Методическая статья

Чувствительный Обнаружение Proteopathic посев деятельности с FRET проточной цитометрии

DOI:

10.3791/53205

⸱

8 декабря 2015 г.

 ,  , 
1Center for Alzheimer's and Neurodegenerative Diseases, University of Texas Southwestern Medical Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Перенос белковых агрегатов или протеопатических семян от клетки к клетке может лежать в основе прогрессирования патологии при нейродегенеративных заболеваниях. В данной работе описывается новый метод проточной цитометрии FRET, который позволяет точно и чувствительно обнаруживать активность посева из рекомбинантных или биологических образцов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все больше доказательств подтверждают трансцеллюлярное размножение токсичных белковых агрегатов, или протеопатических семян, в качестве механизма инициации и прогрессирования патологии при нескольких нейродегенеративных заболеваниях, включая болезнь Альцгеймера и связанные с ней таупатии. Потенциально критическая роль семян тау в прогрессировании болезней убедительно подтверждает необходимость чувствительного анализа, который легко обнаруживает активность посева в биологических образцах.

Сочетая специфичность передачи энергии флуоресцентного резонанса (FRET), чувствительность проточной цитометрии и стабильность моноклональной клеточной линии, был разработан сверхчувствительный анализ посева, совместимый с обнаружением семян из рекомбинантных или биологических образцов, включая гомогенаты мозга человека и мыши. В анализе используются моноклональные клетки HEK 293T, которые стабильно экспрессируют склонный к агрегации повторный домен (RD) тау-белка, содержащий ассоциированную с заболеванием мутацию P301S, слитую с CFP или YFP, которые производят сигнал FRET при агрегации белка. Поглощение протеопатических семян тау (но не других белков) в биосенсорные клетки стимулирует агрегацию RD-CFP и RD-YFP, а проточная цитометрия чувствительно и количественно контролирует этот индуцированный агрегацией FRET. Анализ обнаруживает фемтомолярные концентрации (мономерный эквивалент) рекомбинантных семян тау, имеет динамический диапазон, охватывающий три порядка, и совместим с гомогенатами мозга трансгенных мышей с таупатией и людей с таупатией. С небольшими модификациями анализ также может обнаруживать активность посева других протеопатических семян, таких как α-синуклеин, а также совместим с первичными культурами нейронов. Легкость, чувствительность и широкая применимость проточной цитометрии FRET делают ее полезной для изучения широкого спектра нарушений агрегации белков.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Накопление внутриклеточного тау амилоидами определяет тауопатий, таких как болезнь Альцгеймера. В стадии ранней болезни, патологии, как правило, локализованы в отдельных участках головного мозга, но с прогрессированием заболевания, патологии неизменно распространяется по различным нейронных сетей 1-5. Накопленные данные свидетельствует о распространении трансцеллюлярного токсичных белковых агрегатов лежит в основе этой патологии (обзор в 6-10). В этой модели, proteopathic семена (например, тау) освобождаются от донорских клеток и введите соседние клетки, превращая нативного белка тау в виде неправильно свернутых через шаблонный конформационного изменения 11-15. Анализ, описанный здесь был разработан, чтобы чутко обнаружить такую ​​деятельность посева. Он совместим с рекомбинантного белка и биологических образцов и позволяет количественно оценить минуту уровней proteopathic посева деятельности 16.

НЕК 293Т клеток, которые стабильно экспрессируют тау повтора Domain (РД), содержащий, ассоциированных с заболеваниями P301S мутацию, слитый либо CFP YFP или (в дальнейшем упоминается как тау-RD-КФП / YFP клеток) служат стабильной биосенсора посева активности. При отсутствии proteopathic семян, клетки поддерживать тау в виде растворимого мономера, и не имеют никакого заметного фона ладу. Спонтанное поглощение или опосредованную липосомами трансдукции семян тау в клетки, однако, приводит к RD-CFP и агрегации РД-YFP, который производит сигнал FRET, который измеряется в отдельные клетки с помощью проточной цитометрии.

Многочисленные компоненты этого анализа были разработаны для повышения чувствительности и снижения изменчивости. Моноклональное клеточную линию с соотношением 1: экспрессии РД-КФП / YFP 1 была выбрана, поскольку она обеспечивает оптимальную сигнал: шум. Для повышения чувствительности, фосфолипиды использованы для введения семена непосредственно в клетках (хотя для изучения биологических механизмов захвата, это может быть опущен). Наконец, проточной цитометрии мониторы FRET на уровне популяции и одной клетки Уровень, в отличие от других агрегации белков анализов. Окончательный результат мера, интегральная плотность ладу весьма количественный и счета и по количеству клеток с агрегацией, и степень, в которой произошло объединение в каждой ячейке. Все эти оптимизированными параметрами повышения чувствительности и обеспечения воспроизводимости.

Эта система была недавно занятых в комплексном исследовании в трансгенных мышей P301S tauopathy 17, которые оценивали временной возникновение и прогрессирование тау посев деятельности по отношению к другим, обычно используется тау патологических маркеров (например, МС1, AT8, PG5 и ThioflavinS). Посев активность на сегодняшний день является ранним и самым надежным маркером тау патологии оценивается, предшествующего гистологического обнаружения, по крайней мере 6 недель. Посев активность появляется в 1,5 месяцев и увеличивается постепенно с возрастом, предполагая причинную роль proteopathic семян в начале и / или прогрессирования нейродегенерации 16.

e_content "> Точная количественный мельчайших уровнях семенного материала из биологических образцов могут облегчить учебу, которые контролируют развитие на ранней стадии болезни. Сократив продолжительность проб и позволяет использовать более молодых животных, это может повысить эффективность и точность доклинических испытаний на животных. Например, в P301S мыши описано ранее, соединения свинца могут быть доставлены уже в 4-6 недель (непосредственно перед или в момент начала посева деятельности), и контролироваться на предмет эффективности через 2-4 недели. Анализ должен точно количественно-либо сокращений в посеве деятельность. FRET проточной цитометрии была в пробирке отбора заявок, а также. Например, анти-тау реактивы (например, антитела, малые молекулы, и т.д.) могут быть быстро проверены на их способность блокировать посев индукции непосредственно в культуре, используя либо рекомбинантный тау агрегаты или мозга, полученных лизаты в качестве источника семян (рис 5). С этой установкой, когда семенной материал готов, бывшийперимента занимает всего три дня, чтобы закончить, в том числе анализа данных. Быстрое количественное определение proteopathic посева деятельности может способствовать, таким образом, множество исследований нейродегенерации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол подчеркивает использование FRET проточной цитометрии для обнаружения посева деятельность из биологических образцов мыши. Он также совместим с рекомбинантными фибрилл и биологических образцов человека. Мышь эвтаназии и мозг сбор был проведен в соответствии с IACUC утвержденных процедур.

1. Мозг Добыча

  1. После глубокого обезболивания с изофлуран (2%), заливать мышь ледяной PBS, содержащий 0,03% гепарина, и извлекать мозг следующую деталей, описанных в Gage и соавт. 18
  2. Поместите извлеченный ткани в крио-флакон, и оснастки замораживание путем размещения в жидком азоте. В качестве альтернативы, заморозить ткани на сухом льду. После заморожены, передавать ткани -80 ° C и хранят в течение длительного периода времени, если это необходимо.
    Примечание: Этот протокол совместим с целыми гомогенатах мозга или микро-рассеченные областях головного мозга. См Hagihara др. Для детального протокола микро-рассечение 19.

2. Подготовка семенного материала биологическом

  1. Подготовьте буфере для гомогенизации путем растворения ингибиторов протеазы (ЭДТА) в свободное 1x TBS (1 таблетка на 10 мл). Вихрь энергично, и хранить на льду. Ингибиторы протеазы должны быть свободными ЭДТА, чтобы сохранить жизнеспособность клеток биосенсора.
  2. Взвесьте замороженные ткани головного мозга в одноразовом взвешивании лодки, и передать в 5 мл коническую трубку. Добавить ледяной буфере для гомогенизации таким образом, что конечный раствор 10% вес / объем. Временно хранить на льду. Масса тканей и объем буфера последующее усреднение будет варьироваться в зависимости от размера мозга и / или регионах используются. Здесь An hemibrain взрослой мыши весом 0,2 г суспендируют в 2 мл на 10% вес / объем.
  3. Образцы передачи в холодной комнате, и настроить зонд ультразвукового к соответствующим настройкам. Для зонда ультразвуком с Omni Ruptor (как показано здесь), установить власть на 20%, что соответствует примерно 75 В. использовать режим импульса, чтобы обеспечить образцы не О.В.э нагревают в течение ультразвуком. Установите генератор импульсов на 30%, что соответствует приблизительно 500 мс.
  4. Очистите кончик зонда ультразвуком путем промывки водой, изопропанол, и воды снова, вытирая зонд между каждого решения. Будьте уверены, чтобы промыть и протереть обе стенки и дно зонда с LAB-салфеток.
  5. Работа с одного образца, в то время, погрузите наконечник щупа в буфер гомогенизации, и начать ультразвукового. Использование питания и генератор импульсов параметры, описанные выше, обеспечивают 25 Всего импульсы. Убедитесь, что ткань полностью в суспензии. Будьте осторожны, чтобы избежать пенообразования образца во время этого шага.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы подвержены пеной, если а) общий объем низкий или б) гомогенат нагреется. С этого конкретного документа, не разрушать ультразвуком с объемами меньше, чем 250 мкл. Чтобы обеспечить образцы остаются охлажденные, трубки могут храниться на льду во время этого этапа.
  6. Очистите датчик по вытирая остаточного лизата, затем доставить 10 импульсов в стакане Oе чистая вода. Промыть стенки и дно зонда с водой, изопропанол, и воды снова (как в шаге 2.4), вытирая сухой после каждого шага. Чтобы избежать загрязнения, тщательно промыть датчик в между образцами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: тау агрегатов, мы не нашли, что более строгие методы очистки необходимы для предотвращения загрязнения образца к образцу. Другие амилоиды, однако, может потребоваться дополнительный уход, который был широко описаны в литературе 20,21.
  7. Магазин гомогенатах на льду, пока все образцы не были обработаны.
  8. Спин гомогенаты на 21,300 мкг в течение 15 мин при 4 ° С.
  9. Перенести супернатант в чистую пробирку, стараясь не потревожить осадок. Откажитесь от гранул. Алиготе супернатант и хранить лизатов при -80 ° C для дальнейшего использования. Избегать замораживания / оттаивания циклов гомогенатах, однако, так как это снижает эффективность посева.

3. Replating биосенсора Клетки

ЗАМЕТКА:Использование четырех клеточных линий для этого анализа: НЕК 293T (клеточная линия # 1), РД-P301S-CFP (клеточная линия # 2), РД-P301S-YFP (клеточная линия # 3), и РД-P301S-КФП / YFP ( клеточная линия № 4). Пожалуйста, ссылки Таблицу 1 за вклад каждой клеточной линии к анализа.

  1. В стерильных условиях, аспирация культуральную среду. Промыть теплой клетки PBS, и аспирата. Trypsinize клетки (3 мл трипсина-ЭДТА (0,05%)) в течение 3 мин, гасили теплой культуральной средой (9 мл DMEM, 10% FBS, 1% ручка / стрептококк, 1% GlutaMAX), и сразу же передавать ячейки в коническую трубку.
  2. Центрифуга клетки при 1000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте среднего, и ресуспендируют осадок клеток в теплой питательной среде.
  3. С помощью гемоцитометра, определить плотность клеток для каждой клеточной линии. Плотность клеток будет меняться в зависимости от сплошности во время уборки и объема ресуспендирования. Ресуспендируют клетки, полученные из 10-см чашку на 90% слияния в 10 мл среды для плотности клеток, чтобы быть около 1 млн клеток / мл.
  4. Делатьмастер микс клеток + носители, такие, что каждую лунку 96-луночного планшета будет содержать 35000 клеток в 130 мкл среды (например, сделать мастер смеси на 100 скважин, ресуспендируйте 3,5 миллионов клеток в 13 мл среды). Измените количество клеток с учетом индивидуальных экспериментальных конструкций и сроки. Для лечения клеточного ~ 18 ч после посева, добавить 35000 клеток в каждую лунку 96-луночного планшета.
  5. Использование пипетки многоканальный, медленно пипетки 130 мкл суспензии клеток Master Mix в каждую лунку плоским дном, тканевой культуры обработанных 96-луночный планшет. В то время как покрытие, поместить кончик пипетки в центре скважины, не касаясь дна пластинки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя покрытие формат может быть изменен, делая N = 4 лунки для каждой из клеточных линий 1-3 за тарелку рекомендуется. Остальная часть пластины (п = 84) зарезервировано для клеточной линии # 4 (биосенсор клеток).
  6. Разрешить клетки урегулировать оставляя пластины нетронутой в течение 10 мин при комнатной температуре. Инкубируйте o / n при 37 ° С, 5% СО 2, и &# 8805; 80% относительной влажности.

4. Лечение Клетки

ПРИМЕЧАНИЕ: На следующий день, когда тау биосенсорные клетки 60-65% сливной, подготовить семена трансдукции комплексы следующим образом:

  1. В одну пробирку, объединить реагента для трансфекции, например, Липофектамина, с пониженным содержанием сывороточных средах, таких как Opti-MEM, чтобы сделать мастер смеси. За хорошо, добавить 1,25 мкл реагента для трансфекции и 8,75 мкл сниженной сыворотке СМИ. Флик трубку осторожно перемешать, кратко спином вниз, и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
  2. В другую пробирку, объединить семенного материала (аликвоты лизата из стадии 2.9) с уменьшенной в сыворотке СМИ.
    Примечание: Объем посевного материала будет варьироваться в зависимости от индивидуального эксперимента. При выборе объема семян, принимать во внимание: обилие семян в образце и потенциальной токсичности. Сырая гомогенаты могут быть токсичными для клеток. Таким образом, использовать минимально возможную громкость, чтобы контролировать желаемого эффекта. Ранее проверенные объемы лизата / лунку диапазоне фрOM 1-5 мкл, что соответствует 5-20 мкг общего белка. Убедитесь, что общий объем на лунку (семена + уменьшается в сыворотке СМИ) 10 мкл.
  3. Комбинат содержимое из двух трубок, описанных в 4.1 и 4.2, фильм нежно перемешать, кратко спином вниз (1000 XG, 5 сек), и инкубировать при комнатной температуре в течение, по крайней мере 20 мин и до 2 часов.
  4. Аккуратно пипетки 20 мкл трансдукции комплекса на стороне отдельных скважин биосенсора. Используйте три технических повторов, если это возможно. Возврат обработанных клеток в инкубатор на 24-48 часа. Инкубируют при тех же условиях, как описано в шаге 3.6.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующий состояние отрицательного управления для этой установки является биосенсорные клетки, обработанные с пустыми липосомами (т.е. липосом реагента + уменьшается в сыворотке СМИ), потому что применение фосфолипидов вводит небольшое смещение в профиле флуоресценции по отношению к биосенсора клетки неэкспонированных в липосомы реагента.

5. Сбор Клетки для FRET проточной цитометрии

Примечание: Перед сбором клеток-Вообще 24-48 ч после лечения-это возможно, чтобы получить предварительную считывание посева деятельности с использованием GFP фильтр на стандартной перевернутой флуоресцентного микроскопа. Клетки, обработанные без семенного материала (т.е. пустые липосомы) покажет диффузное свечение, в то время как клетки, обработанные семенного материала покажет интенсивный точечные и ретикулярные внутриклеточные включения (рис 1А - B).

  1. Использование пипетки многоканальный, аспирации всех клеточных среду (150 мкл). Trypsinize (50 мкл) клетки в течение 5 мин, и гасят 150 мкл охлажденного культуральной среде. Не включать полоскание PBS до трипсинизации на этом этапе, так как это может привести к клеточной подъема и последующего потерю клеток. Исключить любые загрязняющие мертвые клетки и мусор во время проточной цитометрии через стратегии селекции.
  2. Сразу после закалки, передачи клеток в 96-луночных круглодонных пластины и центрифуги при 1000 мкг в течение 5 мильп при комнатной температуре.
  3. Аспирируйте и отбросить среду, заботясь, чтобы не потревожить осадок клеток.
  4. Осторожно, но тщательно, ресуспендируют осадок клеток в 50 мкл 2% параформальдегида и инкубировали в течение 10 мин. Кроме того, работают клетки живут, хотя фиксация обеспечивает более чистых и последовательные результаты.
  5. Центрифуга клетки при 1000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте и отбросить параформальдегида, заботясь, чтобы не потревожить осадок клеток.
  6. Осторожно, но тщательно, ресуспендируют осадок клеток в 200 мкл охлажденного буфера проточной цитометрии (HBSS, 1% FBS, 1 мМ ЭДТА) и запустить пластину как можно скорее, чтобы избежать образования комков клеток.

6. FRET проточной цитометрии

Примечание: С помощью проточного цитометра такие как MACSQuant VYB, который оснащен FRET-совместимый лазерные линии и наборы фильтров (таблица 2). Для каждого шага в этом разделе, нажмите хорошо интереса, используя шаблон 96 также программного обеспечения, и нажмите"Играть", чтобы начать захват образца и поток. Сделать участков или статистики таблицы, нажав значок 'новом окне анализа ». Изменить параметры оси, на отдельных участках двумерных нажав название либо на Х или Y оси и выбрав соответствующий фильтр. Для переключения клеточных популяций или сигналов флуоресценции, увеличить или уменьшить напряжение, связанные с соответствующими фильтрами. С этим инструментом, запустите <1000 событий / сек, чтобы обеспечить точный контроль одноклеточных.

  1. Сделать бокового рассеяния-уголок (SSC-А) против рассеяния вперед-зоны (FSC-A) двумерного участка, и клеточной линии # 1 подряд, отрегулируйте напряжение SSC и FSC, пока популяция клеток не находится в нижнем левом квадранте. Выберите инструмент многоугольник, и определить популяцию клеток (Ворота P1). Для всех параметров стробирующих рисунок 2.
  2. Сделайте FSC-H (высота) против FSC-двумерный участок, и применить ворота Р1 этом участке, нажав "живой" над сюжетом, и выбрав P1. С клеточной линии # 1работает, выберите инструмент многоугольник, и определять отдельные клетки (Ворота P2).
  3. Сделайте 3 гистограммы участки, один для каждого из фильтров, представляющих интерес: CFP YFP, и ладу. Применить ворота P2 для всех этих участков, нажав "живой" над участков и выбора P2. С клеточной линии # 1 подряд настроить напряжения таким образом, что средний клеточной популяции в CFP, YFP, и FRET гистограммы все между 0 и 1. Для измерения CFP и FRET, возбуждают клетки 405 нм лазера, и захват флуоресценции с 450/50 525/50 нм и нм фильтра, соответственно. Для измерения YFP, возбуждают клетки с 488 нм лазера и захвата флуоресценции с 525/50 нм фильтра. Лазерные и фильтр параметров дополнительно описаны в таблице 2.
  4. Выполните компенсацию за CFP перелива в каналах FRET и YFP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Компенсация процесс коррекции флуоресценции перелива. Флуоресценции перелив происходит всякий раз, когда флуоресцентное излучение одной флуорохромом обнаружении в течение фильтр ДезиGNED для измерения сигнала от другого флуорохромом. При правильном компенсации флуоресценции CFP перелива может быть удален из каналов FRET и YFP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Компенсация требует присутствия обоих флуоресценции положительные и -отрицательные клеток. Таким образом, чтобы компенсировать на CFP-позитивных клеток (клеточная линия # 2), отрицательные клетки (линию клеток # 1), должны быть добавлены к пробе до начала запуска.
    1. Спайк в 30 мкл клеточной линии # 1 подвески из одной скважины в 200 мкл клеточной линии # 2 подвески непосредственно перед компенсацией.
    2. Нажмите на иконку "Настройки прибора", то вкладка "компенсации", и проверьте '' матрицу, чтобы открыть таблицу компенсации.
    3. Сделайте FRET-A против CFP-A двумерной участка, и применить ворота P2, как описано в шаге 6.3. С клеточных линий 1 + 2 подряд, щелкните значок "Квадрант" и привлечь квадранта, так что население флуоресценции -отрицательные и -позитивных разделены нижних двух квадрантов (Гейтс LL3й LR3, соответственно).
    4. Создайте таблицу статистики, которая отображает средний интенсивности флуоресценции (MFI) в FRET для LL3 и LR3 ворот. Отрегулируйте параметр FRET в компенсации матрицы до МФО сигнала FRET не эквивалентны между LL3 и LR3. После этого шага, ИТР сигнала FRET равна между неокрашенных клеток и CFP-положительных клеток, что свидетельствует об отсутствии CFP перелива в канал FRET.
    5. Сделайте YFP-A против CFP-A двумерной участка, и применить ворота P2, как описано в шаге 6.3. Нарисуйте квадранта (LL4 и LR4), аналогичные сделано в шаге 6.4.3.
    6. Создайте таблицу статистики, который отображает ИТР YFP для LL4 и LR4. Отрегулируйте параметр YFP в компенсации матрицы до МФО сигнала YFP не эквивалентны между LL4 и LR4. После этого шага, ИТР сигнала YFP равна между неокрашенных клеток и CFP-положительных клеток, что свидетельствует об отсутствии CFP перелива в канал YFP.
  5. Фоллявследствие установки ворот и компенсации, выделите скважин интересов и запустить оставшуюся часть пластины.
  6. После того как все образцы были бежать, файлы экспорта данных, нажав "Файл", затем "копию". Выберите вкладку "Файлы данных", выделите папку эксперимент, и нажмите кнопку «Копировать».

Анализ данных 7.

ПРИМЕЧАНИЕ: Изменить оси на отдельных участках двумерных нажав название либо на Х или Y оси и выбрав соответствующий фильтр.

  1. Открытые файлы FCS в проточной цитометрии программы анализа.
  2. На основании свойств рассеяния, использовать многоугольный ворота, чтобы определить популяции клеток (SSC против ЛПС) и синглетный население (FSC-H против FSC-A) из клеток, обработанных липосомами пустых, аналогично тому, как описано в разделе 6.
  3. Если компенсация СФП была выполнена во время установки, в дальнейшем не отрегулировать CFP.
  4. Создать FRET против YFP двумерной участка. Использование клеточной линии # 3, Определить ложное FRET ворота, опираясь многоугольной ворота, идущей вдоль склона FRET-положительных клеточной популяции. Эти ворота исключает YFP отдельные позитивные клетки-что излучают сигнал в течение лада фильтра, и обращается похож на ранее показано Запрет др. 22
  5. Определить FRET ворота, откладывая пустые липосомы обрабатывали КФП / YFP клетки на FRET против CFP двумерной участка. Представьте многоугольную ворота по склону населения, которая простирается вверх и влево от населения. Эти ворота должны исключать большинство клеток (~ 99%), так что фон FRET является ≥1% клеток. Любые события, которые изменяют в эти ворота считаются FRET-положительным.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый ворота, описанный выше, применяется для всех образцов до построения последующих ворота. После анализа, четыре индивидуальных ворота определен (клеточной популяции; синглет; ложь FRET; FRET).
  6. Параметры анализа Запись интересов, в том числе: процентов FRET положительности и МФОиз FRET-позитивных клеток. Вручную расчета интегральной плотности FRET путем измерения продукта процентного позитива и МФО.
    Примечание: Если интегрированы плотности FRET используется в качестве критерия оценки, установленного фонового FRET (как определено в пункте 7.5) и MFI больше или равна 1, чтобы избежать вычисления произведения, которое меньше двух отдельных факторов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRET проточной цитометрии позволяет чувствительной, количественные, и быстрое обнаружение посева деятельности от рекомбинантных или биологических образцов. Установка Анализ поверхностное: моноклональные полученных устойчивых клеточные линии, экспрессирующие тау-RD-CFP / YFP которые трансдуцированных семенного материала, инкубировали в течение 24-48 ч и подвергали проточной цитометрии (фиг.1А). При отсутствии семян, биосенсор клетки поддерживают тау в растворимой форме, мономерного (Фиг.1В).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Проточной цитометрии система FRET описано здесь является мощным инструментом для быстрого и количественно оценить тау посева деятельность. Это требует только умеренного опыт культивирования клеток и практические знания рвать и проточной цитометрии. Другие анализы посева, такие как тиофлавина T - который обладает повышенной флуоресценции при связывании с бета-листовой структуры - являются трудоемкими и требуют чистой, рекомбинантный субстрат белка. Кроме того, в пробирке анализы для посева тау только полуколичес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот анализ был лицензирован компанией Janssen Pharmaceuticals.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана консорциумом Tau (M.I.D); Грант Национальных институтов здравоохранения 1R01NS071835 (M.I.D.), грант Министерства обороны PT110816 (M.I.D.), 1F32NS087805 (J.L.F.) и 1F31NS079039 (B.B.H.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
TBSSigmaT5912
cOmplete Ингибиторы протеазы (без ЭДТА)Roche4693159001
Крио-флаконыSarstedt72.694.006
Аналитические весыMettler ToledoXSE 105DU
Весовые лодкиFisher Scientific13-735-743
15 мл коническая пробиркаСША Scientific1475-0501
Omni Sonic Ruptor Ультразвуковой гомогенизаторOmni International18-000-115
Микронаконечник для ультразвукового гомогенизатораOmni InternationalOR-T-156
2-пропанолFisher ScientificA451
Наушники с шумоподавлениемFisher Scientific19-145-412
KimwipesFisherScientific S47299
пробирки 1,5 млСША Scientific1615-5510
Microcentrifuge Eppendorf5424 000.215
DPBSLife Technologies14190-136
DMEMLife Technologies11965-084
Фетальная бычья сывороткаHyCloneSH30071.03
Пенициллин-стрептомицинLife Technologies15140-122
GlutaMaxLife Technologies35050-061
Трипсин-ЭДТАLife Technologies25300-054
50 мл Конические пробиркиPhenix ResearchSS-PH15
25 мл реагентVWR41428-954
Многоканальная пипеткаFisher ScientificTI13-690-049
96 луночных пластин с плоским дномCorning3603
Opti-MEMLife Technologies31985-070
Липофектамин 2000Инвитроген11668019
96 лунок круглые донные пластиныCorning3788
16% ПараформальдегидЭлектронная микроскопияНауки RT 15710
PBSSigma-AldrichP5493
EDTASigma-AldrichED2SS
HBSSLife Technologies14185-052
Sorvall ST 40 ЦентрифугаThermo Scientific75004509
BIOLiner Ротор качающегося ведра ThermoScientific75003796
ГемацитометрVWR15170-172
MACSQuant VYB Проточный цитометрMiltenyi Biotec130-096-116
Chill 96 СтойкаMiltenyi Biotec130-094-459
Программное обеспечение для анализа FlowJo Flow Jo
20 μ l наконечники для пипетокRaininGPS-L10
200 μ l наконечники для пипетокRaininGPS-250
1 мл наконечники для пипетокRaininGPS-1000
200 μ l наконечники для пипетокСША Scientific1111-1800
5 мл серологическая пипеткаPhenix ResearchSPG-606180
10 мл серологическая пипеткаPhenix ResearchSPG-607180
25 мл серологическая пипеткаPhenix ResearchSPG-760180

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks. Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).
  2. Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. Predicting Regional Neurodegeneration from the Healthy Brain Functional Connectome. Neuron. 73 (6), 1216-1227 (2012).
  3. Raj, A., Kuceyeski, A., Weiner, M. A Network Diffusion Model of Disease Progression in Dementia. Neuron. 73 (6), 1204-1215 (2012).
  4. Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
  5. Braak, H., Braak, E. Staging of Alzheimer's disease-related neurofibrillary changes. Neurobiol Aging. 16 (3), 271-278 (1995).
  6. Frost, B., Diamond, M. I. Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 11 (3), 155-159 (2009).
  7. Holmes, B. B., Diamond, M. I. Cellular mechanisms of protein aggregate propagation. Current Opinion in Neurology. 25 (6), 721-726 (2012).
  8. Kaufman, S. K., Diamond, M. I. Prion-like propagation of protein aggregation and related therapeutic strategies. Neurotherapeutics. 10 (3), 371-382 (2013).
  9. Holmes, B. B., Diamond, M. I. Prion-like properties of Tau protein: the importance of extracellular Tau as a therapeutic target. J Biol Chem. 289 (29), 19855-19861 (2014).
  10. Guo, J. L., Lee, V. M. Cell-to-cell transmission of pathogenic proteins in neurodegenerative diseases. Nat Med. 20 (2), 130-138 (2014).
  11. Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
  12. Guo, J. L., Lee, V. M. Y. Seeding of normal tau by pathological tau conformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles. Journal of Biological Chemistry. , (2011).
  13. Holmes, B. B., et al. Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), E3138-E3147 (2013).
  14. de Calignon, A., et al. Propagation of Tau Pathology in a Model of Early Alzheimer's Disease. Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).
  15. Liu, L., et al. Trans-Synaptic Spread of Tau Pathology In Vivo. PLoS One. 7 (2), e31302(2012).
  16. Holmes, B. B., et al. Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), E4376-E4385 Forthcoming.
  17. Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (2007).
  18. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65 (65), (2012).
  19. Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. J Vis Exp. (33), (2009).
  20. Yan, Z. X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies. Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).
  21. McDonnell, G., et al. Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination. J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).
  22. Banning, C., et al. A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells. PLoS One. 5 (2), e9344(2010).
  23. Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein. Biochemistry. , (2013).
  24. Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein. J Vis Exp. (95), e51537(2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Tau AggregationBiosensor CellsFlow Cytometry AnalysisFluorescence CompensationSeeding Activity DetectionRecombinant Tau SeedsBrain HomogenatesHEK 293T Cells

Похожие статьи