Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Очистка сосудов головного мозга мыши

24.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53208

⸱

10 ноября 2015 г.

 ,  ,  , 
1Collège de France, Center for Interdisciplinary Research in Biology (CIRB), Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Unité Mixte de Recherche 7241, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 2Centre Interdisciplinaire de Recherche en Biologie, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and Paris Science, Lettre Research University, 4Université Paris Descartes, Faculté de Pharmacie, Université Paris Diderot

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем протокол, позволяющий очищать сосудистый отсек мозга мыши. К изолированным сосудам головного мозга относятся эндотелиальные клетки, соединенные плотными соединениями и окруженные сплошной базальной пластинкой, перициты, сосудистые гладкомышечные клетки, а также периваскулярные астроглиальные мембраны.

Аннотация

В головном мозге, большинство из сосудистой системы состоит из селективного барьера гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), который регулирует обмен молекул и клеток иммунной системы между головным мозгом и кровью. Кроме того, огромный спрос нейронов метаболический требует регулирования момента к моменту кровотока. Примечательно, нарушения этих регулировок этиологические признаки большинства патологий головного мозга; в том числе глиобластомы, инсульт, отек, эпилепсия, дегенеративных заболеваний (например: болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера), опухоли головного мозга, а также воспалительных заболеваний, таких как рассеянный склероз, менингит и сепсис-индуцированной дисфункции мозга. Таким образом, понимание сигнализации события модуляции цереброваскулярные физиологии является серьезной проблемой. Большая понимание клеточных и молекулярных свойств различных типов клеток, которые составляют систему цереброваскулярные могут быть получены от первичной культуры или сортировки клеток из свежего диссоциированного мозговой ткани. Однако,свойства, такие как клеточной полярности, морфологии и межклеточных отношений не поддерживается в таких препаратах. Протокол, который мы здесь описывать предназначен для очистки фрагментов мозга сосудов, сохраняя структурную целостность. Покажем, что изолированные сосуды состоят из эндотелиальных клеток, герметично плотных контактов, которые окружены непрерывной базальной пластинки. Перициты, гладкомышечные клетки, а также периваскулярные астроцитов endfeet мембраны остаются прикрепленными к эндотелиальный слой. Наконец, мы опишем, как выполнять Иммуноокрашивание эксперименты на очищенных сосудов головного мозга.

Введение

Правильная работа центральной нервной системы (ЦНС) требует высокой регулируемой внеклеточной среде, и его метаболических потребностей огромны по сравнению с другими органами 1. ЦНС также очень чувствительны к широкому спектру химических веществ, как правило, безвредным для периферических органов, но к ней, нейротоксическое. Для обеспечения правильного функционирования, большинство из "сосудистой ЦНС образует барьер эндотелиальных; гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), который регулирует поток молекул и ионов, а также прохождение иммунных клеток между кровью и мозгом, тем самым поддерживая надлежащую гомеостаз 2, но также ограничивает проникновение лекарственных препаратов, тем самым, препятствуя лечения неврологических расстройств. 3 На клеточном уровне, то ВВВ в основном поддерживается обширными плотных контактов между эндотелиальными клетками, поляризованного экспрессии оттока транспортеров и с очень низкой скоростью трансцитоза 4. Свойства и функции ГЭБ, в основном индуцируется пеighboring клетки 4. В частности, перицитов играют важную роль в стимулирования и поддержания ГЭБ 5,6. Будучи сократительных клеток, перициты также регулировать кровоток 7, как это делают клетки гладких мышц, окружающие крупные сосуды. Наконец, астроциты, основные глиальные клетки головного мозга, передавать большие процессы с именем endfeet вокруг большей части головного мозга сосудистой 8 и модулировать целостность ВВВ и иммунной состояние покоя 9, передачу метаболитов к нейронам 10, и индуцируют жесткую связь между нейронной активности и кровоток 11,12.

Возможность изучать молекулярные и клеточные свойства цереброваскулярной системы имеет решающее значение для характеристики лучше свой вклад в физиологии мозга и патофизиологии. Для решения этого вопроса, стратегии изолировать цереброваскулярные системы мозга были разработаны, которые позволяют для подготовки неповрежденных фрагментов мозга сосудов. Церебральный судно рurification изначально описывается с помощью крупного рогатого мозги 13 и улучшены и адаптированы к другим видам, в частности грызунов 14. В этом последнем исследовании, была введена использование фильтров разных размеров, чтобы отделить сосуды головного мозга, чтобы фракции, обогащенные в сосудах разного диаметра. Интересно, что в таких препаратах, эндотелиальные клетки сохранили свои метаболические свойства 15, функциональность транспортер 16 и поляризационные 17. Здесь мы подробно этот протокол и далее показывают, что изолированные сосуды сохраняют большинство своих наблюдений в точке структур. Эндотелиальные клетки остаются связаны плотных контактов и окружен непрерывной базальной мембраны. Перициты и гладкомышечные клетки остаются прикрепленными к эндотелиальный слой, а также периваскулярными астроцитов мембран. Тем не менее, астроциты, клетки микроглии, нейроны и олигодендроциты устранены. Наконец, мы описываем процедуру выполнять иммуноокрашивания на изолированных сосудов головного мозга.

До сих пор большинство из молекулярных и клеточных исследований, касающихся цереброваскулярные системы не были выполнены на очищенных клеток головного мозга судов диссоциированных по мобильному сортировки с использованием конкретных штаммов репортер клеток мыши или процедуры Иммуноокрашивание основе 18,19. Хотя эти методы позволяют для выделения почти чистых популяций клеток цереброваскулярных, изолированные клетки полностью теряют на месте морфологию и взаимодействий, которые, в свою очередь, в значительной степени влияет на их молекулярные и клеточные свойства. Протокол, описанный здесь позволяет для выделения целых цереброваскулярных фрагментов без необходимости специфических антител или трансгенных мышей пятен, предлагает хорошую альтернативу в качестве общей структуры изолированных сосудов головного мозга сохраняется, таким образом, уменьшая воздействие на их молекулярных свойств. Изолированные сосуды затем могут быть использованы для изучения активности генов, синтез белка и регулирования в BBB качестве недавно описал 20,21 . Наконец, по сравнению с лазерной захвата микродиссекции 22,23 Настоящий Протокол является недорогой, легко выполнять и быстро адаптируется к любому лаборатории.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Решения и материалы

  1. Готовят растворы выделение сосудов: В1, добавить 1,5 мл 1М HEPES 150 мл HBSS; В2, добавить 3,6 г декстрана 20 мл B1; В3, добавляют 1 г БСА на 100 мл B1.
  2. Измените держатель фильтра путем разрезания дна от верхней части завинчивания.
  3. Подготовка Иммуноокрашивание решения: Фиксация решения, 4% параформальдегида в PBS рН 7,4; Пермеабилизирующего / блокирующий раствор, развести козьей сыворотки до 5%, а Тритон X100 до 0,25% в PBS рН 7,4.
    Примечание: Фиксация зависит от типа используемого первичными антителами.

2. Препарирование

Примечание: стерильных условиях не требуется, если сосуды не используются для целей клеточной культуры.

  1. Приготовьте стакан емкостью 150 мл с 20 мл B1. Держите на льду и накрыть парафильмом, чтобы избежать загрязнения воздуха.
  2. Глубоко анестезию мыши под капотом с небольшим бумажным полотенцем, смоченным в 1 мл чистого Isoflurane, добавляемая IntО клетку. Анестезия проверяется отсутствие реакции на носок щепотку. Убейте мышь путем смещения шейных позвонков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги осуществляются в соответствии с национальными и институциональных норм.
  3. Дополнительно: Выполнение внутрисердечной перфузии 20 мл PBS 1X, чтобы исключить содержание в крови 24.
  4. Раздел кожа со скальпелем от шеи к носу и вытащить его. Удалить все загрязняющие волосы с PBS 1x.
  5. Чтобы открыть череп, сначала вставить ножницы вперед к обонятельной луковицы и открыть ножницы для разрушения черепа на две части.
  6. Осторожно снимите мозга с помощью шпателя мозга. Рассеките из сосудистое сплетение из боковых желудочков, как они будут загрязнять подготовку кровеносного сосуда 38.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необязательно: заключительная подготовка будет содержать паренхимы и мозговых оболочек сосудов. Если не требуется, мозговых оболочек может быть снята в соответствии с процедурой, описанной на 38.
  7. Трansfer мозг в химический стакан, содержащий раствор B1 на льду. До 8 мозги можно лечить вместе.

3. Мозговая ткань Гомогенизация

  1. Использование двух скальпели, вручную и энергично бить мозг в B1 решения впоследствии получения небольшие кусочки приблизительно 2 мм.
  2. Однородный препарат с автоматизированной Dounce гомогенизатор, выполняя 20 ударов в 400 оборотов в минуту. Убедитесь, что стеклянная трубка поддерживается на льду и что верхняя часть douncer находится в растворе при перемещении вверх и вниз, таким образом, чтобы предотвратить образование воздушных карманов. Если несколько образцов готовятся, помыть douncer с ионизированной водой между каждым гомогенизации.

4. Очистка судно

  1. Передача гомогената в 50 мл пластиковую пробирку и перейти к центрифугированием при 2000 г в течение 10 мин при 4 ° С. Большой белый интерфейс (в основном миелина) образуют на верхней части осадка судна (красный, если не проводили перфузию).
  2. Удалите супернатант. Осадок судно и белый интерфейс остаются прикрепленными вместе. Добавьте 20 мл ледяной решения В2 и встряхнуть пробирку вручную и энергично в течение 1 мин.
  3. Перейти ко второму центрифугированием при 4400 г в течение 15 мин при 4 ° С. Миелиновая теперь образуют плотный белый слой на поверхности надосадочной жидкости.
  4. Осторожно снимите миелина слой от стенок трубки, удерживая трубку и медленно вращая его, чтобы супернатант пройти вдоль стен. Отменить миелин с надосадочной жидкостью. Осадок, содержащий сосуды остается прикрепленной в нижней части трубки.
  5. Пятно внутри стенки трубы с впитывающей бумагой, обернутой вокруг 5 мл пластиковую пипетку и удалить все остатки жидкости, не касаясь осадок судна. Держите трубку в перевернутом положении на фильтровальную бумагу, чтобы слить оставшуюся жидкость.
  6. Приостановить осадок в 1 мл ледяной решения B3 с помощью пипетки вверх и вниз с низким связывания советы, keepiнг трубку на льду, а затем добавить еще 5 мл раствора В3. Убедитесь, что сосуды распределены как можно больше и не образуют агрегаты.

5. Фильтрация

  1. Приготовьте стакан на льду 30 мл охлажденного льдом раствора В3. Накрыть парафильмом, чтобы избежать загрязнения воздуха.
  2. Поместите мкм сетчатый фильтр на модифицированном держателе фильтра 20 на верхней части колбы Becker и уравновешивают путем применения 10 мл охлажденного льдом раствора В3.
  3. Налейте подготовку сосуда на фильтре и промыть сосуды с 40 мл охлажденного на льду раствора В3.
  4. Восстановление фильтр с помощью щипцов чистые и немедленно погрузить его в стакан, содержащий раствор B3. Снять сосуды из фильтра путем встряхивания мягко.
  5. Налейте содержание стакан в 50 мл пластиковую пробирку и центрифугируют при 2000 г в течение 5 мин при 4 ° С.
  6. Примечание: В качестве альтернативы, подвеска сосудов головного мозга ", начиная с шага 4.6 можно фильтровать на мкм сетчатый фильтр 100.В этом случае более крупные суда преимущественно удерживается на фильтре, а проточный содержит микрососудов (в основном капилляров), которые затем фильтровали на фильтре 20 мкм меш, как описано выше.
  7. Ресуспендируют гранул микрососудов в 1 мл охлажденного льдом раствора В3 и передать его с помощью пипетки его в 1,5 мл пробирку Эппендорфа. Центрифуга при 2000 г в течение 5 мин при 4 ° С.

6. Фиксация, пермеабилизирующего и блокировка

  1. Передача судов по пипетки в 0,2 мл ПЦР пробирки, содержащие PBS, используя 1,0 мл низкой связывания наконечник. Будьте осторожны, не касаясь суда, поскольку они могут придерживаться внешней части наконечника. Выполните все следующие шаги под бинокулярным микроскопом.
  2. Для каждого из следующих средних изменений, оставить пробирки на лед, пока сосуды не достигли дна, и пипетки из большинства жидкостей с помощью длинных и вещь гель-погрузочные советы пипетки.
  3. Удалить большую часть PBS и добавляют 200 мкл раствора фиксирующего.Приостановка сосуды при встряхивании мягко и инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре.
  4. Внесите из фиксатора решение и заменить его с 200 мкл 1x PBS (первой стирки), инкубировать 5 мин при комнатной температуре и повторите этот шаг 3 раза. Каждый раз, убедитесь, что судно правильно опустились на дно пробирки и пипетки вне 1x PBS, обеспечивая сосуды не коснулся.
  5. После последней промывки, замены 1X PBS в пермеабилизации / блокирующего раствора и инкубируют 1 час при комнатной температуре, ресуспендирования сосуды при встряхивании осторожно, время от времени.

7. Иммуноокрашивание

  1. Замените пермеабилизирующего / блокирующий раствор с соединением первичных антител (см ссылки антител, используемых здесь и разведения в материалах шаблона таблицы) разбавленных в пермеабилизации / блокировки решения, и инкубировать при температуре 4 ° CO / N.
  2. После 3 промывок PBS в при комнатной температуре, инкубировать сосуды с соединением вторичных антител, разведенного в PBS в течение 2 часовпри комнатной температуре.
  3. Примечание: мы настоятельно рекомендуем выполнять ядерное окрашивание с Hoechst (1: 2000) или DAPI (1: 2000) для того, чтобы отличить сосуды от загрязняющих возможно волоски или пыли под микроскопом.
  4. После 3 промывок PBS в, ресуспендируют сосуды в 50 мкл PBS.

8. Монтаж и наблюдение

  1. Подготовьте наконечник с силиконом стеклянного капилляра: вырезать наконечник пипетки P200 с помощью скальпеля и отрегулируйте капилляр внутри. Примерный объем капилляра 40 мкл.
  2. Передача судам стекле с помощью силицированного стеклянный капилляр и тщательно удалить жидкость с куском фильтровальной бумаги.
  3. Нанесите каплю на монтажной среды на судах и провести покровное на 45º, позволяя падение распространяться по краю скольжения. Пусть уходят покровное и позволит среднего распространяться медленно. Пусть это сухой O / N в РТ с защитой от света. Суда могут наблюдаться при fluorescЛОР конфокальной микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Здесь мы опишем протокол, позволяющий для механической изоляции сосудов головного мозга 14. Рисунок 1 суммирует основные этапы этого метода. Архитектура сосудов головного мозга является сложным и включает в себя несколько типов клеток, т.е., эндотелиальные клетки, запечатанные плотных контактов, в окружении перицитами, гладкомышечных клеток и астроцитов ноги процессов 9. Таким образом, после выделения сосудов головного мозга, мы стремились охарактеризовать структуру очищен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Барьер гематоэнцефалический регулирует прохождение физиологических веществ в и из ЦНС и защищает его от потенциально вредных веществ, присутствующих в крови. Он участвует в нескольких патологий ЦНС, в том числе нейродегенеративных заболеваний 2 и опухолей головного мозга 28. Крайне низкая проницаемость ГЭБ затрудняет также прохождение терапевтических агентов, направленных нервные клетки и развитие методов, намеревающихся открыть обратимо ГЭБ без каких-либо пагубные последствия для мозга является оч...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Labex MemoLife и по ARSEP (Фонд Pour l'помощник а-ля Recherche сюр-ла-уплотнять ан бляшек)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Измельчитель тканей Размер CThomas Scientific3431E25
центрифуга 5415  REppendorf
центрифуга 5810 REppendorf5811000320
Высокопроизводительный модульный стереомикроскопLeicaMZ6
Компактная система обеспечивает высокое качество наконечников Leica LED1000LeicaLED1000
низким связыванием (P1000)Sorenson BioScience14200T
Swinnex 47 мм держатель фильтра PP 8/PkMilliporeSX0004700
Нейлоновый сетчатый фильтрующий диск Hydrophilic 20 µ m 47 мм 100/PkMilliporeNY2004700
Нейлоновый сетчатый фильтрующий диск Hydrophilic 100 µ m 47 мм 100/шт.Миллипор<a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY1H04700">NY1H04700
Стандартная стенка Боросиликатная трубкаSutter InstrumentB150-86-7.5
Предметные стекла для микроскопаThermo Scientific1014356290F
Покровные стекла, толщина 1Thermo ScientificP10143263NR1
0,2 мл Тонкостенные тубы и куполообразная крышкаThermo ScientificAB-0266
  ПАРАПЛЕНКА M (размер рулона 4 дюйма &в раз; 125 футов)SigmaP7793-1EA
HBSS, без кальция, без магния, без фенолакрасного Life technology14175-129
HEPES (1M)Life technology15630056
декстран от Leuconostoc spp. Mr ~70,000Sigma31390
Бычий сывороточный альбуминSigmaA2153
10x PBSEuromedexET330
16% формальдегид (w/v), без метанола Thermo Scientific28908
Triton X-100SigmaX100
bisBenzimide H 33342 тригидрохлорид (Hoechst)Sigma14533
Монтажная среда Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Изолектин GS-IB4 Из Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate; Разведение 1/100Life technologyI21411
Agrin (кролик) ; разведение 1/400любезно предоставлено доктором Маркусом А. Руэггом
Anti ZO-1 (мышь, клон 1A12)Life technology33-9100разведение 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (мышь, клон 1A4)SigmaA2547  разведение 1:500
Anti GFAP (мышь, клон GA5)SigmaG3893  разведение 1:500
Anti AQP4 (кролик)SigmaA5971  разведение 1:500
Anti Cx43 (мышь, клон  2)BD Biosciences610061  разведение 1:500
Anti Olig2 (кролик)MilliporeAB9610  разведение 1:200
Anti NF-M (мышь)предоставлено доктором Битом М. Ридерером, Университет Лозанны, Швейцария.  разведение 1:10
Anti Iba1 (кролик)Wako019-19741  разведение 1:400
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) АнтителаLife технологияA11029  разведение 1:2,000
Козий антикролик IgG (H+L) Вторичное антитело, конъюгат Alexa Fluor 488Life technologyA11034  разведение 1:2,000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) АнтителаLife технологияA21424  разведение 1:2,000
Козье антитело против кролика IgG (H+L) Вторичное антитело, конъюгат Alexa Fluor 555Life technologyA21429  Разбавление 1:2,000

Ссылки

  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
  2. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  3. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12 (1-2), 54-61 (2007).
  4. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  5. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  7. Hall, C. N., Reynell, C., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
  8. Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
  9. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  10. Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation. Cell Metabolism. 14 (6), 724-738 (2011).
  11. Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
  12. Iadecola, C., Nedergaard, M. Glial regulation of the cerebral microvasculature. Nature Neuroscience. 10 (11), 1369-1376 (2007).
  13. Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex. Science (New York, N.Y.). 185 (4155), 953-955 (1974).
  14. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -M., Declèves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  15. Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier. Biochemical Journal. 276 ((Pt 3)), 745(1991).
  16. Boado, R. J., Pardridge, W. M. The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier. Biochemical and Biophysical Research Communications. 166 (1), 174-179 (1990).
  17. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Research. 192 (1), 17-28 (1980).
  18. Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells. PLoS ONE. 5 (10), e13741(2010).
  19. Zhang, Y., Chen, K., et al. An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex. The Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  20. Boulay, A. -C., Saubaméa, B., et al. The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9(2015).
  21. Boulay, A. -C., Mazeraud, A., et al. Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43. The Journal of Neuroscience. 35 (10), 4427-4439 (2015).
  22. Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection. Brain Research Protocols. 9 (3), 206-213 (2002).
  23. Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).
  24. Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).
  25. Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Central nervous system pericytes in health and disease. Nature Neuroscience. 14 (11), 1398-1405 (2011).
  26. Ezan, P., André, P., et al. Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2012).
  27. Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M. Signaling at the gliovascular interface. The Journal of neuroscience. 23 (27), 9254-9262 (2003).
  28. Dubois, L. G., Campanati, L., et al. Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418(2014).
  29. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
  30. Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S. Isolated microvessels: the blood-brain barrier in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4544(1978).
  31. Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents. Blood Vessels. 17 (4), 173-186 (1980).
  32. Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier. Journal of neurochemistry. 44 (4), 1138-1141 (1985).
  33. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
  34. Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. Purification of endothelial cells from rat brain. Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).
  35. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. J Neurosci Methods. 207 (1), 80-85 (2012).
  36. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
  37. Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro. 17 (4), 353-362 (1981).
  38. Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
  39. Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells. Pharmaceutical Research. 24 (4), 688-694 (2007).
  40. Warren, M. S., Zerangue, N., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacological Research. 59 (6), 404-413 (2009).
  41. Geier, E. G., Chen, E. C., et al. Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94 (6), 636-639 (2013).
  42. Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates. Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1151-1159 (1998).
  43. Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Sci Rep. 3, 1500(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Очистка сосудов головного мозга мыши
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.