Методическая статья

Выделение митохондрий из минимальных количествах мыши скелетных мышц для измерения Высокая пропускная микропланшетов дыхания

12.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53217

⸱

13 ноября 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Department of Human Nutrition, Foods, and Exercise, Virginia Tech, 2The Metabolic Phenotyping Core, Virginia Tech, 3Seahorse Bioscience

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем модификацию ранее описанного метода, которая позволяет выделить высококачественные и очищенные митохондрии из меньшего количества скелетных мышц мышей. Эта процедура приводит к образованию высокосвязанных митохондрий, которые дышат с высокой функцией во время анализа респирометирка на основе микропланшетов.

Аннотация

Неблагополучные скелетные мышечные митохондрии играют важную роль в обмене веществ наблюдается измененной со старением, ожирения и сахарного диабета II типа. Митохондриальные respirometric анализы из изолированных препаратах митохондрий позволяют для оценки функции митохондрий, а также определения механизма (ов) действия лекарственных средств и белков, которые модулируют метаболизм. Текущие процедуры изоляции часто требуют большого количества ткани, чтобы получить высокие митохондрии качества, необходимые для respirometric анализов. Методы, представленные здесь, описывают, как высокое качество очищают митохондрии (~ 450 мкг) может быть выделен из минимальных количествах (~ 75-100 мг) мыши скелетных мышц для применения в дыхательных измерений с высокой пропускной способностью. Мы решили, что наш метод изоляции дает 92,5 ± 2,0% нетронутыми митохондрии путем измерения активности цитрат-синтазы спектрофотометрически. Кроме того, Вестерн-блот анализ в изолированной митохондрии в результате слабый экспрессии cytosoLIC белок, GAPDH и надежный выражение белка митохондрий, COXIV. Отсутствие видного GAPDH полосы в изолированных митохондриях свидетельствует о небольшом загрязнения от не-митохондриальных источников во время процедуры изоляции. Самое главное, что измерение O 2 скорости потребления с технологией, основанной микро-пластины и определения дыхательный коэффициент (РКП) для связанных respirometric анализов показывает весьма сочетании (RCR;> 6 для всех анализов) и функциональные митохондрии. В заключение, добавление отдельной стадии мясорубки и значительно снижая приводом двигателя скорость гомогенизации сообщалось ранее метода позволило изоляции высокого качества и очищенной митохондрий от небольших количеств мыши скелетных мышц, что приводит к высокой связанных митохондрий, что дышать с высокой функции во микропланшета на основе respirometirc анализов.

Введение

Основной функцией митохондрий является производство АТФ путем окислительного фосфорилирования. Тем не менее, митохондрии выполняют множество других важных клеточных функций, включая, помимо прочего: производство и детоксикацию активных форм кислорода, регуляцию цитоплазматического и митохондриального кальция, транспортировку органелл, ионный гомеостаз и участие в апоптозе1,2. Поэтому неудивительно, что дисфункциональные митохондрии играют роль во многих патологических заболеваниях, таких как старение, нейродегенеративные заболевания, сердечно-сосудистые заболевания, рак, ожирение и диабет3,4. Важно отметить, что митохондрии скелетных мышц конкретно участвуют во многих из этих патологий3-5.

Анализы митохондриального дыхания с использованием изолированных митохондрий позволяют оценить цепь переноса электронов и функцию окислительного фосфорилирования, а также определить механизм(ы) действия лекарств и белков, модулирующих метаболизм. Существуют процедуры выделения митохондрий для различных типов тканей и клеток различных видов6,7. Тем не менее, эти процедуры часто требуют большого количества тканей/клеток для получения высококачественного митохондриального материала, необходимого для классических респирометрических анализов.

Анализы респирометира на основе микропланшетов позволяют проводить высокопроизводительные измерения с использованием минимального количества изолированных митохондрий, часто всего несколько μг на лунку8. Таким образом, мы представляем модификацию ранее опубликованных методов7, позволяющую выделить высококачественные митохондрии из меньшего количества скелетных мышц мыши для использования в анализах респирометира на основе микропланшетов. Кроме того, предложены методы установления качества препарата митохондриального выделения и целостности митохондриальных мембран. Учитывая, что митохондрии скелетных мышц участвуют во многих патологических состояниях, измерение потребленияO2 в механических исследованиях становится все более распространенным в биомедицинских исследованиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Исследования на животных проводились в соответствии с утвержденным протоколом по Уходу за животными и использовать комитета в Вирджинском политехническом институте и государственном университете.

1. Настройка (Время: ~ 45 мин)

  1. Оттепель замороженных магазины 0,25% трипсина, изоляции буфера для митохондрий (IBM) 1 и IBM2 в водяной бане 37 ° C.
  2. Промыть стекла и рассекает инструменты в 70% этаноле с последующим воды высокой степени чистоты.
  3. Подготовка 0,05% раствора трипсина из 0,25% трипсина складе путем разбавления 1 часть трипсина в 4-х частях IBM1.
  4. Смешайте протеазы и ингибитор фосфатазы коктейль буфера для лизиса клеток (1: 100) в соотношении 1,5 мл микроцентрифужных трубки с винтовой крышкой.
  5. Кратные 5 мл (5 мл / мышь) в 0,05% трипсина в 15 мл пластиковую пробирку.
  6. Установите приводом от двигателя ткани гомогенизатора до 80 оборотов в минуту.

2. Выделение митохондрий скелетных мышц (Время: ~ 90 мин)

  1. Эвтаназии мыши по CO 2 ингаляции, с последующим смещением шейных позвонков.
  2. Удалить красный мышцы от четырехглавой мышцы и, икроножной который включает камбаловидной (~ 75-100 мг общее), как описано в следующих шагах:
    1. Очистите кожу к мыши.
    2. Удалить жировой ткани над четырехглавой точки происхождения. Вырезать сухожилия четырехглавой мышцы, которая крепится к коленной чашечки с мелкими наконечником ножницами.
      Примечание: четырехглавой идентифицируется по анатомическом положении на передней части проксимального отдела бедренной кости.
    3. Медленно отрезать апоневроз между костью и четырехглавой, избегая при этом бедренную артерию, чтобы освободить четырехглавой мышцы от костей. Вырезать сухожилия с мелкими наконечником ножницами в точке происхождения на бедра, чтобы освободить четырехглавой мышцы и поместите четырехглавой мышцы в охлажденный PBS.
    4. Удалить видимый жировой ткани над четырехглавой с ножницами. Флип четырехглавой над тем, что часть мышцы, которая была покрывающей бедренную сталкивается Uп. Откройте четырехглавой мышцы щипцами в движении Фаннинг. Снимите два видимых красных мышечных частей от каждого лепестка с мелкими наконечником ножницы и место в стакан, содержащий 5 мл охлажденного IBM1.
      Примечание: четырехглавой мышцы бедра выглядят как две лопасти с полосой красной мышцы размещается в боковой кромки каждого лепестка.
    5. Разрежьте кожу, покрывающий ахиллова сухожилия с прекрасными наконечниками ножницами и очистить кожу к мыши. Вырезать подвергается ахиллово сухожилие и очистить мышцы к телу мыши.
    6. Вырезать сухожилия на латеральной и медиальной мыщелков бедренной кости с мелкими наконечником ножницами по освобождению икроножной и место икроножной прикрепленный к его сухожилий в охлажденном PBS.
    7. Переверните икроножной снова и шелушиться камбаловидной мышцы и поместить в стакан, содержащий 5 мл охлажденного IBM1. Вентилятор открыть икроножной. Снимите три визуальные красные мышечные части (две боковые и одна медиальная поверхностные красные полоски) с тонкой наконечником ножницамис и передавать их в стакан, содержащий 5 мл охлажденного IBM1.
  3. Удалить другой ~ 75-100 мг красного мышцы от другой ногой мыши (как описано в шаге 2.2) и помещают в 1,5 мл микроцентрифужных трубки с протеазы и ингибитора фосфатазы коктейль и буфера для лизиса клеток (50 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 1% додецилсульфата натрия, 0,5% дезоксихолат натрия, 1% полиоксиэтилен (9) nonylphenylether, разветвленными. Сразу флеш-замораживать этот второй образец в жидком азоте для дальнейшего использования в вестерн-блоттинга (см шаг 6,1).
  4. Поместите предварительно охлажденной, плоский пластиковую поверхность на льду в большом ведре. Налейте капли IBM1 на пластиковой поверхности и использовать пинцет, чтобы разместить все секционного красной мышцы (шаг 2.2.4 и 2.2.7) в IBM1 капли. Фарш мышечной ткани в течение 2 мин с использованием 3 односпальные лезвия бритвы от меняющихся край бритвы каждые 40 сек.
  5. Передача измельченной ткани в новый стакан с 5 мл свежей IBM1, удерживая пластиковую поверхность над йе стакан и соскабливания мышцы в стакан с бритвенным лезвием. Возьмите это решение и осушить его через ситечко 100 мкм клеток помещали на 50 мл коническую трубку.
  6. Пятно ткани с деликатной задачей стеклоочистителя, а затем передать его в 5 мл 0,05% раствора трипсина. Используйте пинцет, чтобы удалить ткань от стеклоочистителя задач.
  7. Инкубируйте мышечной ткани на льду в течение 30 мин в 0,05% -ном растворе трипсина.
  8. Спина 15 мл коническую пробирку, содержащую трипсин / мышечной смесь при 200g в течение 3 мин при 4 ° С.
  9. Вылейте трипсина супернатант в контейнер для отходов и ресуспендируют осадок с 3 мл ледяной IBM1. Передача ткани в 45 мл стеклянный гомогенизатор трубки. Промыть 15 мл коническую трубку с другим 1,5 мл IBM1 собрать оставшуюся образец и добавить к стеклянном гомогенизаторе трубки.
  10. Поместите стакан гомогенизатора трубку в стакан или пластиковый контейнер, заполненный наполовину льдом, так что стекло гомогенизатор движется минимально в стакан.
  11. Однородный ткани / IMB1 смесь с PTFE пестик, подключенных к приводом от двигателя ткани гомогенизатор с 10 проходов при 80 оборотах в минуту. Держите дно каждого прохода для ~ 2 сек.
  12. Передача гомогената ткани на новый 15 мл коническую трубку и промойте стекло гомогенизатор трубку с 6,5 мл IBM1. Вылейте IBM1 в 15 мл коническую пробирку, содержащую гомогената ткани.
  13. Спин 15 мл коническую трубку при 700 г в течение 10 мин при 4 ° С. Аккуратно влить супернатант в стеклянной высокопрочной центрифужную пробирку и отбросить гранул.
  14. Спин супернатант из вышеуказанной стадии при 8000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
  15. Удалить супернатант и IBM1 повторно приостанавливать осадок путем медленного добавления 500 мкл IBM2. Отрежьте конец пипетки и осторожно гомогенизации осадок в IBM2 с смешиванием движения. Добавить еще 4,5 мл IBM2 к смеси после осадок полностью приостановлено.
    Примечание: Избегайте чрезмерного растирание, ломая более крупные гранулы куски, как тего может привести к повреждению мембран митохондрий.
  16. Спин / гомогената ткани IBM2 в 8000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
    Примечание: Этот шаг может быть повторен в чистом высокопрочной центрифужную пробирку для более точного количественного определения белка изолированной митохондрии в шаге 4, так как остаточного BSA может способствовать общего содержания белка.
  17. Удалить супернатант и осторожно, но полностью повторно приостанавливать осадок путем добавления двух 25 приращения мкл IBM2 с кончика пипетки с его точки отсечения. Осторожно перемешать и смешать осадок после каждого добавления 25 мкл IBM2. Поместите эту митохондриальную акции на льду.

3. Усреднение Всего Tissue Lysate (Время: ~ 45 мин; может быть сделано во шаге 7)

  1. Удалить мышцу от помещали в жидкий азот со стадии 2.3, и инкубируют при комнатной температуре до полного оттаивают.
  2. Фарш ткани для ~ 30 сек на льду с мелкими наконечником ножницами.
  3. Добавьте две 100 мкл ложки Zirconium оксида Бусы к 1,5 мл микроцентрифужных трубки с винтовой крышкой из стадии 3.2, который содержит фарш ткани. Перемешать ткани в тканевом гомогенизаторе шаровой мельнице с использованием двух до трех циклов 5 мин при установке скорости 4-6 (средние настройки).
  4. Спин смеси со стадии 3.3 при 12000 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Удалить супернатант, используя пипетки с 1000 мкл после спина и передачи в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Откажитесь от гранул и поместите супернатант на льду.

Определение 4. Белок (Время: ~ 30 мин)

  1. Определить концентрацию белка в ткани лизата целом (шаг 3.4) и митохондриальной складе (шаг 2.17), используя для анализа белка BCA комплект в соответствии с требованиями завода-изготовителя.

5. Митохондрии Мембрана целостности; Цитратсинтазу (CS) Деятельность (Время: ~ 15 мин)

  1. Сделайте два отдельных 1: 20 разведениях митохондриальной складе в воды высокой степени чистоты. Добавить0,1% тритона Х-100 в одном образце и разрушать ультразвуком его на низком уровне (765 Вт, амплитуда 2). Оставьте другой разбавления на льду. Вернуться образец в лед после обработки ультразвуком.
  2. Выполнение цитрат-синтазы анализа как с не-ультразвуком и обрабатывали ультразвуком митохондрий разведений с использованием спектрофотометрического анализа, как описано ранее 11,12.
  3. Определить процент неповрежденных мембран митохондрий с помощью следующих уравнений:
    (Не ультразвуком активность CS ÷ ультразвуком CS активность) * 100


100- N (процентов достигается сверху)

6. Митохондрии Изоляция качества; Вестерн блот (Время: Согласно Лаборатории протокола)

  1. Выполните Вестерн-блоттинга на лизата всей ткани и изолированными митохондриями, как описано ранее 12.
    Примечание: Используйте первичных антител для GAPDH (1: 1000 разведение в 5% BSA / TBS-T) и COXIV (1: 1000 разведение в 5% обезжиренноемолоко / TBS-T), а затем анти-козел, и вторичными антителами кролика, соответственно (1: 10000).

7. Анализ Respirometric Выполнить (Время: ~ 90 мин)

  1. Выполняют желаемые respirometric анализа с использованием микропланшет-основанную O 2 измерения расхода технологии, как описано ранее (см сопутствующую статью и Роджерс и др 8).
  2. Определить дыхательный коэффициент (РКП), путем деления состояние 3 Государственной 4o (RCR) или деления государство 3U Государственной 4o. Используйте либо средний (средний) точку, или высокий (государство) и 3 низкие цены (Государственный 4х) от точки к точке следов при определении RCR.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Цитрат-синтазы служит мерой для целостности мембраны, так как цитрат-синтазы находится в внутренней митохондриальной мембраны, и, таким образом, не должны присутствовать в суспензии митохондрий с интактными оболочками. Рисунок 1 представляет цитрат-синтазы в не обрабатывали ультразвуком митохондрий образцов по сравнению с ультразвуком Образцы из той же изоляции. Ультразвуком результаты митохондрий в статистически значимое увеличение в цитрат-синтазы (P <0,01). Важно отметить, что 92,5 ± 2,0% митохонд...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Методы, представленные здесь, обеспечивают подробное описание митохондриальной процедуры выделения из минимальных количествах (~ 75-100 мг) мыши скелетных мышц. Эта процедура изоляции способен дать высокую функционирование митохондрий, чистый (~ 450 мкг), о чем свидетельствует вывода 2 норм потребления, ценности RCR, максимальная цитрат-синтазы активности и экспрессии белка из иммуноблоттинга. Важно отметить, что митохондрии, выделенные из этой процедуры может быть использован для нескольких анализов respirom...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Джордж Роджерс является сотрудником компании Seahorse Bioscience, которая производит инструмент, для которого был модифицирован этот протокол.

Благодарности

Научно-исследовательский институт Fralin Life Science и Центр метаболического фенотипирования в Политехническом университете Вирджинии поддержали эту работу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Эссенциально жирныйСигма ОлдричA6003Н/Д
Бескислотный - BSA
Tris/HClPromegaH5123Н/Д
KCLСигма ОлдричP9541Н/Д
Трис БазаPromegaH5135н/Д
ЭДТАСигма ОлдричE6511Н/Д
ЭГТАSigma AldrichE4378Н/А
СахарозаSigma AldrichS7903Н/Д
Д-МаннитолСигма Олдрич63559Н/Д
Трипсин-ЭДТА (0,25%), фенол красныйThermo Scientific25200-056Н/Д
Хлорид натрия
белые кристаллы или кристаллический порошок
≥ 99.0 %		Fisher ScientificBP3581N/A
Додецилсульфат натрияSigma AldrichL3771 Н/Д
Дезоксихолат натрияSigma AldrichD6750 Н/Д
Полиоксиэтилен (12) нонилфениловый эфир, разветвленныйSigma Aldrich238651Н/Д
Однолезвийные бритвенные лезвияFisher Scientific12-640N/A
Falcon- 100 мкМ Нейлоновые клеточные фильтрыFisher Scientific352360Н/Д
Протеаза и протеаза Halt Коктейль ингибитора фосфатцаThermo Scientific1861284N/A
1,5 мл микроцентрифужные пробирки с завинчивающейся крышкойThermo Scientific3474N/A
Гранулы оксида цирконияFisher ScientificC9012112N/A
GAPDH антитела (1D4)Santa Cruz Biotechnologysc-59540N/A
Anti-COXIV антителаCell Signaling4844sЛюбой белок внутренней мембраны митохондриальной внутренней мембраны будет достаточным
пероксидазой конъюгированный аффинипур Ослик, антикролик IgG (H+L)Jackson ImmunoResearh711-035-152N/A
пероксидаза конъюгированный аффинипур Козлятник, антимышиный IgG (H+L)Jackson ImmunoReserh115-001-003N/A
Triton-X100Sigma AldrichX100N/A
Набор для анализа белка BCA Pierce  Thermo Scientific23225Н/А
Пировиноградная кислота, 98%Sigma Aldrich107360Хранить при 4 градусах; C,pH до 7,4 с KOH перед использованием в респирометрическом анализе
Янтарная кислотаSigma AldrichS9512Хранить при комнатной температуре, pH до 7,4 с KOH перед использованием в респирометрическом анализе
L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥ 95%Sigma AldrichM6413Хранить при комнатной температуре, до 7,4 с KOH перед использованием в респирометрическом анализе
L-глутаминовую кислотуSigma AldrichG1251Хранить при комнатной температуре, до 7,4 с KOH перед использованием в респирометрическом анализе, до 7,4 с KOH перед использованием в респирометрическом анализе
Palmitoyl L-карнитин хлоридSigma AldrichP1645Хранить при -20 °C
Олигомицин А, &ge 95% (ВЭЖХ)Sigma Aldrich75351хранить при -20 °°; C
Карбонилцианид 4-(трифторметокси)Sigma AldrichC2920хранить при 2-8 °°; C
phenylhydrazone
≥ 98% (TLC), порошок [FCCP]Антимицин
А из streptomyces sp.Sigma AldrichA8674Магазин при -20 градусов; C
Аденозин 5′-дифосфат монокалия соль дегидрат [ADP]Sigma AldrichA5285хранить при -20 °°; С, до 7,4 с KOH перед использованием в респирометрическом анализе
RotenoneSigma AldrichR8875Хранить при комнатной температуре

Ссылки

  1. Brand, M., Nicholls, D. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435, 297-312 (2011).
  2. Nicholls, D. G., Ferguson, S. Bioenergetics. , Academic Press. (2013).
  3. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, 1145-1159 (2012).
  4. Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. The mitochondrial genome in aging and senescence. Ageing Res. Rev. 18, 1-15 (2014).
  5. Dube, J. J., et al. Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 12, 1117-1124 (2014).
  6. Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods (San Diego, Calif). 26, 292-297 (2002).
  7. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat. Protoc. 2, 287-295 (2007).
  8. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS one. 6, e21746(2011).
  9. Guarino, R. D., et al. Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration. Biotechnol. and Bioeng. 86, 775-787 (2004).
  10. Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nat. Protoc. 1, 2563-2572 (2007).
  11. Hulver, M. W., et al. Elevated stearoyl-CoA desaturase-1 expression in skeletal muscle contributes to abnormal fatty acid partitioning in obese humans. Cell Metab. 2, 251-261 (2005).
  12. Frisard, M. I., et al. Toll-like receptor 4 modulates skeletal muscle substrate metabolism. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 298, e988-e998 (2010).
  13. Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subjects of Biochem. 17, 65-134 (1956).
  14. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. JoVE. , (2011).
  15. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal. Biochem. 418, 213-223 (2011).
  16. Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. J. Appl. Physiol.: Respir., Envir. and Ex. Physiol. 48, 23-28 (1980).
  17. Asmann, Y. W., et al. Skeletal muscle mitochondrial functions, mitochondrial DNA copy numbers, and gene transcript profiles in type 2 diabetic and nondiabetic subjects at equal levels of low or high insulin and euglycemia. Diabetes. 55, 3309-3319 (2006).
  18. Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи