Method Article

Расшифровка и визуализации патогенез и запи- Микобактерии abscessus У эмбрионов данио рерио

DOI:

10.3791/53130

⸱

September 9th, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS, UMR 535, Université Montpellier, 2Centre d'études d'agents Pathogènes et Biotechnologies pour la Santé, CNRS, FRE 3689, Université Montpellier, 3Unité de Formation et de Recherche des Sciences de la Santé, EA3647-EPIM, Université Versailles St Quentin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оптически прозрачные эмбрионы данио-рерио широко используются для изучения и визуализации в реальном времени взаимодействий между патогенными микроорганизмами и клетками врожденного иммунитета. Микроинъекция Mycobacterium abscessus в сочетании с флуоресцентной визуализацией используется для тщательного изучения основных патогенных особенностей, таких как образование пуповины у эмбрионов рыбок данио.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эмбрионы рыбки данио-рерио (Danio rerio) все чаще используются в качестве модели инфекции для изучения функции врожденной иммунной системы позвоночных при взаимодействии хозяина и патогена. Легкость получения большого количества эмбрионов, их доступность благодаря внешнему развитию, их оптическая прозрачность, а также наличие широкого ассортимента генетических/иммунологических инструментов и коллекций трансгенных репортерных линий, В связи с этим в настоящей рукописи описывается использование рыбок данио рерио в качестве модельной системы in vivo для исследования хронологии инфекции Mycobacterium abscessus. Этот патоген человека может существовать как в виде гладких (S), так и шероховатых (R) вариантов, в зависимости от состава клеточной стенки, а их соответствующая вирулентность может быть визуализирована и сравнена на эмбрионах и личинках рыбок данио. Микроинъекция флуоресцентных вариантов S или R непосредственно в кровоток через каудальную вену приводит к хроническим или острым/летальным инфекциям соответственно. Эта биологическая система позволяет с высоким разрешением визуализировать и анализировать роль микобактериального корда в содействии образованию абсцессов. Кроме того, использование флуоресцентных бактерий вместе с трансгенными линиями рыбок данио, содержащими флуоресцентные макрофаги, дает уникальную возможность для многоцветной визуализации взаимодействий хозяина и патогена. В данной статье подробно описаны протоколы приготовления гомогенного инокулята M. abscessus и внутривенного введения эмбрионов рыбок данио для последующей флуоресцентной визуализации взаимодействия с макрофагами. Эти методы открывают путь к будущим исследованиям с участием мутантов с дефектами в формировании пуповины и направлены на то, чтобы понять, как это влияет на патогенность M. abscessus у целых позвоночных.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mycobacterium abscessus является новым патогеном, который вызывает широкий спектр клинических синдромов у человека. Они включают в себя кожные инфекции, а также тяжелые хронические легочные инфекции, в основном, с которыми сталкиваются в ослабленным иммунитетом и при муковисцидозе пациентов 1,2,3,4. М. abscessus также рассматривается в качестве основного быстрорастущих видов микобактерий, ответственных за внутрибольничными инфекциями и ятрогенных в людях. Кроме того, несколько последних докладах подчеркивается возможность, что М. abscessus может пересечь гематоэнцефалический барьер и вызывают важные поражений в центральной нервной системе (ЦНС) 5,6. Несмотря на то, быстрое садовод, М. abscessus экспонаты также несколько патогенных особенности, связанные с тем, микобактерий туберкулеза, в том числе способность хранить молчание в течение многих лет в гранулематозных структур и генерировать казеозной поражений в легких. 7 Еще более тревожным является низкая сенательность М. abscessus к антибиотикам, что делает чрезвычайно трудным для лечения приводит к значительному терапевтическому отказов 8,9 эти инфекции. Важно угроза этого вида, в основном, его внутреннее сопротивление к антибиотикам, что серьезную озабоченность в учреждениях здравоохранения 10 и противопоказания к трансплантации легких 11.

M. abscessus отображает гладкие (S) или грубой (R) колонии морфотипов, которые приводят к различным результатам. Клинических В отличие от штамма S, R бактерии имеют тенденцию к росту конца в конец, что приводит к тросу или шнура, как структура, 12,13. Несколько независимых исследований, основанных на клеточных либо или животных моделей выявлены гипер-вирулентность фенотип R морфотипом 14,15. Из эпидемиологических исследований, наиболее тяжелых случаях М. abscessus легочные инфекции, кажется, связаны с R варианты 16, которые только что вариантБыло видно, чтобы сохраняться в течение многих лет в инфицированном 3. Разница морфотип полагается на наличие (в S) или убыток (в R) поверхностно-связанный glycopeptidolipids (GPL) 12. Тем не менее, из-за ограничений, присущих имеющихся в настоящее время моделей сотовых / животных используются для изучения М. abscessus инфекция, наши знания о патофизиологических событий в R или S вариантов остается неясным. Заражение иммунокомпетентных мышей с помощью внутривенных или аэрозольных маршрутов приводит к транзиторной колонизации, препятствуя использованию мышей для изучения стойких инфекций и для в естественных условиях лекарственной чувствительности тестирования 17. Таким образом, разработка моделей животных поддающиеся манипуляции принимающей ответ является серьезной проблемой. В этом контексте модели не млекопитающих инфекции были разработаны недавно, в том числе дрозофилы 18, который предлагает несколько преимуществ, таких как стоимости, скорости и этическую приемлемость OVer модель мыши. Данио (Danio rerio) модель инфекции также были изучены для визуализации, по неинвазивной визуализации, прогрессии и хронологии М. abscessus инфекции в живого животного 19. Важно отметить, что доказательство концепции было также установлено, чтобы продемонстрировать свою пригодность для естественных антибиотиков в оценках против М. abscessus 17,20.

Данио были широко используется в течение последних двух десятилетий, чтобы изучить взаимодействие между различными возбудителями и иммунной системы хозяина 21. Увеличение Успех этой альтернативной модели позвоночных опирается на крупных и уникальных возможностей, которые мотивированы и проверенных использовать его для лучшего понимания многочисленных вирусных и бактериальных инфекций 19,22,23,24,25,26,27,28,29. В отличие от большинства других животных моделях, эмбрионы рыбок данио оптически прозрачны, что позволяет неинвазивным флуоресценции изображений 30. Это гаы привело к изучению М. abscessus инфицированных эмбрионов данио с беспрецедентными деталей, кульминацией с описанием внеклеточного Перетяжка, которые представляют пример бактериальной морфологической пластичности. Кординг представляет собой новый механизм подрывной деятельности иммунной системы и ключевую механизм, способствующий патогенеза острого М. abscessus инфекции 19.

Этот отчет описывает новые инструменты и методы, используя данио эмбриона, чтобы расшифровать патофизиологические черты М. abscessus инфекции и изучать интимные взаимодействия между бацилл и иммунной системы. Во-первых, Подробный протокол микроинъекции, который включает обработку бактериального инокулята, подготовки эмбриона, и инфекции как таковой, представлена. Методы адаптирован для оценки M. abscessus вирулентности путем измерения различных параметров, таких как выживание хозяина и бактериальной нагрузки, представлены. Особое внимание уделяется, какконтролировать, в пространственно-временном уровне, судьбу и развитие инфекции и иммунного ответа к М. abscessus с использованием видео-микроскопии. Кроме того, для изучения вклада и роли макрофагов при М. abscessus инфекции, методы получения макрофаги обедненного эмбрионов (используя либо genetically- или химически основе подходов), описанные. Наконец, протоколы для визуализации конкретных взаимодействия с макрофагами или нейтрофилами, используя фиксированные или живущих эмбрионов документально.

Целью данного отчета является стимулирование дальнейших исследований, чтобы пролить новый свет на М. abscessus механизмы вирулентности и, в частности роль сь в создании острого и неконтролируемой инфекции. процесса

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рыбок данио экспериментальные процедуры должны соответствовать соответствующих институциональных и правительственных постановлений. Для настоящего исследования, данио эксперименты были проведены в университете Монпелье, в соответствии с директивами Европейского Союза для обработки лабораторных животных (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm) и утверждены по ссылке CEEA-LR-13007.

1. Подготовка реактивов и оборудования микроинъекции

  1. Подготовка рыбы воду путем растворения 0,06 г мгновенных океан Морская соль в 1 л дистиллированной воды 31, а затем автоклав для стерилизации (120 ° C в течение 20 мин) и магазин на 28,5 ° С в течение 1 месяца.
  2. Подготовка раствора метиленовой синьки растворением 1 г метиленового синего в 1 л дистиллированной воды. Добавить 300 мкл раствора метиленовой синьки в 1 л воды рыбы, чтобы получить синий рыбы воду, затем автоклав для стерилизации и хранения на 28,5 ° С в течение 1 месяца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: дополнительна метиленового синего в воде рыбы предотвращает рост плесени.
  3. Приготовление фосфатно-солевой буфер (PBS),
    1. Подготовка 10 х PBS исходный раствор путем растворения 5.696 г Na 2 HPO 4, 680 мг КН 2 РО 4, 969 мг KCl и NaCl 78,894 г в 1 л дистиллированной воды и доведения рН до 7,0 с помощью HCl. Чтобы получить 1 X PBS, разбавленной 100 мл раствора 10 х PBS в 900 мл дистиллированной воды и автоклав в течение 20 мин при 120 ° С для стерилизации.
    2. Добавить 0,05% твин 80, чтобы получить 1 X PBST и хранить при комнатной температуре в течение до 1 года.
  4. Подготовьте олеиновой кислоты декстроза каталазы (OADC) обогащение путем растворения 8,5 г NaCl, 50 г бычьего сывороточного альбумина, 20 г D-глюкозы, 40 мг каталазы из печени быка и 0,5 г олеиновой кислоты в 1 л дистиллированной воды, затем фильтруют стерилизовать раствор и хранить его при температуре 4 ° С в течение до 6 месяцев.
  5. Приготовьте 100 мл этилового эфира 3-аминобензойной кислоты метансульфокислоты (Tricaine) маточного раствора, растворением 400 мг tricaiпе порошок в 97,9 мл дистиллированной воды. Добавить 2,1 мл 1 М Трис (рН 9), чтобы довести рН до 7,0 и хранить раствор при -20 ° C.
  6. Подготовка инъекций микрокапиллярных иглы, потянув боросиликатного стекла капилляров (1 мм ОД X 0,78 мм ID), используя съемник микропипетки устройство со следующими параметрами: давление воздуха 650; Нагрейте 999; Потяните 50; Скорость 80; Время 200.
  7. Подготовьте 1,5% раствора агара в голубой рыбы воды и вылить 25 мл расплавленного агара в 100 мм чашки Петри. На верхней части расплавленного агара, разместить домашние формы для того, чтобы запечатлеть конкретные каналы. "V" -образные каналы используются для эмбрионов позиции в то время как "U" -образные используются для яиц (рис 1) 31. После затвердевания удалить тщательно отпечаток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обложка агар с синей рыбы воды, чтобы избежать обезвоживания и магазин на 4 ° С в течение 2 месяцев.

figure-protocol-1 Рисунок 1. Позиционирование камеры для рыбок данио инъекций. (А) П-образные каналы для яиц (слева) и каналов V-образный для эмбрионов (правая панель). Рыбок данио яйца / эмбрионы положил в каналах и выровнены вдоль той же оси. (Б) Просмотр камер для микроскопического наблюдения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

2. Подготовка и Хранение М. abscessus Инокулят

  1. М. условия abscessus роста
    1. Пластина из М. abscessus из -80 ° С глицеринового исходного на агар Миддлбрук 7H10, содержащей 10% OADC и 0,5% глицерина (7H10 OADC) и с добавлением соответствующий антибиотик в зависимости от маркера устойчивости переносимого вектора, кодирующего флуоресцентный белок. Инкубируйте пластинпри 30 ° С в течение 4-5 дней.
    2. Поднимают микобактерий колонию флуоресценции-положительных и инокуляции 1 мл Миддлбрук 7H9 бульона с добавлением OADC, 0,2% глицерина, 0,05% Tween 80 (7H9 OADC / Т) с требуемой антибиотика в 15 мл стерильной пластиковой трубки. Инкубируют при 30 ° С в течение 1 недели без встряхивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Твин-80 ограничивает комков и бактериальной агрегации.
    3. Ресуспендируют предварительной культуры, полученной в 2.1.2 в 50 мл Миддлбрук 7H9 OADC / T в 150 см 2 колбу с тканевой культурой до конечного OD 600 0,1 (соответствует приблизительно 5,10 7 бактерий / мл) и инкубируют дополнительно при 30 ° С в течение 4 дней, чтобы получить экспоненциально растущей культуры (OD 600 = 0,6 до 0,8).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму образование комков, особенно грубого варианта, инкубации, не должно превышать 5 дней. Оба гладкие и шероховатые варианты отображения аналогичные темпы роста.
  2. Подготовка М. abscessus посевной60;
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за высокой склонности грубой М. abscessus с образованием больших агрегатов и производить кабели, специфического лечения необходимо сформировать однородную и количественно контролируемое инокулята до микроинъекций в эмбрионы. Эта процедура также применяется для сглаживания бактерий, продуцирующих агрегаты, хотя и в меньшей степени, чем грубой деформации.
    1. Урожай экспоненциально растущие культуры с 150 см 2 колбу с тканевой культурой центрифугированием при 4 000 мкг в течение 15 мин при комнатной температуре в 50 мл стерильной пластиковой трубки и ресуспендируют бактериальных гранул в 1 мл 7H9 OADC / T. Аликвоты по 200 мкл суспензии бактерий в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Работа с небольшими объемами по 1 мл шприцев необходимо получить очень однородные суспензии.
    2. Гомогенизации суспензий бактериальных с иглой 26-G (15 вверх и вниз-последовательности), ультразвук три раза в течение 10 сек (с 10 сек перерывах между друг ультразвуком себетельность), используя водяную баню ультразвукового. Добавить 1 мл 7H9 OADC / T и вихря кратко. Центрифуга 3 мин при 100 х г в.
    3. Осторожно собрать микобактерий, содержащих супернатантов, чтобы избежать глыбы и бассейн на однородные суспензии в 50 мл стерильной пластиковой трубки.
    4. Проверка визуально на наличие возможных бактериальных оставшихся агрегатов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если агрегаты по-прежнему присутствуют, переходите к дополнительной стадии центрифугирования при 100 мкг в течение 2 мин, и собрать супернатант.
    5. Центрифуга подвески на 4000 мкг в течение 5 мин, ресуспендируют осадок в 200 мкл 7H9 OADC / T и перейдите к инъекции.
    6. Оценка окончательного концентрации бактерий путем посева разведений (в 1 х PBST) на агаре 7H10 OADC и подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) после 4 дней инкубации при температуре 30 ° С. КОЕ должен быть определен для каждой новой партии.
    7. Подготовьте замороженные запасы инокулята при хранении 5 мкл аликвоты при -80 & #176; С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка КОЕ -80 ° С замороженных аликвот является предпосылкой для определения точного количества жизнеспособных бактерий, замораживания / оттаивания могут влиять бактериальной жизнеспособности посевного. Эти замороженные посевной готовы быть использованы для последующих инъекций. Поскольку все аликвоты содержат одинаковое количество КОЕ, они позволяют инъекционных бактерии воспроизводимым образом от одного эксперимента к другому.
  3. Контроль качества Инокулят
    Примечание: Циля-Нильсена окрашивание (специфичные для микобактерий) может быть использован для сравнения качества бактериальных суспензий до и после процедур, описанных в гомогенизации 2,2.
    1. Пятно и распространять одну каплю усредненной бактериальной суспензии на стекле и позволяют ему полностью высохнуть, исправить мазок, по крайней мере 30 мин на горячей плите, установленной в 65-70 ° С и пятно с использованием протокола окрашивания Циля-Нильсена ,
    2. Соблюдайте бактериальной мазок под микроскопом с использованием 100Х Цель и сравнить с мазок из необработанных бактериальной суспензии (Рисунок 2).

figure-protocol-2
Рисунок 2. Подготовка дисперсной М. abscessus посевной. Циля-Нильсена Окрашивание R или S варианты вырос на бульоне среды до какого-либо лечения (верхние панели) или после лечения (нижние панели), чтобы уменьшить размер и количество микобактерий агрегатов (последовательные этапы спринцевания, ультразвуком и декантации) , Бактерии были обнаружены с помощью микроскопа с 100 X APO нефти 1,4 Н.А. цель). Масштабные бары:. 20 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

3. Подготовка эмбрионов данио

  1. Нерест и сбор яиц данио
    1. Накануне сзалог, порода взрослых данио путем размещения 2 кобеля и 1 сука (обычно 2: 1 отношение позволяет оптимальную скорость оплодотворения) в племенной камеры, состоящий из отдельной аквариуме с сбора яиц корзине 31.
      ПРИМЕЧАНИЕ: сбор яиц корзины используются для защиты яйца от поедания родителями и облегчить сбор яиц.
    2. На 1 оплодотворения, урожай яйца и только правильно развитых эмбрионов в чашке Петри 100 мм, заполненную 25 мл голубого рыбы воды (максимум 100 эмбрионов на чашку) и держать их на 28,5 ° C. Номера оплодотворенные яйца отбрасываются.
  2. Подготовка эмбрионов данио для инъекций
    1. В 24 ч примерно после оплодотворения (ФВЧ), dechorionate эмбрионов с мелкими пинцетом в блюдо 100 мм Петри и держать их на 28,5 ° C.
    2. Соберите 30-48 часов после оплодотворения эмбрионы, используя пипетку и передавать их на "V" -образной позиционирования камеры, заполненной 25 мл воды, содержащей рыбы 270 мг / л Tricaine.Положите эмбрионов правильно в каналах с использованием самодельной microloader наконечник инструмента (домашнее обрезается микронаконечником погрузчик), оптимизированный для более легкого микро-манипуляции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ориентироваться спинной стороне вниз для внутривенных инъекций в хвостовую вену или спинной стороной вверх на хвост мышечных инъекций.

4. Микро-инъекции Процедура

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура микро-инъекции для М. abscessus аналогичен описанному ранее для М. Marinum инъекции 32. Для оценки хронологию М. предпочтительны инъекции в хвостовую вену 30 HPF эмбрионов abscessus инфекции (выживание, бактериальные нагрузки, кинетическая и характеристики инфекции) являются. Для визуализации набор иммунных клеток, инъекции делаются в локализованных сайтов, таких как в хвостовой мышцы 48 часов после оплодотворения эмбрион.

  1. Развести микобактерий прививочный в 1 X PBST (в зависимости от количества КОЕ ввводить как определено на этапе 2.2.6), содержащей 10% фенолового красного, чтобы проверить правильную инъекции.
  2. Загрузите впрыска микрокапиллярных иглу с 5-10 мкл бактериальной посевного использованием наконечник microloader, подключите микроинъекции иглу в держатель трехмерной микроманипулятора, подключенного к инжектору и разорвать верхнюю часть иглы с тонкой пинцетом, чтобы получить открытие диаметр 5-10 мкм.
  3. Калибровка объем впрыска, регулируя давление микроинъекции (20-50 гПа) и время (0,2 сек).
    Примечание: Требуемый объем впрыска калибруется визуального определения диаметра капли выбрасываются в желтке эмбриона.
  4. Для хвостового инъекции вены, положение эмбриона с вентральной стороной иглы (как описано в разделе 3.2.2) и поместить кончик иглы близко к мочеполовой открытия, ориентации хвостовой вены, и аккуратно вставьте кончик иглы в зародыше пока он не прокалывает caudаль вены область. Доставка нужного объема бактериального препарата, как правило, 1-3 NL, содержащей около 100 КОЕ / NL.
  5. Для внутримышечных инъекций, положение эмбриона с спинной стороной иглы (как в разделе 3.2.2), поместите иглу над одной сомита и придать небольшой объем (1 NL) посевного.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Что касается хвостовой вены инъекций, внутримышечных инфекции также сложно выполнить. Уход должны быть приняты, чтобы избежать перегрузки, которые могут травмировать окружающие ткани.
  6. В конце процедуры инъекции, контролировать размер инокулята путем инъекции то же количество бактериальной суспензии в капле стерильного PBST с последующим покрытие на 7H10 OADC и подсчета КОЕ. Около 100 эмбрионы могут быть введены с помощью иглы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за грубой М. abscessus может продолжать образовывать агрегаты в иглы, инъекции нужно делать сразу после приготовления инокулята.
  7. Перевести зараженные мксч индивидуально в 24-луночные планшеты, содержащие 2 мл / лунку рыбы воды и инкубируют при 28,5 ° С. Эмбрионы вводили 1-3 нл 1 X PBST может быть использован в качестве контроля.
  8. Правильное инфекция люминесцентных бактерий в эмбрионов контролируется с помощью флуоресцентного микроскопа.

5. Генерация макрофаг обедненного эмбрионов

ПРИМЕЧАНИЕ: Селективный истощение макрофагов из тканей используется, чтобы исследовать их вклад и роль в процессе инфекции. Для визуализации правильного истощение макрофагов, рекомендуется использовать трансгенную линию с люминесцентными макрофагов, где mCherry специфически экспрессируется под контролем макрофагов конкретного промотора mpeg1 19.

  1. Липо-клодронат основе процедуры
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура липосакции-клодронат позволяет селективное истощение макрофагов из тканей (но не нейтрофилов) 19. Это соединение не имеет ни изменить выживаемость эмбрионов, ни ФПлись на целостность бактерий. Подробный протокол для приготовления липосом инкапсулированные клодронат Ранее сообщалось 33.
    1. Через 24 часов после оплодотворения, dechorionate эмбрионов и передавать их на "V" -образной впрыска блюдо, наполненный водой рыбы с добавлением Tricaine для поддержания эмбрионов в наркозом состоянии до конца процедуры инъекции, как описано в 3.2.2. Ориентировать спинной стороне вниз.
    2. Загрузите микрокапилл иглу с липосом-инкапсулированного клодронат (липо-клодронатного), подключите микроинъекции иглу в держатель трехмерной микроманипулятора и разорвать верхнюю часть иглы с тонкой пинцетом, чтобы получить диаметр отверстия наконечника 10 мкм.
    3. Для калибровки объем впрыска, отрегулировать давление микроинъекции до 20 гПа и время впрыска до 0,2 сек. Поместите кончик иглы близко к мочеполовой открытия, ориентированных на хвостовой вены, и аккуратно вставьте кончик иглы вэмбрион, пока это только прокалывает хвостовой вены регион и доставить нужный объем раствора (2-3 NL, 3 раза).
      Примечание: липо-клодроната подвески очень липким и следует перемешать до инъекции, чтобы избежать блокировки сосудистую систему и убийства зародыша. Очень важно, чтобы перейти к несколько последовательных инъекций малых объемов.
    4. Трансфер эмбрионов в 100 мм чашки Петри, содержащие рыбий воды и держать их на 28,5 ° С до заражения.
    5. Управление надлежащего истощение макрофагов флуоресцентной микроскопии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полный истощение макрофагов является эффективным в течение 4 дней после липо-clodoronate администрации.
  2. Морфолино основе процедуры
    1. Накануне нереста, породы взрослых данио путем размещения 2 кобеля и 1 сука, отделенный пластиковой барьер в племенной камеры.
    2. На следующий день, ≈ 30 мин после этого включается свет в данио объекта, снимите барьер, отделяющийсамцы и самки. Подождите около 20 минут после начала нереста, чтобы оптимизировать скорость оплодотворения. Урожай яйца и замедлить их развитие путем передачи их в 100 мм чашки Петри с холодной голубой рыбы воды (4 ° C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Контроль нереста имеет решающее значение для экспериментов морфолины основе. Morpholinos может быть введен только в яйца до стадии четырех ячеек.
    3. Сбор яиц с помощью пипетки и хранение яйца вниз в "U" -образного литьевого камере, наполненной холодной водой голубой рыбы и блокировать яйца в каналах с помощью самодельной инструмент microloader наконечник.
    4. Подготовка PU.1 морфолино раствор, содержащий 10% фенолового красного, как описано выше 19. Загрузите впрыска микрокапиллярных иглу с препаратом морфолиногруппой и подключить микроинъекции иглу в держатель трехмерной микроманипулятора, то разорвать кончик иглы с мелкими пинцетом obtaiна открытие наконечник диаметром 5-10 мкм.
    5. Для калибровки объем впрыска, отрегулировать давление микроинъекции в 20-50 гПа и время впрыска до 0,2 сек. Поместите кончик иглы близко к яйцо и аккуратно нажмите кончик иглы через хориона в яйцо и доставить нужный объем морфолино решение, как правило, 3-5 NL.
    6. После микро-инъекции, передача яйца в 100 мм чашки Петри в воде рыбы и инкубировать на 28,5 ° С до начала процедуры инфекция.
    7. Анализ надлежащего (полное) истощение макрофагов в Pu.1 морфантов по флуоресцентной микроскопии на 30 до 48 часов после оплодотворения..
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от концентрации введенного р U.1 морфолины также может повлиять на количество ранних нейтрофилов. Для подтверждения правильности истощение макрофагов без изменения числа нейтрофилов, рекомендуется использовать двойной трансгенной линии данио с люминесцентными макрофагов и нейтрофилов (с GFPВыражение специально обусловлено мегапиксельная промоутер) 19.

6. Бактериальный Бремя Количественное

  1. Определение от КОЕ перечисления
    1. В нужной точке времени, собирать группы инфицированного эмбриона (5 за условий) в 1,5 мл микропробирок (1 эмбрион / трубка), крио-анестезии эмбрионов путем инкубации на льду в течение 10 мин и усыпить с помощью передозировки Tricaine (300- 500 мг / л)
    2. Промыть эмбрионы стерильной водой дважды и обойтись их в новую пробирку, лизируют друг эмбриона с 2% Тритона Х-100 растворяют в 1 X PBST с помощью иглы 26-G и гомогенизируют суспензию до полного лизиса. Центрифуга подвески и ресуспендируют осадок в 1 X PBST с 0,05% Tween 80. Серийные разведения гомогенатов высевают на Middlebrook 7H10 OADC и дополнены BBL MGIT Panta, как рекомендовано поставщиком.
      ПРИМЕЧАНИЕ: М. abscessus быть более восприимчивы к NaOH ЛЕЧЕНИИт, чем М. Marinum, обеззараживание рыбы лизатов, не затрагивая М. abscessus рост может быть успешно решена с помощью антибиотиков BBL коктейль MGIT PANTA.
    3. Инкубируйте пластин в течение 4 дней при 30 ° С и количества колоний.
  2. Определение с помощью флуоресцентной Pixel Count (FPC) измерения в живых эмбрионов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения бактериальной нагрузки через флуоресценции, серийные изображения инфицированных эмбрионов приобретаются и интенсивность флуоресценции измеряют FPC (идентификации бактерий с помощью анализа частиц) с помощью самодельной макрос разработанный для ImageJ бесплатно. Анализ частиц требует бинарный черно-белое изображение, что полагается на пороговом диапазоне, что позволяет различать флуоресцентный сигнал интереса от фона.
    1. В нужной точке времени, tricain-обезболить инфицированные эмбрионов (5-10 состоянии) в 35 мм чашках Петри, как описано в 3.2.2.
    2. Удалить воду и submeRGE эмбрионы и вся поверхность тарелки с 1% легкоплавкой агарозе в рыбе воды, а затем в поперечном направлении выравнивания эмбрионов. Обложка затвердевшей агарозы с рыбой вода, содержащая Tricaine.
    3. Приобретать флуоресцентные изображения эмбриона всего с использованием эпифлуоресцентной микроскоп с 10 X цели.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приобретение флуоресценции изображение является важным шагом в процедуре измерения FPC. Важно использовать калиброванную монитор с цветовой калибровки зонда. Регулировка оптимальное время воздействия для получения минимального фон во время приобретения предотвращает насыщение сигнала. Изображения должны быть в формате TIFF с 8-битной. Идентичные параметры хранятся в течение всего эксперимента количественных целей.
    4. Осторожно снять агарозы из эмбрионов с самодельным инструментом microloader наконечника. Эти эмбрионы могут быть использованы для последующих анализов при необходимости. До количественного определения бактериальной нагрузки, каждая фотография должна быть под контролем качества. До Аnalyze изображения и конвертировать интенсивность флуоресценции в FPC на рыбу, открыть распространяемое ImageJ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значение FPC отражает бактериальный бремя, как показано ранее, используя М. Marinum 34.
    5. Определить требуемое пороговое значение для анализа изображений с использованием изображения из неинфицированных эмбриона (эмбрионов несколько управления могут быть использованы для получения среднего порога). Перейти к Image Adjust → → Порог, а затем переместите ползунок в нижней пороговой окне справа, пока фон не станет полностью черным (т.е., чтобы получить фон должен быть на нуле). Запишите соответствующее значение.
    6. В Image J, откройте макрос FPC (дополнительная файл) и следуйте инструкциям: Найдите папку изображений, которые будут измерены и затем введите пороговое значение, как определено ранее, и нажмите кнопку «ОК».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Макрос автоматически вычитает фон. Порог затем применяется. Флуоресцентные сигналы идентифицируютсяFied после анализа частиц.
    7. Скопируйте и вставьте данные из сводной окна нужного программного обеспечения для анализа данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от метода определения КОЕ, метод FPC является неинвазивным и позволяет повторно использовать эмбрионы для последующих анализов и, что важно, мониторинга динамики / Кинетика бактериального нагрузки на индивидуальной основе. Это, следовательно, позволяет значительно сократить количество животных, в соответствии с этическими правилами.

7. М. изображений abscessus- инфицированных Эмбрионы

  1. Живая изображений М. abscessus инфекции
    1. Крепление Tricaine анестезировали эмбрионы (см 3.2.2) в 1% легкоплавкой агарозе в 35 мм чашки Петри до эпифлуоресцентной микроскопии наблюдений. Используйте нижнюю тарелку стекла для перевернутой конфокальной микроскопии или в одном полости депрессия горкой для вертикально конфокальной микроскопии. Ориентировать эмбриона в требуемое положение и крышкойзатвердевший агарозы с рыбой вода, содержащая Tricaine.
    2. Используйте эпифлуоресцентной микроскоп с 10 X цель для последовательных приобретения и передачи флуоресценции изображений всего эмбриона. Кроме того, использование конфокальной микроскопии с 40X или 63X целей визуализировать активность иммунных клеток после заражения.
  2. Изображений фиксированной М. abscessus инфицированных эмбрионов
    1. Эвтаназии эмбрионов, как описано в 6.1.1, и передавать их на 1,5 мл микро-центрифужные пробирки и фиксируют в 4 эмбрионов% параформальдегидом в 1 X 2 PBST для ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С. Удалить параформальдегида путем промывки эмбрионов дважды 1 X PBST в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сохранить флуоресценции, фиксированные эмбрионы должны быть защищены от света.
    2. Для сохранения целостности тканей и флуоресценции, эмбрионы инкубировали последовательно в увеличении концентрации глицерина решения (10, 20, 30, 40 и 50%, разведенного в 1 X PBST) для10 мин на состоянии.
      Примечание: Фиксированный эмбрионы могут быть сохранены в течение нескольких месяцев в 50% глицерине при 4 ° С.
    3. Положите зародыш встроенный в 50% глицерина в смотровой камере (рис 1B) 31.
    4. Изображение с помощью 40x 63x или целей на конфокальной микроскопии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя различные анатомические участки могут быть введены 32, хвостовой вены инъекции часто используется для генерации системной инфекции для последующих анализов в том числе экспериментов выживания, определение бактериального бремени, фагоцитоза деятельности или формирования мозга. Инъекции в хвостовой мышц используются для оценки набора макрофагов в месте инъекции (рис 3а). Для исследования и сравнения вирулентности R и S вариантов М. abscessus, флуоресцентные бактериальные суспензии...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данио недавно появились в качестве отличной позвоночных модельной системы для изучения динамики бактериальной инфекции с помощью широкое поле и конфокальной микроскопии в режиме реального времени 36. Сочетание дисперсных микобактерий суспензий (протокол 2.2) вместе с методами микро-инъекций (протокол 4) позволяет воспроизводимые системные инфекции, и последующий контроль и визуализацию прогрессирования инфекции с особым акцентом на бактериальных взаимодействий с принимающими макрофагов. Вирулентность М. a...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарны К. Kissa за полезные обсуждения и для обеспечения Липо-клодронат и Л. Ramakrishnan для щедрый дар pTEC27 и pTEC15, что позволит выражение tdTomato и Васаби, соответственно. Эта работа является частью проектов Национального агентства исследований Франции (ANR ZebraFlam-10-MIDI-009 и DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) и Седьмой рамочной программе Европейского Сообщества (FP7-PEOPLE-2011-ITN) под грантового соглашения нет. PITN-ГА-2011-289209 для Мари Кюри Начальное обучение сети FishForPharma. Мы хотели бы также поблагодарить ассоциации Лемаршаль и Vaincre La Mucoviscidose (RF20130500835) для финансирования CM Дюпона.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BBL MGIT PANTABD Biosciences245114
Бычья сыворотка альбумин Euromedex04-100-811-E
Каталаза из бычьей печени Sigma-AldrichC40
Difco Middlebrook 7H10 AgarBD Biosciences262710
Difco Middlebrook 7H9 BrothBD Biosciences271310
Этил3-аминобензоат метансульфонат соль (трикаин)Sigma-AldrichA5040
Олеиновая кислотаSigma-AldrichO1008
Параформальдегиддельта Microscopie15710
Фенол красныйSigma-Aldrich319244
Твин 80Sigma-AldrichP4780
АгарGibco Life Technologie30391-023
Низкоплавкая агарозаSigma-Aldrich
Instant Ocean Sea Salts Aquarium Systems Inc
Капилляры из боросиликатного стекла Sutter instrument IncBF100-78-10Внешний диаметр 1 мм Внешний диаметр X Внутренний диаметр 0,78 мм
Устройство для вытягивания микропипеток Sutter Instrument IncFlamming/Brown Micropipette Puller p-87
МикроинъекторTritech Research Цифровой микроинжектор, минж-д
ПинцетSciences Tools incDumont # M5S 
Наконечники для микрозагрузчиковEppendorf

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brown-Elliott, B. A., Wallace, R. J. Clinical and taxonomic status of pathogenic nonpigmented or late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 716-746 (2002).
  2. Aitken, M. L., Limaye, A., et al. Respiratory outbreak of Mycobacterium abscessus subspecies massiliense in a lung transplant and cystic fibrosis center. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 185 (2), 231-232 (2012).
  3. Gilljam, M., Lindblad, A., Ridell, M., Wold, A. E., Welinder-Olsson, C. Molecular epidemiology of Mycobacterium abscessus, with focus on cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1497-1504 (2007).
  4. Roux, A. -L., Catherinot, E., et al. Multicenter study of prevalence of nontuberculous mycobacteria in patients with cystic fibrosis in France. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4124-4128 (2009).
  5. Lee, M. -R., Cheng, A., et al. CNS infections caused by Mycobacterium abscessus complex: clinical features and antimicrobial susceptibilities of isolates. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (1), 222-225 (2012).
  6. Talati, N. J., Rouphael, N., Kuppalli, K., Franco-Paredes, C. Spectrum of CNS disease caused by rapidly growing mycobacteria. The Lancet Infectious Diseases. 8 (6), 390-398 (2008).
  7. Medjahed, H., Gaillard, J. -L., Reyrat, J. -M. Mycobacterium abscessus: a new player in the mycobacterial field. Trends in Microbiology. 18 (3), 117-123 (2010).
  8. Griffith, D. E., Girard, W. M., Wallace, R. J. Clinical features of pulmonary disease caused by rapidly growing mycobacteria. An analysis of 154 patients. The American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1271-1278 (1993).
  9. Nessar, R., Cambau, E., Reyrat, J. M., Murray, A., Gicquel, B. Mycobacterium abscessus: a new antibiotic nightmare. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (4), 810-818 (2012).
  10. Sanguinetti, M., Ardito, F., et al. Fatal pulmonary infection due to multidrug-resistant Mycobacterium abscessus a patient with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 39 (2), 816-819 (2001).
  11. Griffith, D. E., Aksamit, T., et al. An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 175 (4), 367-416 (2007).
  12. Howard, S. T., Rhoades, E., et al. Spontaneous reversion of Mycobacterium abscessus a smooth to a rough morphotype is associated with reduced expression of glycopeptidolipid and reacquisition of an invasive phenotype. Microbiology (Reading, England). 152 (Pt 6), 1581-1590 (2006).
  13. Chardi, A., Olivares, F., Byrd, T. F., Julián, E., Brambilla, C., Luquin, M. Demonstration of cord formation by rough Mycobacterium abscessus variants: implications for the clinical microbiology laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 49 (6), 2293-2295 (2011).
  14. Byrd, T. F., Lyons, C. R. Preliminary characterization of a Mycobacterium abscessus mutant in human and murine models of infection. Infection and Immunity. 67 (9), 4700-4707 (1999).
  15. Catherinot, E., Clarissou, J., et al. Hypervariance of a rough variant of the Mycobacterium abscessus type strain. Infection and Immunity. 75 (2), 1055-1058 (2007).
  16. Catherinot, E., Roux, A. -L., et al. Acute respiratory failure involving an R variant of Mycobacterium abscessus. Journal of Clinical Microbiology. 47 (1), 271-274 (2009).
  17. Bernut, A., Le Moigne, V., Lesne, T., Lutfalla, G., Herrmann, J. -L., Kremer, L. In vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium abscessus using the embryonic zebrafish test system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (7), 4054-4063 (2014).
  18. Oh, C. -T., Moon, C., Jeong, M. S., Kwon, S. -H., Jang, J. Drosophila melanogaster for Mycobacterium abscessus infection. Microbes and Infection / Institut Pasteur. 15 (12), 788-795 (2013).
  19. Bernut, A., Herrmann, J. -L., et al. Mycobacterium abscessus cording prevents phagocytosis and promotes abscess formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), E943-E952 (2014).
  20. Dubée, V., Bernut, A., et al. β-Lactamase inhibition by avibactam in Mycobacterium abscessus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (4), 1051-1058 (2015).
  21. Torraca, V., Masud, S., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Macrophage-pathogen interactions in infectious diseases: new therapeutic insights from the zebrafish host model. Disease Models Mechanisms. 7 (7), 785-797 (2014).
  22. Alibaud, L., Rombouts, Y., et al. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Molecular Microbiology. 80 (4), 919-934 (2011).
  23. Clay, H., Volkman, H. E., Ramakrishnan, L. Tumor necrosis factor signaling mediates resistance to mycobacteria by inhibiting bacterial growth and macrophage death. Immunity. 29 (2), 283-294 (2008).
  24. Palha, N., Guivel-Benhassine, F., et al. Real-time whole-body visualization of Chikungunya Virus infection and host interferon response in zebrafish. PLoS pathogens. 9 (9), e1003619(2013).
  25. Mostowy, S., Boucontet, L., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS pathogens. 9 (9), e1003588(2013).
  26. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10 (11), 2312-2325 (2008).
  27. Van der Sar, A. M., Appelmelk, B. J., Vandenbroucke-Grauls, C. M. J. E., Bitter, W. A star with stripes: zebrafish as an infection model. Trends in Microbiology. 12 (10), 451-457 (2004).
  28. Vergunst, A. C., Meijer, A. H., Renshaw, S. A., O’Callaghan, D. Burkholderia cenocepacia creates an intramacrophage replication niche in zebrafish embryos, followed by bacterial dissemination and establishment of systemic infection. Infection and Immunity. 78 (4), 1495-1508 (2010).
  29. Levraud, J. -P., Disson, O., et al. Real-time observation of Listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae. Infection and Immunity. 77 (9), 3651-3660 (2009).
  30. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
  31. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
  32. Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781(2012).
  33. Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 83-93 (1994).
  34. Adams, K. N., Takaki, K., et al. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145 (1), 39-53 (2011).
  35. Ramakrishnan, L. Looking within the zebrafish to understand the tuberculous granuloma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 783, 251-266 (2013).
  36. Davis, J. M., Clay, H., Lewis, J. L., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of Mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  37. Lamason, R. L., Mohideen, M. -A. P. K., et al. SLC24A5, a putative cation exchanger, affects pigmentation in zebrafish and humans. Science (New York, NY). 310 (5755), 1782-1786 (2005).
  38. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  39. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC developmental biology. 7, 42(2007).
  40. Takaki, K., Davis, J. M., Winglee, K., Ramakrishnan, L. Evaluation of the pathogenesis and treatment of Mycobacterium marinum in zebrafish. Nature Protocols. 8 (6), 1114-1124 (2013).
  41. Stoop, E. J. M., Schipper, T., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Models Mechanisms. 4 (4), 526-536 (2011).
  42. Carvalho, R., de Sonneville, J., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PloS One. 6 (2), e16779(2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mycobacterium abscessusZebrafish EmbryosIntravenous InjectionFluorescence MicroscopyConfocal MicroscopyMacrophage DepletionBacterial Inoculum PreparationCording FormationHost Pathogen InteractionVirulence Comparison

Related Articles