Вертикальная культура капель ex vivo является альтернативой современным экспериментальным методам in vitro и in vivo. Этот протокол прост в исполнении и требует меньшего количества реагента, в то же время позволяя манипулировать и изучать васкуляризацию плода, морфогенез и органогенез.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Исследуя органогенез в утробе матери является технически сложным процессом, в плацентарных млекопитающих из-за недоступности реагентов для эмбрионов, которые развиваются в матке. Недавно разработанная экс естественных условиях в вертикальном положении метод капель культура обеспечивает привлекательную альтернативу исследований, проведенных в период внутриутробного развития. Экс естественных капель культура дает возможность исследовать и управлять клеточных взаимодействий и различные сигнальные пути с применением различного блокирования и активирующих соединений; Кроме того, влияние различных фармакологических реагентов на разработке конкретных органов могут быть изучены без нежелательных побочных эффектов системного доставки лекарств в матке. По сравнению с другими системами в пробирке, капли культура не только позволяет способности к обучению трехмерного морфогенеза и межклеточных взаимодействий, которые не могут быть воспроизведены в линии клеток млекопитающих, но и требует существенно меньше Reagents чем другие экс естественных условиях и в пробирке протоколов. Эта статья демонстрирует правильное мыши плода рассечение органов и вертикально методы капли культуры, а затем весь орган иммунофлюоресценции, чтобы продемонстрировать эффективность метода. Экс естественных способ культивирования капель позволяет формировать архитектуры органа сопоставимы к тому, что наблюдается в естественных условиях и могут быть использованы для изучения в противном случае трудно-исследования процессов в связи с эмбриональной летальности в моделях в естественных условиях. В модельной системе приложений, ингибитор малые молекулы будут использованы для исследования роли васкуляризации в яичек формообразования. Это экс естественных способ культивирования капелек с возможностью расширения до других органов и систем плода, таких как легких и потенциально других, хотя каждый орган должен быть широко изучены, чтобы определить, какие специфические для органа модификации протокола. Эта система органом культура обеспечивает гибкость в экспериментирования с органами плода, и результаты obtained используя этот метод поможет исследователям получить представление развития плода.
Введение
Регенерации органов в естественных условиях в организме человека очень ограничены; Поэтому, тканевая инженерия, развитие тканей и органов из отдельных клеток, пожертвованных хозяина, становится привлекательной потенциал терапии замены органов. Правда, для этого терапевтическая стратегия, чтобы быть успешным, факторы и клеточные взаимодействия участвующих в морфогенезе органа должны быть тщательно изучены и хорошо изучены. Из-за неспособности изучения развития отдельных органов с традиционными подходами, исследователи обратились к альтернативным всей эмбриона или целых культур органов. Kalaskar др. 1 показали, что экс естественных условиях вся эмбриогенез культура дает сопоставимые результаты (в 58% культивируемых эмбрионов) в развитии внутриутробной, предполагая, что экс естественных условиях методы культура реальной альтернативой для органогенеза исследований.
Индивидуальный система органной культуры, такие, как этот бывший естественных УЦИплет система культуры, позволяет весь анализ орган, независимо от системных эффектов, в то время как позволяет манипулировать конкретного сигнального пути или клеточных взаимодействий с помощью того фармакологических реагентов или антител. Традиционно, изучение развития плода органа была ограничена трансгенных мышей и нокаут технологий, в дополнение к фармакологических реагентов, поставляемых материнской. Тем не менее, существуют технические вопросы, связанные с эти методы и процедуры в естественных условиях; большинство проблем вращаются вокруг эффектов воздействия на различные органы одновременно, что часто приводит к эмбриональной летальности. Дополнительной проблемой исследований манипулирования на развитие плода фармакологически является материнский эффект препаратов на эмбриональное развитие в утробе матери (например, материнской метаболизма препарата прежде чем он достигнет эмбриона), и если такие реагенты могут проходить через плацентарный барьер.
Описан метод целая культура органЗдесь был адаптирован из протокола, впервые описанным Maatouk и др. 2, в котором целые гонады эмбриона инкубируют в бывших естественных вертикальных культур капель. Одним из важных преимуществ культивирования эмбриональные половые железы, что ингибиторы низкомолекулярные легко получить доступ к весь орган по простой диффузии. . Дефолко др показали, что использование этого исключая виво капель способ культивирования в сочетании с ингибиторами низкомолекулярных может быть использован для изучения процессов и взаимодействий, происходящих во время развития гонад 3 сигнализации; эти процессы будет трудно рассмотреть в естественных условиях из-за технических проблем (например, прохождение препаратов через плаценту или летальности влияет несколько органов, используя генетические или фармакологические подходы).
Капелька культура является не только улучшение в некоторых аспектах более внутриутробно экспериментов, но и является улучшением по сравнению в пробирке и экс VIСистемы VO, а также. Использование клеточных линий для изучения морфогенеза крайне сложно, потому что они не имеют разнообразные типы клеток, отсутствие критических внеклеточного матрикса (ЕСМ) компоненты, которые позволяют формирования архитектуры органа и могут проявлять артефакты в сигнальных каскадов. Хотя тканевая инженерия добилась значительных улучшений в создании каркасов, имитирующих ECM, отсутствие знаний в отношении которых сигналы требуются каждого типа клеток во время органогенеза делает его сложным, чтобы построить систему органов в пробирке. Другие бывшие естественных систем были установлены ранее для изучения органогенеза, или, более конкретно формообразования, и были очень успешными для живой визуализации органов плода в агар 4, 5 transwells, фильтры 6, и другие эшафот матрицы 7,8. Преимущество системы капель культуры является то, что она позволяет изучение морфогенеза, предоставляя возможность использовать меньше реагентов, которые оften дорого, но и придания поверхности органом напряжение, что очень важно для роста и сигнализации возможностей 9.
В мыши, начальная яичко морфогенез происходит между эмбриональной (E) E11.5 этапы и E13.5; Эти этапы включают в себя оптимальное окно времени для изучения факторов, которые влияют на сексуальную конкретных дифференциации. Среди важных процессов, происходящих во время формирования семенников то поколение архитектуры семенников мозга и формирование семенников конкретных сосудистой сети. Используя этот исключая виво целого органа системы капель культуры, человек способен изменять мужской конкретных васкуляризации и ингибируют семенников морфогенез посредством использования ингибитора низкомолекулярных, что блокирует активность рецепторов для фактора роста эндотелия сосудов (VEGF); VEGF-опосредованной сосудистой реконструкции имеет решающее значение для развития яичек 10-12. Этот метод может успешно применяться к другим органам и может предназначаться определенное времяОкна развития. Всего монтажа изображений орган позволяет визуализировать жизненно важных структур, а также структурные и клеточные изменения, вытекающие из администрации различных ингибиторов. Важно отметить, что эта система имеет преимущество в том, что исследователь может обойти потенциальные вмешивающиеся эффекты от материнской введения препарата или системного нарушения во время естественных условиях в целевых стратегий генов. Таким образом, вся эта органом экс естественных условиях система культуры капель может значительно улучшить способность понимать взаимодействие и сигнализацию, которые происходят именно в рамках конкретных органов во время развития плода.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все мыши, используемые в этих исследованиях были CD-1 мышей, полученные от Charles River Laboratories. Предыдущие эксперименты культуры были также выполнены на других штаммов, таких как C57BL / 6J (данные не показаны), но любой штамм может быть использован. Беременные женщины были взрослые примерно 2-3 месяцев и были умерщвлены с помощью CO 2 ингаляции с последующим смещением шейных позвонков и двустороннего торакотомии до удаления эмбриона. Мышей содержали в соответствии с руководящими принципами NIH, и экспериментальные протоколы были одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животное Hospital Medical Center Цинциннати Детская с.
1. Подготовка инструментов, средств массовой информации, культуры и блюда
- Подготовка 70% -ным раствором этанола. Автоклав деионизированная вода (для принятия увлажненных камерах и делает / разжижающие растворы). Стерилизовать рассечение инструментов (щипцы, ножницы и игла 27 G шприцы) путем распыления вниз с 70% этанола.
- Подготовить10X забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), содержащий кальций и магний (80 г NaCl, 2 г KCl, 14,4 г Na 2 HPO 4, 2,4 г КН 2 РО 4, 6,75 мл 1 М CaCl 2, 3,75 мл 1 М MgCl 2 ). Движение, чтобы растворить в 1 л стерильной автоклавного водой, а затем отфильтровать через фильтровальную бумагу. Развести в 10 раз водой, чтобы сделать 1X PBS.
- Тепло инактивации фетальной бычьей сыворотки (FBS) при 55 ° С в течение 30 мин и фильтруют стерилизовать с помощью шприца 0,22 мкм фильтр.
- Подготовьте 38 мл 1X полной культуральной среде (DMEM, называется полным, cDMEM), состоящий из Игла в модификации Дульбекко (DMEM), 10% фильтруется тепла инактивированной ФБС и 1/100 разбавление пенициллина стрептомицин складе. Это обычно следует использовать свежие, но можно хранить при температуре 4 ° С в течение 1 месяца.
- Восстановить VEGFR тирозинкиназы II (ИТК II) в ДМСО при концентрации фондовой 5 мг / мл, и разбавляют акции с cDMEM сделать рабочий раствор. Окончательный концентрация для данного исследования является 1,875 мкг / мл в cDMEM. В соответствии с рекомендациями компании, растворы стабильны в течение до 6 месяцев при температуре -20 ° С. Что касается рабочих растворов, чтобы свежим и использовать в тот же день.
Примечание: Концентрация этого препарата в рабочем растворе должно быть в два раза выше, чем желаемой конечной концентрации (так как она будет в два раза разбавл в капле). В то же время, подготовить такой же объем, содержащий cDMEM такой же объем ДМСО для «контрольной» лечения. - Подготовьте хвост пищеварения реагенты (50 мм NaOH и 1 М Трис-HCl, рН 8,0 []) отдельно в дистиллированной воде.
- Выполнить 25 мкм запас праймеров ПЦР XY (XY вперед 5'-TGA AGC TTT TGG СТТ TGA G-3 'и XY обратного 5'-CCG ААТ КТГ CCA TCT TTG G-3') вместе в нуклеазы без воды.
- Подготовка 50X TAE буфер (242 г Trizma Base, 57,1 мл ледяной уксусной кислоты, 100 мл 0,5 М ЭДТА, рН 8,5, и добавить воды до 1 л Fiнал объем). Подготовка 1X TAE буфер Запуск (20 мл 50X ТАЕ разбавляют водой до 1 л объема).
- Для создания 2,5% раствора агарозы (0,625 г агарозы, 0,5 мл 50X буфера ТАЕ, 24,5 мл воды), раствор агарозы тепла в микроволновой печи до кипения, затем дать остыть до 55-65 о ° С (в состоянии коснуться). После того, как здорово, добавьте 2 мкл 1% раствора этидийбромидом, и залить гель.
ВНИМАНИЕ! Этидия бромид является мутагенным и тератогенным; пожалуйста, используйте нитриловые перчатки и надлежащую протокол безопасности при обращении. Кроме того, другие потенциально токсичные гель менее решении агенты или красители могут быть использованы. - Готовят раствор (Блокирование PBS с 0,1% Triton X-100, 10% фетальной бычьей сыворотки [FBS], и 3% бычьего сывороточного альбумина [BSA]) для иммунофлуоресценции.
- Готовят промывочный раствор (PBS с 0,1% Triton X-100, 1% FBS, и 3% BSA) для иммунофлуоресценции.
- Подготовьте PBTx (PBS с 0,1% Triton X-100) для иммунофлуоресценции.
- Подготовка инкубаторе для Culture. Заполните большой (диаметром 100 мм) чашки Петри с 35 мл воды в автоклаве. Поместите рядом, где будет выполняться рассечение и культуры.
2. Выделение плода семенников от Mus Musculus
- Проверьте каждое утро женский мышь для вагинальных пробок. Полдень в день, при которой влагалищный плагин обнаруживается считается E0.5. Эвтаназии беременной женщины мыши в E11.5, в соответствии с утвержденными протоколами животных.
- Спрей вниз мыши живота с 70% этанола.
- Откройте кожу живота и брюшину с V-образный разрез, используя тонких ножниц и отступить лоскут ткани, чтобы выставить внутренние органы.
- Найдите яичники на обоих концах рога матки. Используя ножницы, вырезать на яичнике и соединительной ткани, чтобы отделить матку, содержащий эмбрионов из тела матери.
- Откройте стенки матки, осторожно резки сторону, противоположную плаценты, подвергая желток мешочки. Будьте осторожны, чтобы не пуncture желточный мешок, чтобы не повредить или потерять эмбрионов.
- Вырезать вблизи плаценты, чтобы удалить эмбрион, содержащий желток мешочки и поместить их в чашку, содержащую PBS с кальцием и магнием. Наличие ионов кальция и магния поможет молекулы адгезии клеток поддержка для поддержания архитектуру ткани и предотвратить ткань от прилипания к рассечение инструментов.
- Пинцетом, удалить желточный мешок и амнион из эмбриона, осторожно прокалывания желточный мешок, чтобы создать отверстие, в котором эмбрион может выскользнуть. После того, как эмбрион находится вне желточного мешка, перерезать пуповину.
- С этого момента, используйте микроскоп, расположенный в стерильной капот культуры ткани. Снимите головку эмбриона и выбросить, зажимая пинцетом по обе стороны шеи.
- Удалить хвост и поместите в новую пробирку микроцентрифужных для анализа ПЦР XY, чтобы определить пол эмбриона.
Примечание: В то время как оптимальным является культура половых желез как можно скорее после сбора урожая, это также позможные удалить хвост ДНК и выполнять XX / XY генотипирование до культуры, так что пол каждого эмбриона известно и только желаемого пола должна быть культивированы. В то время как генотипирование делается, эмбрионы могут быть поддерживаются отделенными (так, чтобы они не могут быть отслежены) при 4 ° С или на льду до момента культуры. Одно предостережение в том, что в этот период за пределами внутриутробному или условия культивирования могут потенциально повлиять на жизнеспособность культуры или последующего развития в культуре. - Закрепите эмбриона в положении лежа на спине с нижней части культуры блюдо, закрепив подмышки эмбриона с одной парой щипцов (обычно щипцов, занимаемые в слабой рукой). Поддерживать эти щипцы на месте провести эмбрион еще в течение всего процесса вскрытия.
- С другой парой щипцов, удалить кожу живота покрытия и аккуратно удалить печень, кишечник и другие органы, чтобы выставить обратно стенку тела.
- В гонады будут расположены на задней стенке корпуса по обе стороны от дорсальной аорты,большой кровеносный сосуд, вдоль средней линии тела, совок под мочеполовой хребта с закрытыми щипцами и удалить хребет мочеполовой открыв щипцы и подняв. Как гонады будет свободно крепится к стене, будьте осторожны, чтобы не тянуть слишком быстро, не снимая эти соединения или половые железы может растянуться, вызывая повреждение органов.
- Перемещение мочеполовой хребет в cDMEM в блюдо, чтобы акклиматизироваться ткани СМИ.
- Отделите комплекс гонад-мезонефрос от остальной части мочеполовой хребта с использованием 27 г иглы. Используйте одну иглу, чтобы сократить нажав вниз, и использовать другой, чтобы направлять ткань правильно для оптимального разделения. Избегайте использования распиловки движение против блюдо снизу, а острые иглы создаст осколки пластика, который может прилипнуть к ткани. Убедитесь, что держать мезонефрос полностью, прикрепленные к гонад.
3. Культивирование гонад с ингибитором малые молекулы
- Установите два 20 Мл пипетки до 15 мкл каждый. Вырезать около 1-2 мм от одной из подсказок барьер пипетки с использованием чистой, стерилизованное лезвие для передачи половых желез и добавление управления cDMEM, в то время как другой пипетки будет использоваться исключительно для наркотиков лечение cDMEM.
- Выстроить гонады с их длинной оси, параллельной пипетки таким образом, они могут быть легко пипеткой с помощью иглы отсечки. Будьте осторожны, половых желез, торчащие внутрь наконечника пипетки.
- Этикетка одну сторону в качестве контроля капли, а другой в качестве лекарственного средства, содержащего капли. Только два капельки могут поместиться на 35 мм блюдо крышкой в. Убедитесь, что метки на крышках соответствовать надписи на хвост тканей, содержащих микропробирок.
- Пипеток 15 мкл cDMEM, содержащие один гонаду в капле в крышке небольшой (35 мм) культуры блюдо (используйте только крышки, днища, как слишком высок, чтобы вписываться в увлажненной чашку Петри камеры). Поместите два отдельных гонад, содержащих капли по обе стороны от тарелки, хорошо разделены FRом друг друга. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что половые железы были переданы капель.
- Чтобы капли, назначенного в качестве контроля, добавить дополнительный 15 мкл, содержащие cDMEM ДМСО (сделанный на стадии 1.5), чтобы капли 30 мкл общего объема в. Используйте только "контроль" пипетки, что не будет с нами препарат.
- Для другой капли (образец наркотиков лечение), добавить 15 мкл ТКИ-II, содержащей cDMEM сделать капельку с 30 мкл общего объема. Используйте только пипетки предназначенный для образцов наркотиков лечение.
- Использование пипетки, раскинувшийся капли в расширяющейся круговой схеме до тех пор, пока около 15-18 мм в диаметре и гонад находится примерно в середине. Ориентируйте гонады так, что она лежит на боку и гонад и мезонефрос легко различимы. Расположите легкие, так что две доли лежать.
- Хотя капли диаметром могут незначительно отличаться, убедитесь, что половые железы не floatinг и удерживаются на месте силами поверхностного натяжения. Убедитесь, что капли не должны касаться друг друга или часть крышки. Без поверхностного натяжения, органы будет расти на крышке во время культивирования и придавить, искажая, таким образом морфологию органов.
- Осторожно установить крышку чашки для культивирования, содержащей капельки в вертикальном положении на поверхности воды в больших (100 мм) Увлажнитель блюдо. Гарантировать, что нет никаких пузырей, захваченные под нижней части крышки, и что он лежит плоско на поверхности воды. Не инвертировать крышку и быть осторожными, чтобы не допускайте попадания воды коснуться верхней крышке, где капли находятся.
- Чтобы создать небольшой, влажной камере, сразу накрыть крышкой большего увлажнения блюдо вложить гонады культуры. Закон как можно быстрее, чтобы свести к минимуму любые испарение сред. Убедитесь, что меньше, блюдо имеет номер между ним и крышкой большего блюдо свободно передвигаться; в противном случае, конденсат может сделать печать и бзамок обмен воздуха в ткани.
- После того, как два маленьких крышки помещают в камеру, немедленно поместите камеру в инкубаторе. Инкубируйте капель культур в течение 48 ч в увлажненной CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° С.
4. полимеразной цепной реакции для определения пола эмбрионов
- Добавить эмбриональных хвосты нижней части 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
- Добавить в каждую пробирку 200 мкл 50 мМ NaOH.
- Поместите при 95 ° С в течение 15 мин или до ткань полностью не растворится.
- Добавить 50 мкл 1М Трис-HCl и вихрь слегка и ненадолго.
- В 1,5 мл микроцентрифужных трубки, чтобы свежий Master Mix ПЦР путем умножения каждого объема на общее число проб: 0,5 мкл 25 мкМ праймера раствора, 2,5 мкл 10х буфера Taq, 0,5 мкл 10 мМ дНТФ (нуклеотиды), 19,3 мкл nuclease- свободной воды, 0,2 мкл ДНК-полимеразы Taq. Хорошо перемешать.
- Добавить 23мкл ПЦР мастер смеси для ПЦР пробирки, содержащие 3 мкл лизата переваренных хвостами.
- Flick трубки смешать их, а затем выполнить кратковременный отжим довести образцы в нижней части трубы.
- Запустите программу XY (Short) ПЦР (Таблица 1).
- Загрузка образцов (с 5-кратным красителя) и лестницы в 2,5% агарозном геле в ТАЕ буфере 1X.
- Запустите электрофореза в агарозном геле, пока XX и XY полосы не могут быть решены.
- Изображение гель с УФ-света и захвата изображения.
- Анализ Х-хромосому-специфический против Y хромосом конкретных групп (Х-хромосома = 331 пар оснований [BP] и XY = 302 б.п.) 13; (Мужчины) образцы XY будет иметь две полосы 331 и 302 б.п., в то время как XX (женщины) образцы появятся в виде одной полосы 331 б.п..
5. Всего Иммунофлуоресценции Гора Орган
1 день:
- Удалить половые железы от культуры с помощью пипетки 1000 мкл с наконечником отсечки. При желании они могут бытьпомещают в чашку из ФБР, чтобы смыть сред и реактивов. Поместите в PBS в 0,5 мл микроцентрифужных трубки. Чем меньше размер трубка сохранить реагенты и сделать его легче отслеживать образцов в трубке.
- Будьте уверены, чтобы сохранить контроль и обработанные образцы, а также образцы XX и XY, в отдельные пробирки и удалить их из культуры с отдельными наборами пипеток, чтобы избежать возможного загрязнения наркотиков.
- Вымойте половые железы в два раза с PBS. С этой точки зрения, этот протокол можно использовать 1X PBS хватает кальция и магния. Для мытья их, позволяют гонады опускаться до нижней части трубки (по тяжести), а затем удалить жидкость выше. Будьте осторожны, не теряют гонады с помощью пипетки к ним слишком близко.
- Удалить столько PBS, насколько это возможно из трубки. Добавить 250 мкл 4% параформальдегида в PBS, содержащем 0,1% Triton X-100, и пусть инкубировать O / N при 4 ° С на качалке. Кроме того, эта фиксация может быть сделано в течение 2 ч при 4 ° С на качалке. ВНИМАНИЕ! Paraformaldehyde является токсичным веществом, поэтому следуйте протокол безопасности при обращении.
День 2:
- Промыть половые железы в два раза в 250 мкл PBTx при комнатной температуре.
- Вымойте половых желез 3 раза 250 мкл PBTx в течение 10 мин при комнатной температуре каждого на качалку.
- Блок гонады по крайней мере, 1 час в 250 мкл блокирующего раствора при КТ на качалке.
- Пятно гонады O / N при 4 ° С на качалке в 250 мкл первичного антитела, разведенного в блокирующем растворе.
День 3:
- Промыть половые железы в два раза в 250 мкл промывочного раствора.
- Вымойте половых желез 3 раза 250 мкл промывочного раствора в течение 10 мин каждый при комнатной температуре на качалке.
- Блок гонад 1 час в 250 мкл блокирующий раствор при КТ на качалке.
- Накройте микроцентрифужную трубку с алюминиевой фольгой для защиты флуоресцентные вторичные антитела от света.
- Выдержите половых желез 2-4 ч при комнатной температуре на АРOcker в 250 мкл вторичного антитела, разбавленного в блокирующем растворе, содержащем Hoechst 33342. В качестве альтернативы, выполнение вторичного антитела и Hoechst 33342 инкубации o / n при 4 ° С на качалке.
- Промыть половые железы в два раза в 250 мкл PBTx.
- Вымойте половых желез 3 раза в 250 мкл PBTx в течение 10 мин при комнатной температуре каждого на качалку.
- Использование пипетки отсечки, передать половые железы на слайде с минимальным жидкости. Удалите излишки жидкости с пипетки, но убедитесь, что ткань не высыхают.
- Расположите половые железы в нужный лад щипцами и быстро добавить каплю монтажных СМИ монтировать гонады на слайде. Убедитесь, что монтажные СМИ пальто все образцы полностью; важно, чтобы не позволить образцы высохнуть.
- Используйте покровные (количество 1,5 стиль) соответствующего размера, чтобы мягко охватывать образцы. Пусть монтажный СМИ распространили связаться всю поверхность покровного. При необходимости очень легко нажать на углах, так что покровноенет крупные пузырьки воздуха.
- Печать слайдов с четким лака для ногтей по краям, чтобы уменьшить испарение монтажной СМИ. Магазин слайды в темноте при 4 ° С.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Экс естественных капель культура позволяет манипулировать целые органы, такие, как гонады, изучать клеточные взаимодействия и динамики. Рисунок 1 демонстрирует в поэтапно, как приготовить E11.5 половые железы капель культуру. Первые шаги в протоколе культуры включают в себя начальное удаление эмбриона, содержащего матки от матери мыши (рис 1А и 1В). После удаления матки от матери, матки стены вырезать и эмбрионы освобожден от желтка в PBS для дальнейшего вскрытия (рис 1...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Это исследование показывает, экс естественных весь орган метод капель, который имеет много потенциальных приложений для изучения развития плода. Этот метод может быть использован для нескольких органов, и позволяет исследователю решать биологические вопросы, которые трудно изучить с помощью естественных подходов в из-за недоступности эмбрионов и потенциальной эмбриональной летальности. Этот метод культура имеет дополнительные преимущества над другими в пробирке подходов, таких как кле...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Авторы были поддержаны: грантом на исследования CancerFree KIDS, премией Бэзила О'Коннора Starter Scholar Award (#5-FY14-32), грантом попечителя Медицинского центра детской больницы Цинциннати (CCHMC); премией CCHMC за исследовательские инновации и финансирование пилотов; и фондами развития CCHMC. Авторы также выражают признательность лаборатории Capel за первоначальную оптимизацию этой методики.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Superfrost Plus Предметные стекла для микроскопа | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Защитные очки: квадраты (22 мм x 22 мм, No 1,5) | Fisherbrand | 12-541B | |
| Sally Hansen Xtreme Wear лак для ногтей, невидимый | Sally Hansen | ||
| 8-Strip 0,2 мл ПЦР-пробирки и Съемные плоские колпачки | GeneMate | T3218-1 | |
| Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L | Gilson | FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M | |
| Dumont #5 Щипцы | FST | 91150-20 | |
| Тонкие ножницы | FST | 91460-11 | |
| Posi-Click 1,7 мл микроцентрифужные пробирки | Denville | C2170 | |
| Posi-Click Микроцентрифужные пробирки 0,6 мл | Denville | C2176 | |
| 10 μ l SHARP Прецизионные барьерные наконечники | Denville | P1096FR | |
| 20 μ l SHARP Прецизионные барьерные наконечники | Denville | P1121 | |
| 200 μ l SHARP Прецизионные барьерные наконечники | Denville | P1122 | |
| 1,000 μ l SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1126 | |
| 1 мл шприц с иглами 27 калибра | BD PrecisionGlide | 309623 | |
| шприц 10 мл | BD | 305559 | |
| 0,2 шт; M PES Шприцевой фильтр | VWR | 28145-501 | |
| Grade 3 Качественная фильтровальная бумага Стандартный сорт, круг, 185 мм | Ватман | 1003-185 | |
| Primaria 35 мм Easy Grip Style Чашка для клеточных культур | Falcon/Corning | 353801 | |
| Чашки Петри, стерильные (100 мм x 15 мм) | VWR | 25384-088 | |
| Нью-Брансуик Galaxy 14 S CO2 Инкубатор | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
| Шкаф биобезопасности | Nuare | NU-425-400 | |
| Мини-центрифуга | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| BioExpress GyroMixer Variable XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
| Mastercycler Pro Thermal Cycler с панелью управления | Eppendorf | 950040015 | |
| SMZ445 стереомикроскоп | Nikon | SMZ445 | |
| MultiImage Light Cabinet с программным обеспечением AlphaEase | Alpha Innotech Corporation | Снято с производства | |
| Абсолютный 200 пруф Этанол | Fisher | BP2818-500 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Фосфат натрия (Dibasic MW 142) Na2HPO4 | Fisher | S374-1 | |
| Фосфат калия (одноосновной MW 136) KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
| Хлорид натрия (NaCl) | Хлорид калия Fisher | S671-3 | |
| KCl) | Sigma-Aldrich | P3911-1KG | |
| Хлорид магния (MgCl2) | Sigma | M2393-100g | |
| Хлорид кальция (CaCl2) | Sigma | C5670-100g | |
| Ambion Nuclease-Free | Water Life Technologies | АМ9938 | |
| XY Праймер для ПЦР | IDT | N/A | |
| Ледяная уксусная кислота | Fisher | A38-500 | |
| Этилендиамин тетрауксусная кислота (ЭДТА) | Fisher | BP2482-1 | |
| 1% раствор бромида этидия | Fisher | BP1302-10 | Токсичная |
| агароза | GeneMate | E-3120-500 | |
| Гидроксид натрия (NaOH) | Sigma-Aldrich | 367176-2,5KG | |
| Тризма База | Sigma | T1503-1KG | |
| dNTP Набор, 100 мМ растворы | Thermo Scientific | R0182 | |
| DNA Choice Taq-полимераза с 10x Буфер | Denville | CB-4050-3 | |
| Параформальдегид | Fisher | O4042-500 | Токсичный |
| FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Хлористый водород ( HCl) | Fisher | A144212 | |
| Бычья сыворотка альбумин (БСА), порошок, фракция V, изоляция от теплового шока | Bioexpress | 0332-100g | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS), тройная 100 нм фильтрованная | Fisher | 03-600-511 | Термическая инактивация перед применением |
| пенициллин-стрептомицина (10,000 Ед/мл) | Life Technologies | 15140-122 | Применение при 1:100 |
| Диметилсульфоксид (ДМСО), Hybri-max, стерильно-отфильтрованный | Sigma | D2650 | |
| VEGFR Ингибитор тирозинкиназы II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
| Rabbit Anti-Sox9 Антитело | Millipore | AB5535 | Использование при разведении: 1:4,000 |
| Антитело к мышам крысы PECAM1 (CD31) Антитело | BD Pharmingen | 553370 | Использование при разведении: 1:250 |
| Расщепленная у кролика каспаза-3 (ASP175) Антитело | Cell Signaling | 9661S | Использование при разведении: 1:250 |
| Антитело к E-кадгерину крысы / CDH1 (ECCD-2) | Life Technologies | 13-1900 | Использование при разведении: 1:500 |
| Hoechst 3342, тригидрохлорид, тригидрат | Invitrogen (молекулярные зонды) | H1399 | Использование при дозе 2 мкг/мл |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-165-153 | Использование при разведении: 1:500 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-605-153 | Использование при разведение: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Вторичное антитело, конъюгат Alexa Fluor 555 | Life Technologies | A31572 | Использование при разведении: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) вторичное антитело, конъюгат Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21206 | Использование при разведении: 1:500 |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) Вторичное антитело, конъюгат Alexa Fluor 488 Life | Technologies | A21208 | Использование при разведении: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Вторичное антитело, конъюгат Alexa Fluor 647 | Life Technologies | A31573 | Использование при разведении: 1:500 |
Ссылки
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803(2014).
- Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. 17, 2949-2955 (2008).
- DeFalco, T., Bhattacharya, I., Williams, A. V., Sams, D. M., Capel, B. Yolk-sac-derived macrophages regulate fetal testis vascularization and morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, E2384-E2393 (2014).
- Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7212-7217 (2008).
- Walton, K. D., Kolterud, A. Mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development. J. Vis. Exp. (91), e51817(2014).
- Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. An ex vivo culture system to study thyroid development. J. Vis. Exp. (88), e51641(2014).
- Costantini, F., Watanabe, T., Lu, B., Chi, X., Srinivas, S. Dissection of embryonic mouse kidney, culture in vitro, and imaging of the developing organ. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, (2011).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. (66), e3979(2012).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720(2011).
- Combes, A. N., et al. et al.Endothelial cell migration directs testis cord formation. Dev. Biol. 326, 112-120 (2009).
- Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biol. Reprod. 75, 56-67 (2006).
- Cool, J., DeFalco, T. J., Capel, B. Vascular-mesenchymal cross-talk through Vegf and Pdgf drives organ patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 167-172 (2011).
- Clapcote, S. J., Roder, J. C. Simplex PCR assay for sex determination in mice. BioTechniques. 38, 702, 704-706 (2005).
- Nel-Themaat, L., et al. et al.Morphometric Analysis of Testis Cord Formation in. Dev. Dyn. 238, 1100-1110 (2009).
- Kent, J., Wheatley, S. C., Andrews, J. E., Sinclair, A. H., Koopman, P. A male-specific role for SOX9 in vertebrate sex determination. Development. 122, 2813-2822 (1996).
- Morais da Silva, S., et al. et al.Sox9 expression during gonadal development implies a conserved role for the gene in testis differentiation in mammals and birds. 14, 62-68 (1996).
- Rockich, B. E., et al. Sox9 plays multiple roles in the lung epithelium during branching morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E4456-E4464 (2013).
- Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Dev. Cell. 18, 175-189 (2010).
- Brennan, J., Capel, B. One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development. Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).
- Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. Male-specific cell migration into the developing gonad. Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).
- Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis using an organ culture technique. Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471, 504-507 (2011).
- Gohbara, A., et al. In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system. Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
