Методическая статья

Чувствительный Обнаружение Proteopathic посев деятельности с FRET проточной цитометрии

DOI:

10.3791/53205

⸱

8 декабря 2015 г.

 ,  , 
1Center for Alzheimer's and Neurodegenerative Diseases, University of Texas Southwestern Medical Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Перенос белковых агрегатов или протеопатических семян от клетки к клетке может лежать в основе прогрессирования патологии при нейродегенеративных заболеваниях. В данной работе описывается новый метод проточной цитометрии FRET, который позволяет точно и чувствительно обнаруживать активность посева из рекомбинантных или биологических образцов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все больше доказательств подтверждают трансцеллюлярное размножение токсичных белковых агрегатов, или протеопатических семян, в качестве механизма инициации и прогрессирования патологии при нескольких нейродегенеративных заболеваниях, включая болезнь Альцгеймера и связанные с ней таупатии. Потенциально критическая роль семян тау в прогрессировании болезней убедительно подтверждает необходимость чувствительного анализа, который легко обнаруживает активность посева в биологических образцах.

Сочетая специфичность передачи энергии флуоресцентного резонанса (FRET), чувствительность проточной цитометрии и стабильность моноклональной клеточной линии, был разработан сверхчувствительный анализ посева, совместимый с обнаружением семян из рекомбинантных или биологических образцов, включая гомогенаты мозга человека и мыши. В анализе используются моноклональные клетки HEK 293T, которые стабильно экспрессируют склонный к агрегации повторный домен (RD) тау-белка, содержащий ассоциированную с заболеванием мутацию P301S, слитую с CFP или YFP, которые производят сигнал FRET при агрегации белка. Поглощение протеопатических семян тау (но не других белков) в биосенсорные клетки стимулирует агрегацию RD-CFP и RD-YFP, а проточная цитометрия чувствительно и количественно контролирует этот индуцированный агрегацией FRET. Анализ обнаруживает фемтомолярные концентрации (мономерный эквивалент) рекомбинантных семян тау, имеет динамический диапазон, охватывающий три порядка, и совместим с гомогенатами мозга трансгенных мышей с таупатией и людей с таупатией. С небольшими модификациями анализ также может обнаруживать активность посева других протеопатических семян, таких как α-синуклеин, а также совместим с первичными культурами нейронов. Легкость, чувствительность и широкая применимость проточной цитометрии FRET делают ее полезной для изучения широкого спектра нарушений агрегации белков.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Накопление внутриклеточного тау амилоидами определяет тауопатий, таких как болезнь Альцгеймера. В стадии ранней болезни, патологии, как правило, локализованы в отдельных участках головного мозга, но с прогрессированием заболевания, патологии неизменно распространяется по различным нейронных сетей 1-5. Накопленные данные свидетельствует о распространении трансцеллюлярного токсичных белковых агрегатов лежит в основе этой патологии (обзор в 6-10). В этой модели, proteopathic семена (например, тау) освобождаются от донорских клеток и введите соседние клетки, превращая нативного белка тау в виде неправильно свернутых через шаблонный конформационного изменения 11-15. Анализ, описанный здесь был разработан, чтобы чутко обнаружить такую ​​деятельность посева. Он совместим с рекомбинантного белка и биологических образцов и позволяет количественно оценить минуту уровней proteopathic посева деятельности 16.

НЕК 293Т клеток, которые стабильно экспрессируют тау повтора Domain (РД), содержащий, ассоциированных с заболеваниями P301S мутацию, слитый либо CFP YFP или (в дальнейшем упоминается как тау-RD-КФП / YFP клеток) служат стабильной биосенсора посева активности. При отсутствии proteopathic семян, клетки поддерживать тау в виде растворимого мономера, и не имеют никакого заметного фона ладу. Спонтанное поглощение или опосредованную липосомами трансдукции семян тау в клетки, однако, приводит к RD-CFP и агрегации РД-YFP, который производит сигнал FRET, который измеряется в отдельные клетки с помощью проточной цитометрии.

Многочисленные компоненты этого анализа были разработаны для повышения чувствительности и снижения изменчивости. Моноклональное клеточную линию с соотношением 1: экспрессии РД-КФП / YFP 1 была выбрана, поскольку она обеспечивает оптимальную сигнал: шум. Для повышения чувствительности, фосфолипиды использованы для введения семена непосредственно в клетках (хотя для изучения биологических механизмов захвата, это может быть опущен). Наконец, проточной цитометрии мониторы FRET на уровне популяции и одной клетки Уровень, в отличие от других агрегации белков анализов. Окончательный результат мера, интегральная плотность ладу весьма количественный и счета и по количеству клеток с агрегацией, и степень, в которой произошло объединение в каждой ячейке. Все эти оптимизированными параметрами повышения чувствительности и обеспечения воспроизводимости.

Эта система была недавно занятых в комплексном исследовании в трансгенных мышей P301S tauopathy 17, которые оценивали временной возникновение и прогрессирование тау посев деятельности по отношению к другим, обычно используется тау патологических маркеров (например, МС1, AT8, PG5 и ThioflavinS). Посев активность на сегодняшний день является ранним и самым надежным маркером тау патологии оценивается, предшествующего гистологического обнаружения, по крайней мере 6 недель. Посев активность появляется в 1,5 месяцев и увеличивается постепенно с возрастом, предполагая причинную роль proteopathic семян в начале и / или прогрессирования нейродегенерации 16.

e_content "> Точная количественный мельчайших уровнях семенного материала из биологических образцов могут облегчить учебу, которые контролируют развитие на ранней стадии болезни. Сократив продолжительность проб и позволяет использовать более молодых животных, это может повысить эффективность и точность доклинических испытаний на животных. Например, в P301S мыши описано ранее, соединения свинца могут быть доставлены уже в 4-6 недель (непосредственно перед или в момент начала посева деятельности), и контролироваться на предмет эффективности через 2-4 недели. Анализ должен точно количественно-либо сокращений в посеве деятельность. FRET проточной цитометрии была в пробирке отбора заявок, а также. Например, анти-тау реактивы (например, антитела, малые молекулы, и т.д.) могут быть быстро проверены на их способность блокировать посев индукции непосредственно в культуре, используя либо рекомбинантный тау агрегаты или мозга, полученных лизаты в качестве источника семян (рис 5). С этой установкой, когда семенной материал готов, бывшийперимента занимает всего три дня, чтобы закончить, в том числе анализа данных. Быстрое количественное определение proteopathic посева деятельности может способствовать, таким образом, множество исследований нейродегенерации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол подчеркивает использование FRET проточной цитометрии для обнаружения посева деятельность из биологических образцов мыши. Он также совместим с рекомбинантными фибрилл и биологических образцов человека. Мышь эвтаназии и мозг сбор был проведен в соответствии с IACUC утвержденных процедур.

1. Мозг Добыча

  1. После глубокого обезболивания с изофлуран (2%), заливать мышь ледяной PBS, содержащий 0,03% гепарина, и извлекать мозг следующую деталей, описанных в Gage и соавт. 18
  2. Поместите извлеченный ткани в крио-флакон, и оснастки замораживание путем размещения в жидком азоте. В качестве альтернативы, заморозить ткани на сухом льду. После заморожены, передавать ткани -80 ° C и хранят в течение длительного периода времени, если это необходимо.
    Примечание: Этот протокол совместим с целыми гомогенатах мозга или микро-рассеченные областях головного мозга. См Hagihara др. Для детального протокола микро-рассечение 19.

2. Подготовка семенного материала биологическом

  1. Подготовьте буфере для гомогенизации путем растворения ингибиторов протеазы (ЭДТА) в свободное 1x TBS (1 таблетка на 10 мл). Вихрь энергично, и хранить на льду. Ингибиторы протеазы должны быть свободными ЭДТА, чтобы сохранить жизнеспособность клеток биосенсора.
  2. Взвесьте замороженные ткани головного мозга в одноразовом взвешивании лодки, и передать в 5 мл коническую трубку. Добавить ледяной буфере для гомогенизации таким образом, что конечный раствор 10% вес / объем. Временно хранить на льду. Масса тканей и объем буфера последующее усреднение будет варьироваться в зависимости от размера мозга и / или регионах используются. Здесь An hemibrain взрослой мыши весом 0,2 г суспендируют в 2 мл на 10% вес / объем.
  3. Образцы передачи в холодной комнате, и настроить зонд ультразвукового к соответствующим настройкам. Для зонда ультразвуком с Omni Ruptor (как показано здесь), установить власть на 20%, что соответствует примерно 75 В. использовать режим импульса, чтобы обеспечить образцы не О.В.э нагревают в течение ультразвуком. Установите генератор импульсов на 30%, что соответствует приблизительно 500 мс.
  4. Очистите кончик зонда ультразвуком путем промывки водой, изопропанол, и воды снова, вытирая зонд между каждого решения. Будьте уверены, чтобы промыть и протереть обе стенки и дно зонда с LAB-салфеток.
  5. Работа с одного образца, в то время, погрузите наконечник щупа в буфер гомогенизации, и начать ультразвукового. Использование питания и генератор импульсов параметры, описанные выше, обеспечивают 25 Всего импульсы. Убедитесь, что ткань полностью в суспензии. Будьте осторожны, чтобы избежать пенообразования образца во время этого шага.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы подвержены пеной, если а) общий объем низкий или б) гомогенат нагреется. С этого конкретного документа, не разрушать ультразвуком с объемами меньше, чем 250 мкл. Чтобы обеспечить образцы остаются охлажденные, трубки могут храниться на льду во время этого этапа.
  6. Очистите датчик по вытирая остаточного лизата, затем доставить 10 импульсов в стакане Oе чистая вода. Промыть стенки и дно зонда с водой, изопропанол, и воды снова (как в шаге 2.4), вытирая сухой после каждого шага. Чтобы избежать загрязнения, тщательно промыть датчик в между образцами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: тау агрегатов, мы не нашли, что более строгие методы очистки необходимы для предотвращения загрязнения образца к образцу. Другие амилоиды, однако, может потребоваться дополнительный уход, который был широко описаны в литературе 20,21.
  7. Магазин гомогенатах на льду, пока все образцы не были обработаны.
  8. Спин гомогенаты на 21,300 мкг в течение 15 мин при 4 ° С.
  9. Перенести супернатант в чистую пробирку, стараясь не потревожить осадок. Откажитесь от гранул. Алиготе супернатант и хранить лизатов при -80 ° C для дальнейшего использования. Избегать замораживания / оттаивания циклов гомогенатах, однако, так как это снижает эффективность посева.

3. Replating биосенсора Клетки

ЗАМЕТКА:Использование четырех клеточных линий для этого анализа: НЕК 293T (клеточная линия # 1), РД-P301S-CFP (клеточная линия # 2), РД-P301S-YFP (клеточная линия # 3), и РД-P301S-КФП / YFP ( клеточная линия № 4). Пожалуйста, ссылки Таблицу 1 за вклад каждой клеточной линии к анализа.

  1. В стерильных условиях, аспирация культуральную среду. Промыть теплой клетки PBS, и аспирата. Trypsinize клетки (3 мл трипсина-ЭДТА (0,05%)) в течение 3 мин, гасили теплой культуральной средой (9 мл DMEM, 10% FBS, 1% ручка / стрептококк, 1% GlutaMAX), и сразу же передавать ячейки в коническую трубку.
  2. Центрифуга клетки при 1000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте среднего, и ресуспендируют осадок клеток в теплой питательной среде.
  3. С помощью гемоцитометра, определить плотность клеток для каждой клеточной линии. Плотность клеток будет меняться в зависимости от сплошности во время уборки и объема ресуспендирования. Ресуспендируют клетки, полученные из 10-см чашку на 90% слияния в 10 мл среды для плотности клеток, чтобы быть около 1 млн клеток / мл.
  4. Делатьмастер микс клеток + носители, такие, что каждую лунку 96-луночного планшета будет содержать 35000 клеток в 130 мкл среды (например, сделать мастер смеси на 100 скважин, ресуспендируйте 3,5 миллионов клеток в 13 мл среды). Измените количество клеток с учетом индивидуальных экспериментальных конструкций и сроки. Для лечения клеточного ~ 18 ч после посева, добавить 35000 клеток в каждую лунку 96-луночного планшета.
  5. Использование пипетки многоканальный, медленно пипетки 130 мкл суспензии клеток Master Mix в каждую лунку плоским дном, тканевой культуры обработанных 96-луночный планшет. В то время как покрытие, поместить кончик пипетки в центре скважины, не касаясь дна пластинки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя покрытие формат может быть изменен, делая N = 4 лунки для каждой из клеточных линий 1-3 за тарелку рекомендуется. Остальная часть пластины (п = 84) зарезервировано для клеточной линии # 4 (биосенсор клеток).
  6. Разрешить клетки урегулировать оставляя пластины нетронутой в течение 10 мин при комнатной температуре. Инкубируйте o / n при 37 ° С, 5% СО 2, и &# 8805; 80% относительной влажности.

4. Лечение Клетки

ПРИМЕЧАНИЕ: На следующий день, когда тау биосенсорные клетки 60-65% сливной, подготовить семена трансдукции комплексы следующим образом:

  1. В одну пробирку, объединить реагента для трансфекции, например, Липофектамина, с пониженным содержанием сывороточных средах, таких как Opti-MEM, чтобы сделать мастер смеси. За хорошо, добавить 1,25 мкл реагента для трансфекции и 8,75 мкл сниженной сыворотке СМИ. Флик трубку осторожно перемешать, кратко спином вниз, и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
  2. В другую пробирку, объединить семенного материала (аликвоты лизата из стадии 2.9) с уменьшенной в сыворотке СМИ.
    Примечание: Объем посевного материала будет варьироваться в зависимости от индивидуального эксперимента. При выборе объема семян, принимать во внимание: обилие семян в образце и потенциальной токсичности. Сырая гомогенаты могут быть токсичными для клеток. Таким образом, использовать минимально возможную громкость, чтобы контролировать желаемого эффекта. Ранее проверенные объемы лизата / лунку диапазоне фрOM 1-5 мкл, что соответствует 5-20 мкг общего белка. Убедитесь, что общий объем на лунку (семена + уменьшается в сыворотке СМИ) 10 мкл.
  3. Комбинат содержимое из двух трубок, описанных в 4.1 и 4.2, фильм нежно перемешать, кратко спином вниз (1000 XG, 5 сек), и инкубировать при комнатной температуре в течение, по крайней мере 20 мин и до 2 часов.
  4. Аккуратно пипетки 20 мкл трансдукции комплекса на стороне отдельных скважин биосенсора. Используйте три технических повторов, если это возможно. Возврат обработанных клеток в инкубатор на 24-48 часа. Инкубируют при тех же условиях, как описано в шаге 3.6.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующий состояние отрицательного управления для этой установки является биосенсорные клетки, обработанные с пустыми липосомами (т.е. липосом реагента + уменьшается в сыворотке СМИ), потому что применение фосфолипидов вводит небольшое смещение в профиле флуоресценции по отношению к биосенсора клетки неэкспонированных в липосомы реагента.

5. Сбор Клетки для FRET проточной цитометрии

Примечание: Перед сбором клеток-Вообще 24-48 ч после лечения-это возможно, чтобы получить предварительную считывание посева деятельности с использованием GFP фильтр на стандартной перевернутой флуоресцентного микроскопа. Клетки, обработанные без семенного материала (т.е. пустые липосомы) покажет диффузное свечение, в то время как клетки, обработанные семенного материала покажет интенсивный точечные и ретикулярные внутриклеточные включения (рис 1А - B).

  1. Использование пипетки многоканальный, аспирации всех клеточных среду (150 мкл). Trypsinize (50 мкл) клетки в течение 5 мин, и гасят 150 мкл охлажденного культуральной среде. Не включать полоскание PBS до трипсинизации на этом этапе, так как это может привести к клеточной подъема и последующего потерю клеток. Исключить любые загрязняющие мертвые клетки и мусор во время проточной цитометрии через стратегии селекции.
  2. Сразу после закалки, передачи клеток в 96-луночных круглодонных пластины и центрифуги при 1000 мкг в течение 5 мильп при комнатной температуре.
  3. Аспирируйте и отбросить среду, заботясь, чтобы не потревожить осадок клеток.
  4. Осторожно, но тщательно, ресуспендируют осадок клеток в 50 мкл 2% параформальдегида и инкубировали в течение 10 мин. Кроме того, работают клетки живут, хотя фиксация обеспечивает более чистых и последовательные результаты.
  5. Центрифуга клетки при 1000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте и отбросить параформальдегида, заботясь, чтобы не потревожить осадок клеток.
  6. Осторожно, но тщательно, ресуспендируют осадок клеток в 200 мкл охлажденного буфера проточной цитометрии (HBSS, 1% FBS, 1 мМ ЭДТА) и запустить пластину как можно скорее, чтобы избежать образования комков клеток.

6. FRET проточной цитометрии

Примечание: С помощью проточного цитометра такие как MACSQuant VYB, который оснащен FRET-совместимый лазерные линии и наборы фильтров (таблица 2). Для каждого шага в этом разделе, нажмите хорошо интереса, используя шаблон 96 также программного обеспечения, и нажмите"Играть", чтобы начать захват образца и поток. Сделать участков или статистики таблицы, нажав значок 'новом окне анализа ». Изменить параметры оси, на отдельных участках двумерных нажав название либо на Х или Y оси и выбрав соответствующий фильтр. Для переключения клеточных популяций или сигналов флуоресценции, увеличить или уменьшить напряжение, связанные с соответствующими фильтрами. С этим инструментом, запустите <1000 событий / сек, чтобы обеспечить точный контроль одноклеточных.

  1. Сделать бокового рассеяния-уголок (SSC-А) против рассеяния вперед-зоны (FSC-A) двумерного участка, и клеточной линии # 1 подряд, отрегулируйте напряжение SSC и FSC, пока популяция клеток не находится в нижнем левом квадранте. Выберите инструмент многоугольник, и определить популяцию клеток (Ворота P1). Для всех параметров стробирующих рисунок 2.
  2. Сделайте FSC-H (высота) против FSC-двумерный участок, и применить ворота Р1 этом участке, нажав "живой" над сюжетом, и выбрав P1. С клеточной линии # 1работает, выберите инструмент многоугольник, и определять отдельные клетки (Ворота P2).
  3. Сделайте 3 гистограммы участки, один для каждого из фильтров, представляющих интерес: CFP YFP, и ладу. Применить ворота P2 для всех этих участков, нажав "живой" над участков и выбора P2. С клеточной линии # 1 подряд настроить напряжения таким образом, что средний клеточной популяции в CFP, YFP, и FRET гистограммы все между 0 и 1. Для измерения CFP и FRET, возбуждают клетки 405 нм лазера, и захват флуоресценции с 450/50 525/50 нм и нм фильтра, соответственно. Для измерения YFP, возбуждают клетки с 488 нм лазера и захвата флуоресценции с 525/50 нм фильтра. Лазерные и фильтр параметров дополнительно описаны в таблице 2.
  4. Выполните компенсацию за CFP перелива в каналах FRET и YFP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Компенсация процесс коррекции флуоресценции перелива. Флуоресценции перелив происходит всякий раз, когда флуоресцентное излучение одной флуорохромом обнаружении в течение фильтр ДезиGNED для измерения сигнала от другого флуорохромом. При правильном компенсации флуоресценции CFP перелива может быть удален из каналов FRET и YFP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Компенсация требует присутствия обоих флуоресценции положительные и -отрицательные клеток. Таким образом, чтобы компенсировать на CFP-позитивных клеток (клеточная линия # 2), отрицательные клетки (линию клеток # 1), должны быть добавлены к пробе до начала запуска.
    1. Спайк в 30 мкл клеточной линии # 1 подвески из одной скважины в 200 мкл клеточной линии # 2 подвески непосредственно перед компенсацией.
    2. Нажмите на иконку "Настройки прибора", то вкладка "компенсации", и проверьте '' матрицу, чтобы открыть таблицу компенсации.
    3. Сделайте FRET-A против CFP-A двумерной участка, и применить ворота P2, как описано в шаге 6.3. С клеточных линий 1 + 2 подряд, щелкните значок "Квадрант" и привлечь квадранта, так что население флуоресценции -отрицательные и -позитивных разделены нижних двух квадрантов (Гейтс LL3й LR3, соответственно).
    4. Создайте таблицу статистики, которая отображает средний интенсивности флуоресценции (MFI) в FRET для LL3 и LR3 ворот. Отрегулируйте параметр FRET в компенсации матрицы до МФО сигнала FRET не эквивалентны между LL3 и LR3. После этого шага, ИТР сигнала FRET равна между неокрашенных клеток и CFP-положительных клеток, что свидетельствует об отсутствии CFP перелива в канал FRET.
    5. Сделайте YFP-A против CFP-A двумерной участка, и применить ворота P2, как описано в шаге 6.3. Нарисуйте квадранта (LL4 и LR4), аналогичные сделано в шаге 6.4.3.
    6. Создайте таблицу статистики, который отображает ИТР YFP для LL4 и LR4. Отрегулируйте параметр YFP в компенсации матрицы до МФО сигнала YFP не эквивалентны между LL4 и LR4. После этого шага, ИТР сигнала YFP равна между неокрашенных клеток и CFP-положительных клеток, что свидетельствует об отсутствии CFP перелива в канал YFP.
  5. Фоллявследствие установки ворот и компенсации, выделите скважин интересов и запустить оставшуюся часть пластины.
  6. После того как все образцы были бежать, файлы экспорта данных, нажав "Файл", затем "копию". Выберите вкладку "Файлы данных", выделите папку эксперимент, и нажмите кнопку «Копировать».

Анализ данных 7.

ПРИМЕЧАНИЕ: Изменить оси на отдельных участках двумерных нажав название либо на Х или Y оси и выбрав соответствующий фильтр.

  1. Открытые файлы FCS в проточной цитометрии программы анализа.
  2. На основании свойств рассеяния, использовать многоугольный ворота, чтобы определить популяции клеток (SSC против ЛПС) и синглетный население (FSC-H против FSC-A) из клеток, обработанных липосомами пустых, аналогично тому, как описано в разделе 6.
  3. Если компенсация СФП была выполнена во время установки, в дальнейшем не отрегулировать CFP.
  4. Создать FRET против YFP двумерной участка. Использование клеточной линии # 3, Определить ложное FRET ворота, опираясь многоугольной ворота, идущей вдоль склона FRET-положительных клеточной популяции. Эти ворота исключает YFP отдельные позитивные клетки-что излучают сигнал в течение лада фильтра, и обращается похож на ранее показано Запрет др. 22
  5. Определить FRET ворота, откладывая пустые липосомы обрабатывали КФП / YFP клетки на FRET против CFP двумерной участка. Представьте многоугольную ворота по склону населения, которая простирается вверх и влево от населения. Эти ворота должны исключать большинство клеток (~ 99%), так что фон FRET является ≥1% клеток. Любые события, которые изменяют в эти ворота считаются FRET-положительным.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый ворота, описанный выше, применяется для всех образцов до построения последующих ворота. После анализа, четыре индивидуальных ворота определен (клеточной популяции; синглет; ложь FRET; FRET).
  6. Параметры анализа Запись интересов, в том числе: процентов FRET положительности и МФОиз FRET-позитивных клеток. Вручную расчета интегральной плотности FRET путем измерения продукта процентного позитива и МФО.
    Примечание: Если интегрированы плотности FRET используется в качестве критерия оценки, установленного фонового FRET (как определено в пункте 7.5) и MFI больше или равна 1, чтобы избежать вычисления произведения, которое меньше двух отдельных факторов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRET проточной цитометрии позволяет чувствительной, количественные, и быстрое обнаружение посева деятельности от рекомбинантных или биологических образцов. Установка Анализ поверхностное: моноклональные полученных устойчивых клеточные линии, экспрессирующие тау-RD-CFP / YFP которые трансдуцированных семенного материала, инкубировали в течение 24-48 ч и подвергали проточной цитометрии (фиг.1А). При отсутствии семян, биосенсор клетки поддерживают тау в растворимой форме, мономерного (Фиг.1В).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Проточной цитометрии система FRET описано здесь является мощным инструментом для быстрого и количественно оценить тау посева деятельность. Это требует только умеренного опыт культивирования клеток и практические знания рвать и проточной цитометрии. Другие анализы посева, такие как тиофлавина T - который обладает повышенной флуоресценции при связывании с бета-листовой структуры - являются трудоемкими и требуют чистой, рекомбинантный субстрат белка. Кроме того, в пробирке анализы для посева тау только полуколичес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот анализ был лицензирован компанией Janssen Pharmaceuticals.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана консорциумом Tau (M.I.D); Грант Национальных институтов здравоохранения 1R01NS071835 (M.I.D.), грант Министерства обороны PT110816 (M.I.D.), 1F32NS087805 (J.L.F.) и 1F31NS079039 (B.B.H.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
TBSSigmaT5912
cOmplete Ингибиторы протеазы (без ЭДТА)Roche4693159001
Крио-флаконыSarstedt72.694.006
Аналитические весыMettler ToledoXSE 105DU
Весовые лодкиFisher Scientific13-735-743
15 мл коническая пробиркаСША Scientific1475-0501
Omni Sonic Ruptor Ультразвуковой гомогенизаторOmni International18-000-115
Микронаконечник для ультразвукового гомогенизатораOmni InternationalOR-T-156
2-пропанолFisher ScientificA451
Наушники с шумоподавлениемFisher Scientific19-145-412
KimwipesFisherScientific S47299
пробирки 1,5 млСША Scientific1615-5510
Microcentrifuge Eppendorf5424 000.215
DPBSLife Technologies14190-136
DMEMLife Technologies11965-084
Фетальная бычья сывороткаHyCloneSH30071.03
Пенициллин-стрептомицинLife Technologies15140-122
GlutaMaxLife Technologies35050-061
Трипсин-ЭДТАLife Technologies25300-054
50 мл Конические пробиркиPhenix ResearchSS-PH15
25 мл реагентVWR41428-954
Многоканальная пипеткаFisher ScientificTI13-690-049
96 луночных пластин с плоским дномCorning3603
Opti-MEMLife Technologies31985-070
Липофектамин 2000Инвитроген11668019
96 лунок круглые донные пластиныCorning3788
16% ПараформальдегидЭлектронная микроскопияНауки RT 15710
PBSSigma-AldrichP5493
EDTASigma-AldrichED2SS
HBSSLife Technologies14185-052
Sorvall ST 40 ЦентрифугаThermo Scientific75004509
BIOLiner Ротор качающегося ведра ThermoScientific75003796
ГемацитометрVWR15170-172
MACSQuant VYB Проточный цитометрMiltenyi Biotec130-096-116
Chill 96 СтойкаMiltenyi Biotec130-094-459
Программное обеспечение для анализа FlowJo Flow Jo
20 μ l наконечники для пипетокRaininGPS-L10
200 μ l наконечники для пипетокRaininGPS-250
1 мл наконечники для пипетокRaininGPS-1000
200 μ l наконечники для пипетокСША Scientific1111-1800
5 мл серологическая пипеткаPhenix ResearchSPG-606180
10 мл серологическая пипеткаPhenix ResearchSPG-607180
25 мл серологическая пипеткаPhenix ResearchSPG-760180

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks. Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).
  2. Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. Predicting Regional Neurodegeneration from the Healthy Brain Functional Connectome. Neuron. 73 (6), 1216-1227 (2012).
  3. Raj, A., Kuceyeski, A., Weiner, M. A Network Diffusion Model of Disease Progression in Dementia. Neuron. 73 (6), 1204-1215 (2012).
  4. Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
  5. Braak, H., Braak, E. Staging of Alzheimer's disease-related neurofibrillary changes. Neurobiol Aging. 16 (3), 271-278 (1995).
  6. Frost, B., Diamond, M. I. Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 11 (3), 155-159 (2009).
  7. Holmes, B. B., Diamond, M. I. Cellular mechanisms of protein aggregate propagation. Current Opinion in Neurology. 25 (6), 721-726 (2012).
  8. Kaufman, S. K., Diamond, M. I. Prion-like propagation of protein aggregation and related therapeutic strategies. Neurotherapeutics. 10 (3), 371-382 (2013).
  9. Holmes, B. B., Diamond, M. I. Prion-like properties of Tau protein: the importance of extracellular Tau as a therapeutic target. J Biol Chem. 289 (29), 19855-19861 (2014).
  10. Guo, J. L., Lee, V. M. Cell-to-cell transmission of pathogenic proteins in neurodegenerative diseases. Nat Med. 20 (2), 130-138 (2014).
  11. Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
  12. Guo, J. L., Lee, V. M. Y. Seeding of normal tau by pathological tau conformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles. Journal of Biological Chemistry. , (2011).
  13. Holmes, B. B., et al. Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), E3138-E3147 (2013).
  14. de Calignon, A., et al. Propagation of Tau Pathology in a Model of Early Alzheimer's Disease. Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).
  15. Liu, L., et al. Trans-Synaptic Spread of Tau Pathology In Vivo. PLoS One. 7 (2), e31302(2012).
  16. Holmes, B. B., et al. Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), E4376-E4385 Forthcoming.
  17. Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (2007).
  18. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65 (65), (2012).
  19. Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. J Vis Exp. (33), (2009).
  20. Yan, Z. X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies. Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).
  21. McDonnell, G., et al. Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination. J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).
  22. Banning, C., et al. A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells. PLoS One. 5 (2), e9344(2010).
  23. Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein. Biochemistry. , (2013).
  24. Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein. J Vis Exp. (95), e51537(2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

FRET Flow CytometryProteopathic SeedingTau AggregationBiosensor CellsFlow Cytometry AnalysisFluorescence CompensationSeeding Activity DetectionRecombinant Tau SeedsBrain HomogenatesHEK 293T Cells

Похожие статьи