Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Роман Культура модель человека плюрипотентных стволовых клеток Распространение на Желатин в Плацента-баром СМИ

7.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53204

⸱

3 августа 2015 г.

 , 
1Department of Biomedical Science, Graduate School of Medicine, Korea University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол обеспечивает простой и эффективный способ размножения человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) с использованием только кондиционированных сред, полученных из человеческой плаценты, в чашке, покрытой желатином, без дополнительных экзогенных добавок или специфических для hPSC синтетических субстратов.

Аннотация

Размножение плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs) в кондиционированной среде, полученной из клеток человека, в условиях культивирования без фидеров представляет интерес. Тем не менее, идеальный гуманизированный метод размножения без фидеров ex vivo для ПСК не разработан; В настоящее время во все питательные среды добавляют дополнительные экзогенные субстраты, включая основной фактор роста фибробластов (bFGF), основной фактор, поддерживающий hPSC, а во всех культурах, не содержащих питательных веществ, используются синтетические субстраты, такие как Матригель или ламинин. Недавно наша группа разработала простой и эффективный протокол для размножения hPSCs с использованием только кондиционированной среды, полученной из человеческой плаценты, на чашке, покрытой желатином, без дополнительных экзогенных добавок или синтетических субстратов, специфичных для hPSCs. Об этом протоколе ранее не сообщалось, и он может позволить исследователям эффективно размножать hPSCs в условиях гуманизированных культур. Кроме того, эта модель устраняет риски заражения hPSC продуктами животного происхождения, такими как вирусы или неизвестные белки. Кроме того, эта система облегчает массовое производство hPSC с использованием желатинового покрытия, которое простое в обращении, значительно снижает общие затраты на обслуживание hPSC ex vivo.

Введение

Целью этого протокола является размножение человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs), включая человеческие эмбриональные стволовые клетки (hESCs) и человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) в полностью гуманизированных ex vivo условиях без фидеров, не требуя дополнительных экзогенных добавок и синтетических субстратов. На сегодняшний день разработка моделей культур hPSC ex vivo, которые позволяют внедрять продукты культивирования в клинику, является одной из основных проблем в исследованиях стволовых клеток. В частности, необходимо решить две важнейшие проблемы. Во-первых, необходима гуманизированная система культивирования ex vivo для размножения hPSCs, которая устраняет риск контаминации продуктами клеток животных. Во-вторых, необходима модель культуры без питательных веществ, чтобы облегчить и экономически выгодное массовое производство hPSCs. Для терапевтического применения ПСК необходимо выявить факторы, регулирующие их самообновление и дифференцировку.

Поскольку Xu et al. первоначально сообщили о возможности использования кондиционированной среды (CM), полученной из эмбриональных фибробластов мыши (MEF), для выращивания hESCs на Matrigel1, во многих исследованиях изучались оптимальные методы размножения ex vivo для hPSCs2-4. Тем не менее, идеальная гуманизированная система размножения hPSC без фидеров ex vivo не была разработана, поскольку современные методы требуют дополнительных экзогенных субстратов, включая bFGF и инсулин, хорошо известные факторы, поддерживающие hPSC, в питательных средах5-7. Кроме того, синтетические субстраты, такие как Матригель или ламинин, используются во всех безкормовых культурах.

Обоснование разработки и использования этого протокола основано на наших предыдущих исследованиях, показывающих, что клетки хориона плаценты человека превосходно поддерживают размножение hPSCs без добавок bFGF8-11. Этот протокол имеет ряд преимуществ, включая его простоту в обращении и его экономическую эффективность, а также представляет собой почти идеальную гуманизированную культуру, которая позволяет распространять hPSC без экзогенных синтетических субстратов. Применение КМ из плаценты человека (hPCCM) для лечения hPSCs включает в себя 3 этапа. Во-первых, клетки хориона выделяют из плаценты человека и культивируют. Во-вторых, hPCCM производится из культивируемых клеток. В-третьих, hPSCs культивируют с использованием hPCCM и подтверждают их характеристики.

Этот протокол облегчит клиническое применение ПСК и изучение механизмов пролиферации и прикрепления ПССК. В данной работе представлен протокол успешного размножения hPSCs в hPCCM на чашке, покрытой желатином.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этика заявление: Исследование плаценты человеком был проведен перспективно, с одобрения Institutional Review Board в человеческой исследований Университета Кореи (AN09085-001). Все эксперименты проводились в чистом стерильном номер объекта в Медицинском центре Университета Кореи. Опытно-конструкторских и процедуры с использованием hPSCs были одобрены Институциональные наблюдательного совета Университета медицинского центра Корея (AN12277-003).

1. Подготовка инструментов, медиакультуры и блюда

  1. Пальто все культуры блюда с 0,1% желатина. Автоклав забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), и щипцы. Стерилизовать хирургические ножницы, микроцентрифужных трубки и марлю в 121 ° С при 15lb фунтов на квадратный дюйм в течение более чем 15 мин.
  2. Приготовленный подогретого 0,25% трипсина-этилен амин тетра-уксусную кислоту (трипсин-ЭДТА) и предварительно нагревают культуральную среду фильтруют (DMEM), содержащей 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл streptomycв перед началом процедуры.

2. Выделение клеток из плаценты человека

  1. Получить плацентарной ткани, после кесарева сечения, от здоровых беременных женщин, которым нормальный или терапевтического аборта на 7-32 недель беременности, после получения письменного информированного согласия.
  2. Имейте акушерской специалиста хирургическим отдельные человеческие плацентарные хориона пластины (HPCS) из плаценты; инкубировать их в 0,25% трипсин-ЭДТА при 37 ° С в течение 20 мин, а затем промывают 5 мл PBS.
  3. Изолировать хорионический ворсинки от HPCS с помощью ножниц; фарш ворсинки и мыть им три раза 1 мл PBS. После измельчения, место ворсин хориона в пробирке с использованием пипетки; мыть образцы с 500 мкл PBS с помощью пипетки вверх и вниз, и центрифуги трубки на 120 мкг в течение 3 мин. Промыть ткань дважды 500 мкл подогретого культуральной среде.
  4. Культуры клеток в среде на покрытые желатином пластин при 37 ° С, в 5% CO 2 , а под 95% влажности. Предварительное покрытие все пластины с 0,1% желатина в течение 1 часа при 37 ° С. Колонии фибробластоподобных клеток и образует прилипший рост примерно 5-7 дней после начала культуры в той же среде.
  5. не Обменять среду каждые 2-3 дня до третьего прохода. Во культуры, удалением клеточного дебриса, плавающие в культуральной среде; растущие плацентарные фибробласты приложить к пластине. Культура фибробластов-подобные клетки, полученные из КВД до 10-го прохода, а затем собрать их для чЭСК культур после обработки трипсином и митомицин-C (10 мкг / мл) лечение.
  6. Перед замораживанием HPCS как образцы акции, использовать обратный транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), чтобы подтвердить, что HPCS не загрязнены патогенными микроорганизмами, которые обычно инфицируют через плаценту, в том числе микоплазмы (M. fermentans, М. М. hyorhinis, аргинина, м . Orale, М. salivarium, М. Hominis, М. pulmonis, М. arthritidis, М. neurolyticum, М. hyopneumoniae,и "М. capricolum) и видов бактерий, Ureaplasma urealyticum, с помощью набора определения микоплазмы.
    1. Следуйте инструкциям производителя, чтобы выполнить RT-PCR, использовать все праймеры и смесей, предусмотренные в комплекте. Используйте супернатантов клеток, которые были выращены в течение 36 дней для обнаружения микоплазм. Добавить 3 мкл этих образцов к ПЦР смеси и выполнять процедуру 1-й ПЦР в течение 35 циклов, каждый из которых состоит из 94 ° C в течение 30 сек, 55 ° С в течение 2 мин и 72 ° С в течение 1 мин.
    2. Осторожно добавляют 0,5 мкл 1-го продукта ПЦР с ПЦР-смеси и выполнить процедуру 2-й ПЦР в течение 30 циклов с использованием тех же условий, как и раньше. Анализ амплифицированных продуктов электрофорезом в 1% агарозном геле; применяют по 10 мкл каждого из 1-й и 2-й ПЦР-продуктов в гелях.
  7. Если HPCS находят, загрязнены патогенами, устранить ихиспользуя комбинацию антибиотиков (БМ-циклин), следуя инструкциям изготовителя. Добавить среде, содержащей 10 мкг / мл BM-циклин 1 в течение 3 дней, а затем обработать клетки с 5 мкг / мл БМ-циклин 2 в течение еще 4 дней. Повторите этот цикл в два раза, а затем проверить на загрязнение микоплазмой снова.

3. Сбор плаценты человека клеток, полученных кондиционированной среды (hPCCM)

  1. После исключения загрязнения, лечить прикрепленные клетки (85-90% слияния (1,5 × 10 7 клеток / колба) митомицином-C (10 мкг / мл) в течение 2 ч и 30 мин и промывают клеткам три раза с 10 мл PBS. Инкубируйте клетки с подогретого среде без митомицина-С в течение 24 ч.
  2. Через день после обработки, инкубировать клеток в 10 мл среды (DMEM-F12 с добавлением 20% нокаут-Serum Replacement [KOSR], 0,1 мМ β-меркаптоэтанола, 1% NEAA и 1% пенициллина-стрептомицина). После 24 часов инкубации, урожай см в 15-мл коническую пробирку ифильтровать см с помощью шприца 0,22 мкм фильтр.
  3. Добавить еще 10 мл новой среды и инкубации. Собирают все супернатантов из культур каждый день в течение 1 недели и заморозить собранного среду при -80 ° С. Избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания.

4. Культура эмбриональных стволовых клеток человека (ЭСК) и индукции плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)

  1. Получить линий эмбриональных стволовых клеток человека, H1 и H9 клеток (перечисленные в реестре НИЗ чЭСК под названием WA01 WA09 и, соответственно) и индуцированной плюрипотентных стволовых клеток IPSC-1: IPS (крайняя плоть) -1 и IPSC-2 (IISH1i- БМ) из научно-исследовательского института WiCell (Madison, WI, USA). Клетки должны быть разморожены и культивируют в соответствии с инструкциями изготовителя.
  2. В контрольной группе, культуры клеток на базальной мембране Матрица покрытием блюд широко используется в питатель-свободным и бессывороточной культуральной среде определяется при 37 ° С и в 5% СО 2. Первоначально семян 80-100 скопления hPSCs яN 35-мм блюда. не расти клетки в этих блюд до 70-80% слияния и регулярно прохождения клеток к югу от культивирования раз в 5-6 дней, с использованием механических или ферментативные методы (диспазу). Промыть клетки дважды среды и пластины их в соотношении 1: 4. Заменить среду свежей средой каждый день.
  3. Для экспериментальных групп, культуры клеток в hPCCM на чашки, предварительно покрытые 0,1% желатином и рутинного пассирования раз в 5 дней, либо механически, либо ферментативно. Пластина клеток в соотношении в диапазоне от 1: 6-1: 10. hPSCs приложить к желатина в течение 2 дней после передачи. Ежедневно заменить среду свежей средой.

5. Характеристика человека плюрипотентных стволовых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Охарактеризуйте hPSCs используя несколько методов, таких как щелочной фосфатазы окрашивания, иммуногистохимии, количественный ПЦР в реальном времени (ПЦР-Qrt), и вестерн-блоттинга.

  1. Окрашивание Иммунофлуоресценции
    1. Для immunofluorescencе окрашивания, культура hPSCs и фиксации клеток в камерах слайд 8-луночных с 4% (вес / объем) параформальдегида в течение 10 мин; Затем, проницаемыми клеток с 0,1% (об / об) Тритон-X100 в течение 15 мин, и блокировать клетки в течение 1 ч с 3% (объем / объем) нормального лошадиной сыворотки в PBS, содержащем 0,1% (об / об) Tween- 20. Вымойте PBS в два раза в течение 5 мин между каждым шагом.
    2. Инкубируйте клетки с первичными антителами (ОКТ-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, разведении 1: 1000) O / N при 4 ° С и с вторичным антителом.
    3. Перед установкой, инкубировать клетки 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в течение 5 мин в темноте. Вымойте клетки строго три раза в течение 5 мин каждый и сухие клетки полностью, в темноте. Сохранение клеток в среде флуоресценции монтажа и наблюдать их под флуоресцентным микроскопом.
  2. Qrt-ПЦР
    1. Изолировать общей РНК из клеток с использованием RNeasy мини комплект в соответствии с требованиями завода-изготовителя и количественно извлеченный РНК, используя Nano падения спектрофотометра.
    2. Синтезируют кДНК добавлением 2 мкг суммарной РНК с 20-мкл реакционной смеси, содержащей олиго (дТ) праймеры и Верхний II обратной транскриптазы; следуйте инструкциям изготовителя в этой процедуре.
    3. Amplify синтезированной кДНК с системой IQ Bio-Rad прибора Icycler, используя IQ SYBR Green КПЦР мастер смеси и грунтовки последовательности, описанные в таблице S1 Дополнительному. Нормализовать пороговые значения цикла генов, представляющих интерес для тех, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH).
  3. Щелочная фосфатаза окрашивание (AP)
    1. Обнаружение AP деятельность, используя ES Cell характеристика комплект, в соответствии с протоколом производителя.
    2. На 5-й день, аспирация СМИ и исправить hPSCs с 4% параформальдегидом в PBS в течение 12 мин. Не overfix; фиксации клеток в течение более 2 мин приведет к инактивации щелочной фосфатазы. Аспирируйте фиксатор и промыть 1x промывки буфером. Непозволяют скважин высохнуть между шагами.
    3. Добавьте достаточно окрашивания решение для покрытия каждую лунку (1 мл на лунку 35 мм блюдо). Планшеты инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин.
    4. После инкубации, мыть посуду с 1x промывки буфером. Обложка клетки с 1x PBS, чтобы предотвратить высыхание и изучить и изображения окрашенных клеток с использованием микроскопа Olympus.
  4. Вестерн-блот
    1. Выполнение Вестерн-блоттинга, как описано выше в 9. Вкратце, определения концентрации белка в клеточных лизатах. Решение равные количества белка на додецилсульфата натрия гель-электрофореза в полиакриламидном сульфат (SDS-PAGE) геля и передать на белки в поливинилиденфторид (ПВДФ) мембраны.
    2. Блок блот и исследовать его O / N с различными первичными антителами при 4 ° С; затем инкубируют блот с HRP-конъюгированные вторичные антитела в течение 1 часа. Вымойте мембраны три раза в течение 10 мин каждый раз между инкубации. Обнаружение сигналов с использованием реагента ECL.
  5. Краткое Повторите Тандем (STR) Анализ
    1. hPSCs собирали из контрольной и экспериментальной групп на том же отрывке. Геномную ДНК экстрагировали с помощью набора ДНК Micro, в соответствии с инструкциями изготовителя.
    2. Amplify геномной ДНК для 16 различных генетических локусов, используя набор AMPF / STR ПЦР-амплификации, в соответствии с требованиями завода-изготовителя и капиллярного электрофореза проводили, используя генетический анализатор.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Одним из преимуществ этого метода распространения HPSC, что он использует компоненты, секретируемые из клеток человека. Наиболее ciritical шаг в протоколе является изоляция и культуры плацента-клеток, полученных человека. Это требует и точной рассечение от точного часть HPC пластины ворсинок. Рисунок 1 показывает процедуру выделения плаценты человека, полученных клеток. Этот процесс прост и удобен для выделения клеток, и может быть легко выполнена в течение 1 ч. Как описано на фиг.2, тк...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Эта модель была разработана, успешно распространяться hPSCs, сохраняя их характеристики, в гуманизированных фидерных свободных условиях культивирования без добавления экзогенных рекомбинантных факторов роста, таких как оФРФ или инсулина, что позволяет манипулировать hPSCs в гуманизированного микросреды. Экзогенный добавок оФРФ является общим и применение субстратов, таких как Matrigel или ламинином имеет важное значение для подачи свободной культивирования hPSCs 14.

Этот протокол ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы указывают на отсутствие конфликтов интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить скоро Чхоль Хон (MD, Ph.D., доцент кафедры акушерства и гинекологии, Медицинский колледж Университет Кореи) для обеспечения плацентарной ткани. Эта работа была частично поддержана грантами (R1211902) из ​​Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), Республика Корея.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Митомицин-ССигма-Олдрич КорпорейшнM428710 μ г/мл
набор для обнаружения микоплазмTaKaRa Bio Inc.#6601
MatrigelBD Biosciences#354277
mTeSR1STEMCELL Technologies Inc.#05850
ДиспазУортингтон Биохимическая корпорацияLS021001 мг/мл
ЖелатинSigma-Aldrich CorporationG25000.10%
BM-ЦиклинRoche799 05010 μ г/мл
RNeasy mini kit Qiagen74104
Нанокапельный спектрофотометрThermo Fisher Scientific Inc
iQ SYBR Green qPCR Master Mix Bio-Rad Laboratories#170-8882AP
Набор для определения характеристик клеток ESChemicon International, Inc.,SCR001
Power cDNA Synthesis Kit iNtRON Biotechnology25011
QIAamp® Набор DNA Micro kitQiagen56304
AmpF/STR® Идентификационный файл® Набор для амплификации ПЦРApplied Biosystems Inc.
Applied Biosystems® 3130xl Генетический анализатор Applied Biosystems Inc.
4322288

Ссылки

  1. Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
  2. Amit, M. C., Shakiri, V., Margulets, J. Itskovitz-Eldor Feeder layer and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biol Reprod. 70 (3), 837-845 (2004).
  3. Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60(2010).
  4. Jin, S., Yao, H., Weber, J. L., Melkoumian, Z. K., Ye, K. A synthetic, xeno-free peptide surface for expansion and directed differentiation of human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (11), e50880(2012).
  5. Xu, R. H., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
  6. Xu, C., et al. Basic fibroblast growth factor supports undifferentiated human embryonic stem cell growth without conditioned medium. Stem Cells. 23 (3), 315-323 (2005).
  7. Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
  8. Park, Y., et al. Human feeder cells can support the undifferentiated growth of human and mouse embryonic stem cells using their own basic fibroblast growth factors. Stem Cells Dev. 20 (11), 1901-1910 (2011).
  9. Park, Y., et al. The efficacy of human placenta as a source of the universal feeder in human and mouse pluripotent stem cell culture. Cell Reprogram. 12 (3), 315-328 (2010).
  10. Park, Y., et al. Undifferentiated propagation of the human embryonic stem cell lines, H1 and HSF6, on human placenta-derived feeder cells without basic fibroblast growth factor supplementation. Stem Cells Dev. 19 (11), 1713-1722 (2010).
  11. Seok, K., et al. Human placenta-derived feeders support prolonged undifferentiated propagation of a human embryonic stem cell line, SNUhES3: comparison with human bone marrow-derived feeders. Stem Cells Dev. 16 (3), 421-428 (2007).
  12. Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
  13. Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
  14. Mahmood, A., Harkness, L., Schrøder, H. D., Abdallah, B. M., Kassem, M. Enhanced differentiation of stem cells mesenchymal progenitors by inhibition of TGF-beta/activin/nodal using SB-431542. J Bone Miner Res. 25 (6), 1216-1233 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Плюрипотентные стволовые клетки человекапокрытие желатиномвыделение ворсин хорионаформирование колоний фибробластовприготовление кондиционированной средыбесфидерное культивированиеэкзогенное восполнениемассовое производство
Роман Культура модель человека плюрипотентных стволовых клеток Распространение на Желатин в Плацента-баром СМИ
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.