Method Article

Трехмерная Количественное дендритных шипиков пирамидальных нейронов из производных человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

DOI:

10.3791/53197

⸱

October 10th, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Human Genetics and Cognitive Functions, Institut Pasteur, 2CNRS URA 2182 'Genes, synapses and cognition', Institut Pasteur, 3Human Genetics and Cognitive Functions, Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, 4Plateforme d' Imagerie Dynamique, Imagopole, CiTech, Institut Pasteur, 5Neuroplasticity and Therapeutics, CECS, I-STEM, AFM, Evry

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дендритных шипиков пирамидальных нейронов сайты большинства возбуждающих синапсов в коре головного мозга млекопитающих. Этот метод описан 3D количественный анализ позвоночника морфологии в корковых нейронов пирамидальной глутаматэргических человека, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дендритные шипы небольшие выступы, соответствующие постсинаптических отсеков возбуждающих синапсов в центральной нервной системе. Они распределены по дендритов. Их морфология во многом зависит от активности нейронов, и они являются динамическими. Дендритных шипиков выразить глутаматергические рецепторы (АМРА и NMDA рецепторы) на их поверхности и на уровне постсинаптической плотности. Каждый позвоночника позволяет нейрон контролировать его состояние и местного деятельность самостоятельно. Позвоночник морфологии были тщательно изучены в глутаматергических пирамидальных клеток коры головного мозга, с помощью обоих подходов в естественных условиях и нейронные культуры, полученные из тканей грызунов. Нейропатологическое условия могут быть связаны с измененной позвоночника индукции и созревания, как показано на грызунах, культивируемых нейронов и одномерная количественного анализа 1. Настоящее исследование описывает протокол для 3D количественного анализа морфологии позвоночника с использованием человеческой corticаль нейроны, полученные из нервных стволовых клеток (в конце корковых клеток-предшественников). Эти клетки были первоначально получены из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Этот протокол позволяет проводить анализ позвоночника морфологии в разные периоды культуры, и с возможностью сравнения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из контрольных лиц с данными, полученными от пациентов с психиатрических заболеваний.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дендритных шипиков корковых пирамидных нейронов являются малые и тонкие выступы, которые распределены вдоль базальных и апикальных дендритов этих нейронов подтипов грызунов, приматов и человека мозг. Они сайты большинства возбуждающих синапсов и отображать ключевые функции в обучении и когнитивных процессов. Подробные структуры дендритных шипиков человека были технически изучал с помощью электронного микроскопа 2. Тем не менее, такой подход требует много времени и представляет большую нагрузку. Совсем недавно, трехмерное (3D) реконструкция морфологии дендритных шипов было сообщено в человеческой коры головного мозга с помощью специального программного обеспечения в сочетании с большой ручной анализ позвоночника 3.

Зеленый флуоресцентный белок (GFP), технологии в сочетании с иммунофлуоресценции представляет собой точный инструмент для идентификации позвоночника и измерения формы флуоресцентной микроскопией. Этот подход может быть легко наносится на культивируемых нейронах. Хоувер, никакие данные не были зарегистрированы на анализе позвоночника созревания и морфологии на человека нейронов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК).

Целью данного исследования было описать протокол, который позволяет дендритных позвоночника изображений из культивированных человеческих нейронов в пробирке. GFP маркировки, конфокальной микроскопии и 3D анализ с помощью модуля нити Tracer программного обеспечения Imaris были использованы в настоящем протоколе. Культура шаги, которые необходимы для получения корковых нейронов глутаматергические слоев II к IV от нервных стволовых клеток (НСК), также кратко описаны здесь. Вся протокол для производства человеческого НСК уже были опубликованы ранее 4.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. нейронов Культура

Примечание: фибробластов Перепрограммирование плюрипотентных стволовых клеток, приверженность спинной конечного мозга родословной, выводе, усиления и банковской поздних предшественников корковых (LCP) были описаны в Boissart др 4. Нейронов дифференциация LCP-подобных клеток также была проведена в соответствии с Boissart др 4 с незначительными изменениями. Другие процедуры были разработаны для прямого перепрограммирования фибробластов в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки с последующим их дифференцировки в нейроны. Этот протокол был сохранен, так как он позволяет селективное образование пирамидальных нейронов глутаматэргических.

  1. Лечить культуры пластины 6-а с покровные стекла с поли-орнитин (разбавленной до 1/6 в DPBS, фондовые концентрации 0,01%) О / N, с последующим тремя промывками в DPBS. Затем добавить ламинин (концентрация акций 1 мг / мл, разбавленный в 500 раз в DPBS), по крайней мере 10 часов под капотом потока ,
  2. Плиты и направить NSC при низкой плотности (50000 клеток / см 2) в культуральных планшетах 6-луночных с покровные стекла в 3 мл культуральной среды, состоящей из DMEM / F12 (500 мл), 2 флакона (5 мл каждого) из N2 добавки, 2 флакона (10 мл каждая) B27 добавки 10 мл Pen-стрептомицина (пенициллин = 10000 единиц / мл и стрептомицин = 10000 единиц / мл) 1 мл 2-меркаптоэтанола (Исходный раствор: 50 мМ) и ламинин (1 / 500), без ростовых факторов. Важным шагом: Выполните этот шаг тщательно, добавив клетки с медленными движениями, вращающиеся в целях сокращения клеток кластеризации.
  3. Удалить культуральной среды. Добавить свежую среду, содержащую N2B27 2 мкг / мл свежего раствора ламинин, чтобы нейрон, прикрепленный на покровные стекла и избежать образования комков. Изменение среды каждые 3 дня. Сохранить некоторые из оставшихся среде (200 мкл) перед добавлением свежей среды для того, чтобы предотвратить клетки от высыхания. Кроме того, протекают быстро и изменить общий объем (3 мл).
e_title "> 2. Лентивирусов Трансдукция

Примечание: GFP лентивирусов векторов были любезно предоставлены доктором Уве Maskos лаборатории в Институте Пастера (Париж) и подготовлены в соответствии с опубликованным протоколом 5. Выражение GFP движет мышь фосфоглицераткиназы (PGK) промотора. Для этого исследования, титра вируса в 400 нг / мкл (маточного раствора в PBS 1X).

  1. Трансдукции человека Ipsc-производные нейроны на любой стадии созревания по вирусных частиц добавлением 1 мкл исходного раствора, содержащего 40 нг GFP лентивирусов вектор в культуре также (6-луночных планшетах) и инкубируют в течение 48 ч в свежей культуральной средой. Примечание: для этого протокола, продолжительность инкубации позволяет хорошо маркировки позвоночника структур.

3. Иммунофлуоресценции

Примечание: Для того чтобы улучшить маркировку всего позвоночника морфологии, иммунофлюоресценции маркировки проводили с использованием антитела против GFP в проницаемыми условиях.

  1. Удалить культуральную среду и исправить трансдуцированных клеток на покровных стеклах в 4% параформальдегид в течение 10 мин при комнатной температуре, затем промывают 3 раза в PBS 1x (10 мин каждый).
  2. Immerge покровные в ФСБ с добавлением 0,05% Тритона (100x) и 10% лошадиной сывороткой в ​​течение 1 часа при комнатной температуре, затем промывают 3 раза в PBS 1x.
  3. Добавить 100 мкл 1x ФБР с добавкой 4% лошадиной сыворотки и антитела (первичного 1/1000), выработанном против GFP и разбавленного в 1000 раз на каждой покровное. Инкубируют в темноте коробки O / N при 4 ° С, затем промыть 3 раза 1x PBS.
  4. Развести Alexa Fluor 488-конъюгированного антитела (1/200) в ФБР с добавкой 0,5% Tween 20 и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем промыть 3 раза в 1x PBS и смонтировать покровные на стеклах с монтажной среду для флуоресцентной микроскопии.

4. дендритных позвоночника изображений

  1. Выполните конфокальной микроскопии через конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
  2. Выберите здоровые нейроны с пирамидальной морфологии ай полный дендритных разветвление, и количественно, по крайней мере 10 нейронов за состоянием из отдельных экспериментов. Количественно 60 - 100 мкм за дендритов.
  3. Получение изображений с помощью масла 40X NA = 1.3 Цель и 488 нм лазерный луч для возбуждения GFP, с типичной пиковой мощности на уровне образца около 20 мкВт. Набор размер пикселя около 80 нм правильно отведать дендритных шипиков.
    Примечание: последующий вызов для анализа изображения, в котором шум не скомпрометировать надлежащее сегментации дендритов и шипами. С пространственных отбора проб и силовых установок, упомянутых выше, мы обнаружили, что пиксель выдержки времени 3,15 мкс из достаточно, чтобы собрать достаточное количество фотонов, чтобы построить такой образ. Для тусклых образцов, качество изображения может быть улучшена путем усреднения от 2 до 4 сканирования. Приобретение нескольких XY плитки могут быть необходимы, чтобы покрыть область интереса, который затем должен быть нашит вместе перед обработкой.
  4. Для выборки весь объем нейронов, приобретают Z-Stack, сАг расстояние между диапазоне от 150 нм до 300 нм, получая от 20 до 30 Z ломтики.
    Примечание: Боковая пространственное разрешение достигается с этими настройками составляет 234 нм, а осевое разрешение 591 нм. Выборка выбраны здесь достаточен, но, как осевое разрешение больше, чем наименьший размер шипов для включения в образ, анализ способствует шипы, которые простираются в поперечном направлении от дендритов.

5. 3D Количественное дендритных шипиков

Примечание: В следующих разделах специально описывают использование программного обеспечения Imaris для анализа. Существуют альтернативные реализации, в том числе NeuronStudio 15 или Metamorph 8, который может обеспечить аналогичные результаты.

Используйте следующие основные параметры:

  1. В стадии предварительной обработки, используйте Gaussian фильтрации через терминалы обработки изображений, предлагаемых программным обеспечением. Выполните Gaussian фильтрацию с помощью обработки изображения> Smooвещь> Gaussian фильтр. Установите ширину фильтра будет равен размеру пикселя в XY.
  2. Выполните Полу-автоматическое отслеживание дендритов, с помощью модуля накаливания Tracer программного обеспечения.
    1. Во-первых, оценить дендритов диаметр, с помощью дистанционного инструмента в закладке кусок программного обеспечения.
    2. На вкладке превзойти, щелкните на инструменте нитей. Для лучшего надежности, этот протокол основывается на полу-автоматического отслеживания; нажмите на автоматическое создание Skip. Интерфейсный модуль теперь показывает вкладку Draw. Здесь выбора AutoPath как метод, Dendrite как тип и вход расчетное диаметра дендритов.
    3. Используйте режим выбора указателя, поворотом курсор в окне. Shift-правой кнопкой мыши на дендрит отправной точки. Примечание: программное обеспечение выполняет начальные расчеты.
    4. Наведите указатель вдоль дендритов. От начальной точки (представлятьред как голубой шар), желтая линия, представляющая наиболее вероятный путь дендритов показано. Shift-щелкните левой кнопкой мыши на дендритов конечной точки.
  3. Выполните автоматическую шипами сегментации. Примечание: шипы на трассируемого дендритов находятся автоматически с помощью интерфейса модуля.
    1. В интерфейсе модуля, нажмите на вкладке Создание. В Перестроить выпадающего списка, выберите Rebuild дендритов диаметр и установите флажок сохранить данные. Затем нажмите Rebuild.
    2. Установите порог таким образом, чтобы сегментированный объем соответствует фактическому объему дендритов. Как алгоритм, выберите наименьшее расстояние от Расстояние карту. Нажмите кнопку Далее.
    3. Определить наименьший диаметр позвоночника и головы максимальную длину, опять с помощью дистанционного инструмента в закладке кусок программного обеспечения, а затем вернуться на вкладку превзойти и введите параметры. Fили этот протокол, значения около 200 - 300 нм для минимального диаметра и 4 мкм для максимальной длины хорошие отправные точки. Не проверять Разрешить Отрасль шипами окно. Нажмите кнопку Далее.
    4. Отрегулируйте порог семян Очки так, что синие точки, представляющие колючки локализуются в фактических руководителей позвоночника. Нажмите кнопку Далее. Примечание: Расчет ядро ​​делается сейчас и может быть длительным.
  4. Оцените колючки, перейдя на вкладку Tools интерфейса модуля. Нажмите на Classify Шипы. В посещение пользовательского интерфейса, убедитесь, что существует четыре класса, определяемые их морфологии следующим образом: Stubby: длина <1 мкм; Гриб: Длина (позвоночника)> 3 и Максимальная ширина (головка)> означает, ширина (шея) х 2; Длинные тонкие: Среднее ширина (головка) ≥ Среднее ширина (шея); Филоподий, как: длина ≤ 4 мкм (без головы).
    Примечание: МОИнтерфейс Dule генерирует четыре новых объектов накаливания, содержащие результаты классификации.
  5. Экспорт Статистические данные: на любом из этих четырех интерфейсов объектов, перейдите на вкладку Статистика.
    Нажмите на экспорт всех статистике кнопку в файл.
    Примечание: Другие статистические значения могут быть экспортированы для дендритов (. Например, длина, площадь, средний диаметр, глубина филиал, угол ветвления, громкость, и т.д..), А для шипов (например, прямолинейность, площадь крепления, длины и объема отличаются позвоночник части, диаметр позвоночника, плотность и т.д.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящее исследование описывает стандартный протокол для позвоночника количественного культивируемых дендритов пирамидальных нейронов, полученных из IPSC. Этот протокол позволяет проводить анализ позвоночника созревания на человека нейронов и его возможного сравнению с созреванием шипов в стандартных культурах грызунов нейронных а также в естественных условиях в животных моделях.

1А представляет собой схему различных этапов культуры, которые позволяют производство ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Количественное определение морфологических особенностей пирамидальных нейронов полагаются на программное обеспечение. Интерфейс нити Tracer был использован для сегментации нейронов и шипов, и модуль XT был использован для их анализа.

Для анализа точности нашей техники, мы впервые сравнили измеряемые параметры морфологические (длина, площадь, объем и общая позвоночника, когда это применимо), с теми, опубликованные с помощью крыс зрелые нейроны в культуре пирамидальные 6, 7 и тканях...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была профинансирована Институтом Пастера, Фондом Бетанкура-Шюллера, Национальным центром научных исследований, Университетом Париж Дидро, Национальным агентством исследований (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), благотворительный фонд Conny-Maeva, фонд Cognacq Jay, фонд Orange и фонд Fondamental. Л.Г. получает стипендию для студентов бакалавриата от Министерства здравоохранения. Мы признательны за помощь компании BitPlane, в частности Georgia Golfis, на ранней стадии этой работы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
D-PBS (1x), без кальция, магния и фенола RedGibco/ Life Technologies14190169
раствор поли-L-орнитина БиореагентSigma AldrichP4957
Мышиный ламининDutscher Dominique354232
N2 ДобавкаGibco/ Life Technologies17502048
B-27 Добавка без витамина A (50 крат)Gibco/ Life Technologies12587010
DMEM/NUT. MIX F-12 W/GLUT-IGibco/ Life Technologies31331028
Neurobasal Med SFMGibco/ Life Technologies21103049
2-меркаптоэтанолGibco/ Life Technologies31350-010
Пенициллин-стептомицинGibco/ Life Technologies15140-122
GFP Сыворотка кролика Поликлональные антителаGibco/ Life TechnologiesA-6455
Сыворотка для лошадейGibco/ Life Technologies16050130
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit;Gibco/ Life TechnologiesA11034
Поликлональное антитело к бета-бетаIII тубулинуMilliporeAB9354
Покровное стекло 13 ммVWR631-0150
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPIGibco/ Life TechnologiesP36931
Tween(R) 20 Bioextra, вязкая жидкостьSigma Aldrich ChimieP7949
Triton X-100Sigma Aldrich ChimieX100-100ML
Фибробласты человекаБиорепозиторий клеточной линии Coriell GM4603 и GM 1869Институт медицинских исследований Кориелла, Камден, Нью-Джерси, США
Конфокальный лазерный сканирующий микроскопZeiss (Германия)LSM 700
Imaris SoftwareBitplane AG, Цюрихверсия 6.4.0модули Filament Tracer и Imaris XT
Программное обеспечение Huygensпрограммное обеспечение Huygens, SVI, НидерландыВерсия ProОпционально (для испытаний на деконволюцию)
Требуются

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).
  2. Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. Non-synaptic dendritic spines in neocortex. Neuroscience. 145, 464-469 (2007).
  3. Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions. Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).
  4. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).
  5. Avale, M. E., et al. Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion. Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).
  6. Xie, Z., et al. Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7. Journal of Neuroscience. 28 (24), 6079-6091 (2008).
  7. Srivastava, D. P., et al. Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone. Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35964-35974 (2012).
  8. Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons. Journal of Visualized Experiments. (53), e2794(2011).
  9. Brennand, K. J., Gage, F. H. Modeling psychiatric disorders through reprogramming. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 26-32 (2012).
  10. Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).
  11. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
  12. Stein, J. L., et al. Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells. Neuron. 83, 69-86 (2014).
  13. Sivapatham, R., Zheng, X. Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling. Methods in Molecular Biology. , (2014).
  14. Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).
  15. Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (4), e1997(2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Dendritic Spine QuantificationHuman Induced Pluripotent Stem CellsConfocal Microscopy Imaging3D Spine AnalysisNeural Stem Cell DifferentiationGFP Lentivirus TransductionAnti GFP Antibody StainingDendritic Spine MorphologyGlutamatergic Neuron CultureSpine Density Measurement

Related Articles