Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Повторное забор крови для анализов крови у взрослых данио рерио

37.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53272

⸱

30 августа 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Translational Medical Science, Graduate School of Medicine, Mie University, 2Department of Molecular and Cellular Pharmacology, Pharmacogenomics, and Pharmacoinformatics, Graduate School of Medicine, Mie University

В этой статье

Краткое содержание

Повторный забор крови необходим и важен в исследованиях на животных. Мы разработали новый, нелетальный и надежный метод повторного сбора крови у взрослых рыбок данио-рерио и применили этот метод для изучения биохимии крови, включая метаболизм глюкозы.

Аннотация

Повторное сбора крови является одним из наиболее распространенных методов, выполненных на лабораторных животных. Тем не менее, не был создан нелетального протокол для сбора крови из рыбок данио. Предыдущие методы сбора крови из рыбок данио смертельны, как боковой разрез, обезглавливание и хвост абляции. Таким образом, мы разработали новый "повторное" метод сбора крови, и здесь присутствует подробный протокол с изложением этой процедуры. Этот метод минимально инвазивной и приводит к очень низкой скорости смертности (2,3%) по данио, что позволяет повторный отбор крови от того же индивида. Максимальный объем забора крови зависит от веса тела рыбы. Объем выборки для повторного крови с интервалом должно быть ≤0.4% от массы тела каждую неделю или ≤1% каждые 2 недели, которые были оценены по измерений гемоглобина в крови. Кроме того, гемоглобин, уровень глюкозы в крови натощак, плазма триацилглицерин (ТГ) и общая сУровни holesterol в мужских и женских взрослых рыбок данио были измерены. Мы также применили этот метод для изучения нарушение регуляции метаболизма глюкозы в диете-индуцированного ожирения. Этот метод сбора крови позволит много приложений, в том числе глюкозы и липидного обмена и гематологических исследований, что позволит увеличить использование рыбок данио, как модель человека болезнь организма.

Введение

Данио рерио набирают большую популярность в качестве ценного модели заболеваний человека, потому что их органы и генетики похожи на человеческие 1,2. В области биологии развития, многие исследования показали, что у рыбок данио и человека показать заметное сходство в кроветворении 3 гемостаза 4,5, и 6 миелопоэза. Взрослый данио также используются для изучения иммунологических 7, 8 и нейродегенеративных, связанных с ожирением заболеваний, потому что 9 эта модель организма акций общие пути с теми, нарушается в человеческих заболеваний. Для ожирения и связанных с ожирением заболеваний (сахарный диабет, жировой дистрофии печени и безалкогольные стеатогепатит и атеросклероз), данио глюкозы в крови и липиды уровни были тщательно расследованы в нескольких трансгенных и диеты индуцированных моделей ожирения 10-13.

Повторное взятие проб крови от отдельных животных снизит использование животных и разлrease межличностные различия. Тем не менее, повторное взятие проб технически сложно в небольших животных, таких как данио из-за их относительно небольшого объема крови и отсутствием легкодоступных сосудов. Некоторые методы для одноразового сбора крови от рыбок данио были разработаны, хотя эти методы имеют свои недостатки, в том числе летальности, связанную повреждение тканей и ограниченный объем крови. Например, 1-5 мкл крови могут быть собраны с боковой разрез приблизительно 0,3 см в длину в области дорсальной аорты 5. Обезглавливание с ножницами по прорезая плечевого пояса может собрать 5-10 мкл крови 10. Еще один удобный метод отбора проб крови хвост абляция 14. Пункции сердца один потенциальный альтернативный способ повторного забора крови из той же рыбы, но очень небольшое количество полученного (примерно 50 NL) с этой процедурой ограничивает количество анализов, которые могут быть perforмед 11. Соответственно, новый протокол необходим для того, чтобы отбор проб повторный нелетального крови, который будет критическим заранее для этого необходимо организму, чтобы быть стандартной моделью организм для человека заболеваний. Эта техника позволит для тестирования фармакологический ответ, открытие молекулярных биомаркеров для диагностики, определения прогноза и мониторинга различных заболеваний, таких как болезни обмена веществ, дегенеративные заболевания и несколько типов злокачественных новообразований.

Поэтому мы разработали минимально инвазивной способ получения крови из рыбок данио серийно 15. Здесь мы показываем, процедуру визуально и предоставить подробный протокол для этой техники. Используя этот метод, были оценены нормальное значение на основе различных параметров, в том числе гемоглобина, глюкозы крови натощак и липидов в крови здоровых взрослых рыбок данио. Кроме того, мы также оценивали ли этот метод подходит для исследований, которые требуют серийных образцов от мониторинг временные изменения уровня глюкозы в крови во время перекорм экспериментов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры на животных были одобрены этическим комитетом университета Миэ мимо, и были выполнены в соответствии с японской регулирования защиты животных "Закон о пособиях и управления Животные» (Министерство охраны окружающей среды Японии) и соответствовали международным руководящим принципам.

1. Подготовка иглы

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты проводились под анестезией, и все усилия были сделаны, чтобы свести к минимуму страдания. Для эвтаназии, рыба были погружены в ледяной бане в (5 частей лед / 1 часть воды на ≤4 ° С) в течение ≥20 мин.

  1. Подготовьте стекло микрокапиллярных иглы, потянув стеклянный капилляр 1,0 мм наружный диаметр-с иглой съемник (рис 1А).
  2. Отрежьте кончики игл косо использованием тонких ножниц (рис 1б). Идеальный диаметр наконечника должен быть примерно 100 - 200 мкм (рис 1в). Если кончик diameteг является слишком узким, кровь не войдет в иглу.
  3. Растворить в физиологическом растворе гепарина с концентрацией 5 мг / мл.
  4. Поставьте перфорированного отверстия иглы в конце носика сборки аспиратор трубки и удерживайте мундштук в рот, или подключите иглу в дозатор лампы. Погрузитесь наконечник в раствора гепарина иглы, и heparinize иглу с помощью отсоса и дует через раствор (рис 1D и 1E).
    Примечание: Узел аспиратор трубки был использован для криоконсервации спермы данио 16. Длинные резиновая трубка может остановить любую кровь летит в рот. Установка фильтра в полпути трубы можно избежать опасности.
  5. Храните гепаринизированные иглы в 10-см чашки Петри и воздушно-сухой, по крайней мере 1 час. Большое количество игл может быть подготовлен заранее.

2. Анестезия

  1. Подготовка раствора анестетика в небольшом пластиковом корпусе путем смешивания 200 мл воды рыбы со 100 мкл 2-феноксиэтанол (2-ФИЗ РА). Конечная концентрация анестетиков 500 частей на миллион.
    ВНИМАНИЕ! 2-РЕ имеет быстрый эффект.
  2. Удалить нужное количество рыбы (штамм АВ) из системы циркуляции.
  3. Используйте сеть, чтобы передать рыбу в анестезиологии для 1 - 2 мин (рис 1F). Соблюдайте рыбу постепенно плавать, распространение грудные плавники горизонтально, удушье, и есть быстрые движения крышечкой в ​​течение 1 мин.
  4. Как время идет, наблюдать рыба лежала на дне корпуса и, наконец, перестать плавание. Хирургическая плоскость анестезии достигнет, когда рыба перестает задыхаться и движения крышечкой медленно. В этот момент, рыба будет готова для сбора крови.
  5. Использование скиммер поднять наркозом рыбу из 2-PE и осторожно положите его на бумажное полотенце, смоченной анестетиков (рис 1G). Обложка голову рыбы с мягкой ткани, смоченной бумаги также с решением 2-PE, чтобы предотвратить сухость глаз и использовать другой сухой бумаги мягких тканей мягковысушить поверхность тела.

Сборник 3. Кровь

  1. Поставьте гепаринизированную иголку в конце носика сборки аспиратор трубки (или дозатора лампы) и удерживайте конец мундштука сборки аспиратор трубки в рот.
  2. Возьмитесь за конец головка и игла вместе, и тщательно удалить мешающие весы с кончика иглы. Вставьте иглу в 30 - 45 ° угол в месте сбора крови. Избегайте прокола желудочно-кишечного тракта (рис 1H). В случае использования лампы дозатор, нажмите лампу с большим и средним пальцем, и блокировать отверстие на кончике лампы с первым пальцем, затем вставить иглу, как описано выше.
    Примечание: сайт для сбора крови вдоль оси тела и кзади от ануса в области дорсальной аорты. Дорсальной аорты (ДА) и задний кардинальное вены (PCV) только вентрально позвоночника (рисунок 2).
  3. Начните сосатьмундштук конец сборки трубы аспирации, когда игла чувствовал прикосновения позвоночник. Если кровь не поднимается, переместите кончик иглы тонко вручную, чтобы поощрять приток крови. Обратите внимание, что когда-то в крови повышается в иглу, немедленно перестать трястись и сосать мягко (рис 1i). В случае использования лампы дозатор, выпустить давление колбы для аспирации крови.
  4. Соблюдайте кровь будет медленно подниматься в иглу в пульсирующей манере без всасывания, которая, вероятно, из-за артериального давления. Таким образом, нет необходимости, чтобы сосать, если игла проникает в артерии.
  5. Остановка всасывания после соответствующего объема крови собирают. Снимите иглу из рыбы и нажмите места прокола с использованием бумаги мягких тканей, чтобы остановить кровотечение. Соблюдайте кровотечение остановить примерно через 10 - 20 сек давления пальца (рис 1J).
  6. После остановки кровотечения, немедленно передать рыбу обратно в НКУтеплой воде (~ 28 ° С) бака. Помощь рыбу, чтобы восстановить, осторожно вращая воду к жабр, пока он не начинает плавать.
    Примечание: Держите до 5 postsampling рыбы в 2 л бак и подключить бак циркуляционной системы для оксигенации рыбу. Добавление антибиотиков в воде рыба не является необходимым. Поддерживать рыбы с нормальным жильем и кормления.
  7. Выгнать кровь из иглы на экологически чистом районе кусок парафильма (рис 1K).
  8. Измерьте уровень глюкозы в крови с помощью каких-либо коммерческих портативных глюкометра (рис 1L).
    Примечание: глюкометр использует дегидрогеназы глюкозы-флавинадениндинуклеотид электрод и требует объем образца 0,6 мкл.
    1. Вставьте тест-полоску полностью в метр и непосредственно коснуться капли крови. Соблюдайте ничью крови в тест-полоски автоматически и получить глюкозы в крови результат 5 сек на площади дисплея. Запишите результат и выбросьте тест-полоску. ИспользоватьНовый тест полоски для каждого измерения.
  9. (необязательный этап) проводить точные количества крови с помощью пипетки и передачи кровь микроцентрифужных трубки для дальнейших анализов (гемоглобина, триглицеридов (ТГ), общего холестерина и т.д.). При необходимости, разбавить цельной крови от одной рыбы с физиологическим раствором. Центрифуга образцы крови в течение 3 мин при 680 х г при комнатной температуре и собирают плазму. Передача плазму в новую пробирку. В этот момент, она готова для использования в биохимических анализов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот метод сбора крови вызывает минимальное повреждение рыбок данио (а <1 мм пункции; рис 1J) и дает очень низкий уровень смертности 2.3%. Мы исследовали максимальный объем крови, что может быть собрана из одного рыбы и оценены отношения к его массе тела (рисунок 3). Мы обнаружили, что максимальный объем крови собирали была линейно коррелирует с массой тела (R = 0,813). Наибольший объем крови собирали из отдельных рыб (масса тела = 1.071 г) 25 мкл, а наименьший объем в 1,3 мкл из рыб...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы представляем здесь подробный протокол для последовательного получения крови из взрослых данио. Этот метод прост в выполнении и мы используем его в лаборатории на ежедневной основе. Этот метод сбора крови основан на введении стеклянного капилляра иглу в спинной аорты данио в. Во время этой процедуры, очень важно быть осторожным, чтобы не удалять позвоночник, потому что это является критерием для поиска спинной аорты. Снижение травму позвоночника улучшит выживаемость. Хотя этот метод является простым и легким в освоени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана JSPS KAKENHI Grant Number 25860294 и 25590073. Мы хотели бы поблагодарить г-жу Юи Намиэ за нарисованную от руки иллюстрацию, а также г-на Коси Катаоку и г-жу Саюри Итикаву за помощь в содержании рыбок данио.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Стеклянные капилляры с нитью накалаНаришигэГД-1наружного диаметра 1,0 мм.
Съемник иглNarishigePC-10Для производства игл
HeparinWako Pure Chemical Industries081-00136Для гепаринизации
Аспиратор в сбореDrummond2-040-000Для забора крови
Дозатор колбDrummond1-000-9000Для забора крови
2-феноксиэтанолWako Pure Chemical Industries163-12075Для обезболивания рыб
DRI-CHEM3500VFujifilm-Для измерения гемоглобина
DRI-CHEM СлайдыFujifilmHb-WIIДля измерения гемоглобина
Glutest Neo SuperSanwa Kagaku Kenkyusho-Для измерения глюкозы
Wako L-type TG kitWako Pure Chemical Industries464-44201Для TG
измерение Wako L-тип CHO kitWako Pure Chemical Industries460-44301Для измерения общего холестерина
Parafilm MAlcan PackagingPM996Для выведения крови на

Ссылки

  1. Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  2. Penberthy, W. T., Shafizadeh, E., Lin, S. The zebrafish as a model for human disease. Front Biosci. 7, d1439-d1453 (2002).
  3. Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 101, 75-110 (2011).
  4. Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 25 (3-4), 239-249 (1999).
  5. Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br J Haematol. 107 (4), 731-738 (1999).
  6. Lieschke, G. J., Oates, A. C., Crowhurst, M. O., Ward, A. C., Layton, J. E. Morphologic and functional characterization of granulocytes and macrophages in embryonic and adult. Blood. 98 (10), 3087-3096 (2001).
  7. Iwanami, N. Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency. Exp Hematol. 42 (8), 697-706 (2014).
  8. Babin, P. J., Goizet, C., Raldua, D. Zebrafish models of human motor neuron diseases: advantages and limitations. Prog Neurobiol. 118, 36-58 (2014).
  9. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Dis Mod Mech. 6 (5), 1080-1088 (2013).
  10. Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
  11. Moss, J. B., et al. Regeneration of the pancreas in adult zebrafish. Diabetes. 58 (8), 1844-1851 (2009).
  12. Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10 (21), (2010).
  13. Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7 (5), e36474(2012).
  14. Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquat Toxicol. 105 (1-2), 107-118 (2011).
  15. Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel, reliable method for repeated blood collection from aquarium fish. Zebrafish. 10 (3), 425-432 (2013).
  16. Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods Mol Biol. 546, 45-65 (2009).
  17. Thorson, T. B. The partitioning of body water in Osteichthyes: phylogenetic and ecological implications in aquatic vertebrates. Biol Bull-US. 120, 238-254 (1961).
  18. Conte, F. P., Wagner, H. H., Harris, T. O. Measurement of blood volume in the fish (Salmo gairdneri gairdneri). Am J Physiol. 205, 533-540 (1963).
  19. Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
  20. Nahas, K., Provost, J. -P., Baneux, P. H., Rabemampianina, Y. Effects of acute blood removal via the sublingual vein on haematological and clinical parameters in Sprague-Dawley rats. Lab Anim. 34 (4), 362-371 (2000).
  21. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. DevDyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  22. Andersson, O., et al. Adenosine signaling promotes regeneration of pancreatic beta cells in vivo. Cell Metab. 15 (6), 885-894 (2012).
  23. Hiramitsu, M., et al. Eriocitrin ameliorates diet-induced hepatic steatosis with activation of mitochondrial biogenesis. Sci Rep-UK. 4, 3708(2014).
  24. Zang, L., Shimada, Y., Kawajiri, J., Tanaka, T., Nishimura, N. Effects of Yuzu (Citrus junos Siebold ex Tanaka) peel on the diet-induced obesity in a zebrafish model. J Funct Foods. 10, 499-510 (2014).
  25. Schlegel, A. Studying non-alcoholic fatty liver disease with zebrafish: a confluence of optics, genetics, and physiology. Cell Mol Life Sci. 69 (23), 3953-3961 (2012).
  26. Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).
  27. Thomas, C. D., et al. Nutrient balance and energy expenditure during ad libitum feeding of high-fat and high-carbohydrate diets in humans. Am J Clin Nutr. 55 (5), 934-942 (1992).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Сбор крови у zebrafishпротокол забора кровистеклянные капиллярные иглыгепаринизированные иглымалоинвазивная методикаповторный забор кровиизмерение уровня гемоглобинаанализ глюкозылипидный обменожирениевызванное диетой
Повторное забор крови для анализов крови у взрослых данио рерио
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.