управления гепарин, который, как известно, чтобы блокировать проникновение вирусов, многие также ингибирует прикрепление HCMV, DENV-2, RSV, объявление MV, но менее эффективным в отношении HCV. Последовавшая "вирусный вход / слияние анализ" рассматривается CHLA и мопс сохранил ли свою деятельность на этапе входа в вирус / слияния (рис 2, "Вступление / Fusion": темные серые полосы). Опять же, как и CHLA МОПС наблюдались эффективно снижать вирусную шаг записи / слияния вирусов исследованных (Фигура 2В - F), что дает 50 - 90% защитное действие на соответствующем монослоя клеток. Гепарин также мощно ингибирует вход / слияние в DENV-2 и RSV инфекций, но менее эффективны против HCMV, ВГС и MV (<40% ингибирование в среднем).

Вирус Тип клетки
ЦМВ HEL
ВГС Хух-7,5
DENV-2 Веро
М.В. СНО-SLAM
RSV Нер-2

Таблица 1:. Тип клетки-хозяина для вирусной инфекции типа клеток используется для каждой вирусной инфекции системе, описанной в представительных результатов указывается. Дополнительные подробности, касающиеся клетки могут быть найдены в справочнике 31.

figure-results-1
Рисунок 1. Инактивация вирусных инфекций к CHLA тестируемых соединений и PUG Различные вирусы были обработаны испытуемыми соединениями в течение длительного периода. (Инкубируют в течение 1,5 - 3 часов, прежде чем титрования; светло-серые столбики) или короткий период (сразу разводили; темно-серый бары) при 37 ° С до разведении в суб-терапевтических Concentraние и последующий анализ инфекции на соответствующий клеток-хозяев. (А) Схема эксперимента (показана слева) с конечной концентрации вируса (БОЕ / хорошо или МВД), долгосрочные период вируса наркотиков Инкубационный (я), и последующее время инкубации (II) указывается для каждого вируса в таблице справа. Анализы для (В) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2 (Е) М.В., (F), РСВ указаны в каждом дополнительном панели. Результаты приведены в отношении ДМСО отрицательной контрольной обработки для вирусной инфекции и данными, показанными являются средние значения ± стандартная ошибка среднего (SEM) от трех независимых экспериментов. Эта цифра была изменена с ссылкой на 31. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2. Оценка противовирусной активности в CHLA тестируемых соединений и PUG против вируса прикрепления и входа / слияния. (А) Экспериментальная процедура, концентрация вируса (БОЕ / лунку или МВД), а время сложения и обработки тестируемых соединений (I, II, III) представлены для каждого вируса в схемах и таблицах связанных. В анализе связывания вируса (светло серые столбцы), монослои клеток различных типов предварительно охлажденным при 4 ° С в течение 1 ч, затем совместно обрабатывали соответствующих вирусов и испытуемых соединений при 4 ° С (1,5 - 3 ч; I) Перед смывая прививает и испытания соединений для последующей инкубации (37 ° С; II) и экспертиза вирусной инфекции. В вирусной записи / анализа синтеза (темно-серые столбцы), отобранный клеточные монослои были предварительно охлажденной при 4 ° С в течение 1 ч, а затем заражали соответствующих вирусов при температуре 4 ° С в течение 1,5 - 3 часов (I). Затем клеткипромывали и обрабатывали испытуемыми соединениями в течение дополнительного периода инкубации (II), в течение которого температура была сдвинута до 37 ° С, чтобы облегчить вирусной событие входа / фьюжн. В конце инкубации, внеклеточные вирусы были удалены либо цитратном буфере (рН 3,0) или PBS стирок и клетки дополнительно инкубировали (III) для анализа вирусной инфекции. Результаты для (В) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2 (Е) М.В., (F), РСВ указаны в каждом дополнительном панели. Данные приведены по отношению к ДМСО отрицательной контрольной обработки вирусной инфекции и представлены в виде ± SEM трех независимых экспериментов. Эта цифра была изменена с ссылкой на 31. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

В данном отчете были описаны методы идентификации и оценки противовирусных соединений, основанные на механистическом подходе к анализу ранних событий проникновения вируса. В частности, анализы позволили нам изучить влияние тестовых соединений на свободные вирусные частицы, прикрепление вируса и его проникновение/слияние. Были предприняты критические шаги для четкой оценки влияния препарата на конкретную стадию раннего проникновения вируса. Например, в «анализе инактивации вируса» разведение смеси вируса и лекарственного препарата до субтерапевтической концентрации предотвращает значительное взаимодействие между исследуемым соединением и поверхностью клетки-хозяина путем «титрования» препарата. Это гарантирует, что наблюдаемый ингибирующий эффект при последующем инфицировании клетки-хозяина обусловлен прямым взаимодействием между исследуемым соединением и внеклеточными вирионами, а не эффектом от исследуемого соединения на мембрану клетки-хозяина или мембраноассоциированные молекулы, включая вирусные рецепторы30. Аналогичным образом, сдвиг температуры между 4 °C (что позволяет связываться с вирусом, но не проникать внутрь) и 37 °C (что способствует проникновению/слиянию вируса) в «анализе вирусного прикрепления» и «анализе проникновения/слияния вируса» имеет решающее значение для определения влияния испытуемого соединения на каждое из этих конкретных событий. Это возможно благодаря температурной чувствительности оболочечных вирусов во время этих этапов инфекции24-29. Поэтому важно, чтобы анализы проводились при указанной температуре, чтобы обеспечить точность результатов; Например, проведя эксперимент на льду для поддержания при 4 °C и поместив образец непосредственно в инкубатор при температуре 37 °C для температурного сдвига. Кроме того, использование отрицательного (например, растворитель ДМСО для приготовления лекарств) и положительного (например, лечение гепарином) контроля также помогает в дальнейшем установить точность анализов. Полезность и применимость таких методов были продемонстрированы во многих противовирусных исследованиях26,30,31,40,41. Обратите внимание, что, хотя гепарин включен в качестве контроля для всех трех анализов в контексте репрезентативных результатов, он, как правило, блокирует начальное связывание вируса, а не последующий этап слияния/входа (как показано на рисунке 2). Также могут быть использованы дополнительные меры контроля, такие как нейтрализующие антитела, направленные против вируса (для анализа инактивации вируса), антитела, которые маскируют рецепторы клеточной поверхности для вируса (для анализа прикрепления вируса), и ингибиторы слияния мембран (для анализа слияния/проникновения вируса).

Описанные в этом отчете анализы, специфичные для ранних стадий вирусной инфекции, полезны с точки зрения применения в качестве вторичных тестов для характеристики механизма действия препаратов-кандидатов из первичных скринингов, которые обычно нацелены на вирусную инфекцию в более широком смысле. В качестве альтернативы, они также могут быть включены в первичный скрининг, если вы специально ищете ингибиторы раннего проникновения вируса, включая инактивирующие вирусы агенты, антагонисты вирусной привязанности и ингибиторы вирусного проникновения/слияния. В этом случае их использование позволяет проводить более целенаправленный и точный скрининговый анализ для идентификации специфичных для механизма противовирусных кандидатов, что, в свою очередь, ускорит последующую разработку лекарств.

Использование клеточных анализов для идентификации противовирусных агентов дает несколько важных преимуществ по сравнению с биохимическими анализами, включая выявление потенциальных побочных эффектов (таких как цитотоксичность) и добавление физиологической значимости к биологической активноститестируемых агентов. Эти вопросы являются важными факторами для принятия решения о том, представляет ли потенциальный препарат ценность для продолжения производства на последующих этапах разработки лекарственного препарата. Аналогичным образом, описанные в настоящем отчете ранние анализы на проникновение вируса позволяют изучить влияние препарата на отчетливую стадию проникновения вируса на клеточном уровне, в частности, в контексте подлинной вирусной инфекции in vitro. Таким образом, результаты, полученные в результате таких анализов, помогут лучше прогнозировать противовирусную эффективность исследуемых соединений, а также выявить потенциально нежелательные побочные эффекты против клетки-хозяина. Одним из потенциальных ограничений, однако, является то, что анализ на основе клеток in vitro может не полностью отражать фактический этап входа in vivo в контексте естественной вирусной инфекции. Тем не менее, анализы, представленные в этом протоколе, служат аналитической платформой для механической идентификации и оценки новых противовирусных агентов.

Разработка репортерных вирусов или репортерных клеточных систем для количественного определения количества вирусной инфекции значительно облегчила клеточный скрининг и оценку противовирусных соединений. Примеры включают использование рекомбинантных вирусов, несущих репортерный ген, или с помощью рекомбинантных клеточных линий человека, содержащих репортерный ген, управляемый специфическим промотором вируса31,43. В этом отчете инфекция от меченого люциферазой HCV может быть легко отслежена путем количественного определения сигнала репортера, что облегчает анализ данных. Используя эти полезные инструменты, описанные здесь, описанные здесь ранние анализы вирусного проникновения могут быть по существу адаптированы к высокопроизводительному формату для скрининга малых молекул на основе механизмов.

В заключение был описан протокол анализов, анализирующих раннее проникновение вируса, в качестве средства идентификации и оценки специфичных для механизма противовирусных соединений. Такие анализы были бы полезны для открытия новых антагонистов/ингибиторов проникновения вируса и помогли бы расширить область применения противовирусных препаратов для разработки в качестве профилактических и/или терапевтических методов лечения.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Это исследование поддержано при финансовой поддержке больницы Тайбэйского медицинского университета (102TMU-TMUH-19) и Министерства науки и технологий Тайваня (MOST103-2320-B-038-031-MY3).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEMGIBCO11995-040
FBSGIBCO26140-079
Пенициллин-стрептомицинGIBCO15070-063
Амфотерицин BGIBCO15290-018
DMSOSigmaD5879
Набор для токсикологического анализа in vitro, SigmaTOX2
на основе XTTPBS pH 7,4 GIBCO10010023
Считыватель микропланшетовThermo Scientific89087-320
МикроцентрифугаThermo Scientific75002420
набор для анализа люциферазы BioLux GaussiaNew England BiolabsE3300L     
ЛюминометрPromegaGloMax-20/20
Цитрат натрия, дигидратSigma71402
Хлорид калияSigmaP5405

Ссылки

  1. Munier, C. M., Andersen, C. R., Kelleher, A. D. HIV vaccines: progress to date. Drugs. 71, 387-414 (2011).
  2. Rothman, A. L. Immunity to dengue virus: a tale of original antigenic sin and tropical cytokine storms. Nat Rev Immunol. 11, 532-543 (2011).
  3. Sung, H., Schleiss, M. R. Update on the current status of cytomegalovirus vaccines. Expert Rev Vaccines. 9, 1303-1314 (2010).
  4. Torresi, J., Johnson, D., Wedemeyer, H. Progress in the development of preventive and therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J Hepatol. 54, 1273-1285 (2011).
  5. Wright, M., Piedimonte, G. Respiratory syncytial virus prevention and therapy: past, present, and future. Pediatr Pulmonol. 46, 324-347 (2011).
  6. Christou, L. The global burden of bacterial and viral zoonotic infections. Clin Microbiol Infect. 17, 326-330 (2011).
  7. Cascio, A., Bosilkovski, M., Rodriguez-Morales, A. J., Pappas, G. The socio-ecology of zoonotic infections. Clin Microbiol Infect. 17, 336-342 (2011).
  8. Grais, R. F. Measles vaccination in humanitarian emergencies: a review of recent practice. Confl Health. 5, 21(2011).
  9. Gautret, P. Emerging viral respiratory tract infections-environmental risk factors and transmission. Lancet Infect Dis. 14, 1113-1122 (2014).
  10. Sampathkumar, P. Middle East respiratory syndrome: what clinicians need to know. Mayo Clin Proc. 89, 1153-1158 (2014).
  11. Burd, E. M. Ebola Virus: a Clear and Present Danger. J Clin Microbiol. 53, 4-8 (2015).
  12. Bishop, B. M. Potential and Emerging Treatment Options for Ebola Virus Disease. Ann Pharmacother. , (2014).
  13. Arduino, P. G., Porter, S. R. Oral and perioral herpes simplex virus type 1 (HSV-1) infection: review of its management. Oral Dis. 12, 254-270 (2006).
  14. Mitrasinovic, P. M. Advances in the structure-based design of the influenza A neuraminidase inhibitors. Curr Drug Targets. 11, 315-326 (2010).
  15. Soriano, V. Directly acting antivirals against hepatitis C virus. J Antimicrob Chemother. 66, 1673-1686 (2011).
  16. Haqqani, A. A., Tilton, J. C. Entry inhibitors and their use in the treatment of HIV-1 infection. Antiviral Res. 98, 158-170 (2013).
  17. Melby, T., Westby, M. Inhibitors of viral entry. Handb Exp Pharmacol. , 177-202 (2009).
  18. Vanderlinden, E., Naesens, L. Emerging antiviral strategies to interfere with influenza virus entry. Med Res Rev. 34, 301-339 (2014).
  19. Antoine, T. E., Park, P. J., Shukla, D. Glycoprotein targeted therapeutics: a new era of anti-herpes simplex virus-1 therapeutics. Rev Med Virol. 23, 194-208 (2013).
  20. Pawlotsky, J. M., Chevaliez, S., McHutchison, J. G. The hepatitis C virus life cycle as a target for new antiviral therapies. Gastroenterology. 132, 1979-1998 (2007).
  21. Beyleveld, G., White, K. M., Ayllon, J., Shaw, M. L. New-generation screening assays for the detection of anti-influenza compounds targeting viral and host functions. Antiviral Res. 100, 120-132 (2013).
  22. Kilianski, A., Baker, S. C. Cell-based antiviral screening against coronaviruses: developing virus-specific and broad-spectrum inhibitors. Antiviral Res. 101, 105-112 (2014).
  23. Caillet-Saguy, C., Lim, S. P., Shi, P. Y., Lescar, J., Bressanelli, S. Polymerases of hepatitis C viruses and flaviviruses: structural and mechanistic insights and drug development. Antiviral Res. 105, 8-16 (2014).
  24. Frey, S. Temperature dependence of cell-cell fusion induced by the envelope glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 69, 1462-1472 (1995).
  25. Tscherne, D. M. Time- and temperature-dependent activation of hepatitis C virus for low-pH-triggered entry. J Virol. 80, 1734-1741 (2006).
  26. Madan, R. P. Molecular umbrellas: a novel class of candidate topical microbicides to prevent human immunodeficiency virus and herpes simplex virus infections. J Virol. 81, 7636-7646 (2007).
  27. Haywood, A. M., Boyer, B. P. Time and temperature dependence of influenza virus membrane fusion at neutral pH. J Gen Virol. 67 (Pt 12), 2813-2817 (1986).
  28. Haywood, A. M., Boyer, B. P. Sendai virus membrane fusion: time course and effect of temperature, pH, calcium, and receptor concentration). Biochemistry. 21, 6041-6046 (1982).
  29. Wang, G., Hernandez, R., Weninger, K., Brown, D. T. Infection of cells by Sindbis virus at low temperature. Virology. 362, 461-467 (2007).
  30. Lin, L. T. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. J Virol. 85, 4386-4398 (2011).
  31. Lin, L. T. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiol. 13, 187(2013).
  32. Marukian, S. Cell culture-produced hepatitis C virus does not infect peripheral blood mononuclear cells. Hepatology. 48, 1843-1850 (2008).
  33. Baba, M., Snoeck, R., Pauwels, R., de Clercq, E. Sulfated polysaccharides are potent and selective inhibitors of various enveloped viruses, including herpes simplex virus, cytomegalovirus, vesicular stomatitis virus, and human immunodeficiency virus. Antimicrob Agents ChemotheR. 32, 1742-1745 (1988).
  34. Barth, H. Cellular binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparan sulfate. J Biol CheM. 278, 41003-41012 (2003).
  35. Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of Virology. , 3rd edn, ASM Press. (2008).
  36. Brown, M. G. Dramatic caspase-dependent apoptosis in antibody-enhanced dengue virus infection of human mast cells. J Leukoc Biol. 85, 71-80 (2009).
  37. Huang, Y., Cyr, S. L., Burt, D. S., Anderson, R. Murine host responses to respiratory syncytial virus (RSV) following intranasal administration of a Protollin-adjuvanted, epitope-enhanced recombinant G protein vaccine. J Clin Virol. 44, 287-291 (2009).
  38. Isaacson, M. K., Compton, T. Human cytomegalovirus glycoprotein B is required for virus entry and cell-to-cell spread but not for virion attachment, assembly, or egress. J Virol. 83, 3891-3903 (2009).
  39. Leonard, V. H., et al. Measles virus blind to its epithelial cell receptor remains virulent in rhesus monkeys but cannot cross the airway epithelium and is not shed. J Clin Invest. 118, 2448-2458 (2009).
  40. Ciesek, S. The green tea polyphenol, epigallocatechin-3-gallate, inhibits hepatitis C virus entry. Hepatology. 54, 1947-1955 (2011).
  41. Lin, L. T. Saikosaponin b2 is a naturally occurring terpenoid that efficiently inhibits hepatitis C virus entry. J Hepatol. 62, 541-548 (2015).
  42. Atkins, C., Evans, C. W., White, E. L., Noah, J. W. Screening methods for influenza antiviral drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7, 429-438 (2012).
  43. Zhang, J. Identification of novel virus inhibitors by influenza A virus specific reporter cell based screening. Antiviral Res. 93, 48-54 (2012).

Перепечатки и разрешения

Теги

CPBS
Раннее проникновение вируса Анализы для идентификации и оценки антивирусных соединений
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.