Методическая статья

Генерация генетически модифицированных культур Органотипической кожи Использование нежизнеспособных Human дермы

DOI:

10.3791/53280

⸱

14 декабря 2015 г.

 , 
1Department of Dermatology, UCSD Stem Cell Program, University of California, San Diego, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, UCSD Stem Cell Program, University of California, San Diego

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель этой статьи - предоставить всеобъемлющий и подробный протокол о том, как создать генетически модифицированную органотипическую кожу человека из эпидермальных кератиноцитов и девитализированной дермы человека.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Органотипической культуры позволяют воссоздание 3D-среде критическим для контактных клетка-клетка и клетка-матрикс взаимодействий, которые имитирует функции и физиологию их в естественных условиях коллегами ткани. Это подтверждается органотипических культур кожи, которые верой и правдой повторяет дифференциации эпидермиса и стратификации программу. Первичные кератиноциты эпидермиса человека генетически манипулировать через ретровирусов, где гены могут быть легко сверхэкспрессированный или сбил. Эти генетически модифицированные кератиноциты могут быть использованы для восстановления эпидермиса человека в органотипических культур кожи, обеспечивающие мощную модель для изучения генетических путей, влияющих рост, дифференцировку эпидермиса и прогрессирование заболевания. Протоколы, представленные здесь, описывают способы получения девитальных человека дермы, а также генетически манипулировать первичных кератиноцитов человека для того, чтобы генерировать органотипической культур кожи. Регенерированный человеческую кожу можно использовать в downstrEAM приложений, таких как экспрессии генов профилирования, иммуноокрашивания и хроматина иммунопреципитации с последующим высокой пропускной секвенирования. Таким образом, поколение этих генетически модифицированных культур органотипических кожи позволит определить гены, которые имеют решающее значение для поддержания гомеостаза кожи.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эпидермис человека является многослойный эпителий, который подключается к подлежащей дерме через внеклеточный матрикс, известный как базальной мембраны эпидермиса zone.The не только служит в качестве непроницаемого барьера для предотвращения потери влаги, но и в качестве первой линии обороны, чтобы защитить Тело от иностранных и токсичных веществ 1. Базальный слой, который является глубокий слой эпидермиса, содержит эпидермальный стволовых и прогениторных клеток, которые приводят к дифференцированной потомство, которые образуют остальные эпидермиса 2. Как клетки-предшественники эпидермальные дифференциации они мигрируют наверх, чтобы сформировать первый слой дифференцированных клеток, известных как остистые слоя 3. В остистые слоя, клетки включить экспрессии кератинов 1 и 10, которые затем обеспечивают прочность, чтобы выдерживать физические нагрузки для дифференцированных слоев эпидермиса. Как остистые клетки слой дальнейшей дифференциации, они двигаются вверх в эпидермисе в течением зернистом слое, который характеризуется образованием кератогиалиновых и пластинчатых гранул, а также структурные белки, которые собраны ниже в плазматической мембране. Как клетки действовать в процессе дифференцировки в белки под плазматической мембраны поперечно связаны друг с другом в то время как пластинчатые гранулы экструдируют из клеток с образованием богатой липидами барьер под названием роговой слой 4.

Болезни, которые связаны изменения в росте и дифференциации эпидермиса воздействия ~ 20% населения 5. Таким образом, понимание механизмов этого процесса имеет большое значение. С проявлением многих из этих заболеваний является зависит от клетки к клетке или клеточной матрицы контакта, органотипической культуры, где эпидермис человека восстановленные в 3D-среде были созданы 6-10. Эти методы обычно включают использование первичных или трансформированных кератиноцитов, посеянных на внеклеточного матрикса, таких как нежизнеспособных человекадермы, Матригель или коллагена.

Чтобы понять генные регуляторные механизмы, которые важны в росте и дифференциации эпидермиса, кератиноциты может быть генетически манипулировать через ретровирусных векторов нокдаун или гиперэкспрессией генов в 2D культуре, а затем восстанавливали в 3D. Эти методы широко используются для характеристики гены, участвующие в эпидермиса стебля и клеток-предшественников самообновлению и дифференцировке, а также прогрессирования новообразования 11-21. Здесь протокол углубленной о том, как изменить экспрессию гена в эпидермальных органотипических культур за счет использования ретровирусов обеспечивается.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол кожи человека проводили в соответствии с руководящими принципами университета Калифорнии, Комитета по этике исследований в Сан-Диего. Кожа человека может быть получена из выброшенных хирургических образцов или купили у банков кожи (банк кожа перечислены в Материал / оборудование таблице). Место, где кожа является производным от возраста или донора не является критическим для эксперимента тех пор, пока белки базальной мембраны зоны (коллаген / ламинина) в дерме, не деградируют.

1. Подготовка нежизнеспособных человека дермы

  1. При получении человеческую кожу, поместите ткань в капот культуры ткани оттаивать (~ 3-5 мин). В зависимости от размера кожи, разместить талой ткани в стерильной одноразовой 50 мл коническую пробирку емкостью 125 мл или бутылки. Типичный размер кожи от банка кожи 0,75 кв.
  2. Заполните контейнер на 75% с 4-кратным пенициллина и стрептомицина (ручка / стрептококк) в 1x PBS. Встряхивать для5 мин и распоряжаться жидкости. Повторите этот шаг еще 3 раза.
  3. После последней промывки, передать ткань новой трубки / бутылки и добавить свежие 4x пера / стрептококк / PBS, чтобы заполнить 75% емкости. Инкубируйте эту смесь в инкубаторе тканевых культур при 37 ° С в течение 2 недель, чтобы позволить разделение дермы из эпидермиса.
  4. В стерильных условиях, использовать пинцет, чтобы очистить от эпидермис от дермы. Дерма полностью белым цветом, а эпидермис будет окраску в зависимости от расы донора (рис 1А). Откажитесь от эпидермиса в соответствии с протоколом учреждения для борьбы с человеческой тканью.
  5. Поместите дермы в трубку или бутылку и промыть его в 4-кратным ручка / стрептококк, разведенного в PBS 1x с энергичного встряхивания (5 мин моет в 4 раза). После последней промывки, не передавать дермы в новую пробирку / бутылка в 4-кратным ручка / стрептококк, разведенного в PBS 1x и хранить при температуре 4 ° С до готовности к использованию. Дерма можно хранить при 4 ° С в течение до одного года.

    6. 2. Генетически Изменение первичных человеческих кератиноцитов

    Примечание: использование амфотропный Phoenix клетки, выращенные в полной среде DMEM средах [DMEM + 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) + ручка / стрептококк] для получения вирусов инфицировать первичные кератиноциты человека. Вирусные гены, которые кодируют упаковки белки, такие как затычки-Pol и конверт стабильно интегрирована в геном клетки Феникс, который позволяет для производства вируса при трансфекции ретровирусного вектора. Phoenix клетки могут быть трансфицированы с высокой эффективностью позволяет высокой вирусной производства титра. Вирус получают из этой упаковочной линии может также инфицировать большое разнообразие клеток млекопитающих, включая человека.

    1. День 1: За день до трансфекции, семена Phoenix клеток в 6-луночный планшет при плотности 800000 клеток на лунку в полной среде DMEM средств массовой информации.
    2. День 2: В день трансфекции, использовать 3 мкг ретровирусных векторов на лунку. Аликвоты 3 мкг ретровирусного вектора в 1,5 мл пробирку. Используйте смесь М 100; л DMEM плюс 6 мкл реагента для трансфекции для каждого 3 мкг вектора. Смешайте 6 мкл реагента для трансфекции с 100 мкл DMEM в 1,5 мл пробирку. (В ретровирусные векторы, которые используются, перечислены в таблице оборудование / Материалы).
      1. Инкубировать в течение 5 мин и добавляют 106 мкл смеси в предварительно аликвоты пробирку, содержащую 3 мкг ретровирусного вектора. Смешайте и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин. Добавить весь этот каплям смесь в каждую лунку Феникса клеток.
    3. День 3: На следующий день после трансфекции, удалить носитель из Феникса клеток и добавить 2 мл свежей полной DMEM средств массовой информации. В тот же день, семена первичных кератиноцитов человека в 6-луночных планшетах при плотности 75000 клеток на лунку. Поддержание кератиноцитов в свободной среде кератиноцитов в сыворотке крови (KCSFM) с антибиотиками (ручка / стрептококк).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные кератиноциты человека были приобретены. Клетки могут быть приобретены из различных поставщиков (перечисленных в таблице материалов / оборудования).
    4. День 4: Харжилет СМИ из трансфицированных феникс клеток, которые в настоящее время содержит вирусные частицы. Пропустите через средства массовой информации 0,45 мкм фильтр, используя шприц (для удаления каких-либо загрязняющих феникса клетки) и поместите 2 мл на кератиноциты (металлизированные на 75000 клеток / лунку в предыдущий день: см шаг 2,3). Добавить hexadimethrine бромид (5 мкг / мл) в средствах массовой информации, чтобы помочь посредником инфекционного процесса. Вирусные титры ~ 1 х 10 7 ТУ / мл.
      1. Спин 6-луночных планшетах с в центрифуге при 200 х г в течение 1 ч при комнатной температуре. После спина, удалить средах, содержащих вирус и мыть клетки один раз PBS 1x, прежде чем добавлять KCSFM.
    5. День 5: заразить же партию кератиноцитов снова, как в шаге 2.4.
      Примечание: Выбор кератиноцитов с помощью препарата, если есть селектируемый маркер на ретровирусного вектора и расширить для использования в последующей анализа или заявок, таких как органотипических культур.

    3. Настройка Органотипической культур кожи

    1. Строитьорганотипической кассета из распространенных материалов, найденных в лаборатории или кассет может быть выполнена на заказ через металл изготовления магазине (2А - F). Чтобы сделать эти кассеты с 3,5 см планшета для культуры ткани, использовать прижигание удалить 1,0 см х 1,0 см квадрат от центра крышке 3,5 см чашку (2А-В). Сделайте это в стерильных условиях.
      1. Приложить кв штифты в нижней части кассеты (крышка 3.5 см чашку) с использованием четкой лак для ногтей (фиг.2с). Разрешить 5 мин для ногтей, чтобы высушить и перевернуть кассету так, что она лежит на квадратные штифтов (рис 2D). Поместите кассету в 6 см блюдо.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Площадь колышки можно приобрести из различных искусств и ремесел магазинов.
    2. Подготовьте среду роста кератиноцитов (KGM) состоит из 66% DMEM, 22% F12 Хэма, 100 единиц / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 10% FBS, 2,67 мкг / мл аденина, 40 нг / мл гидрокортизона, 10 нг / мл холерного токсина, 4,94 мкг / мл инсулина, 5 мкг / мл трансферрина, 1,36 нг / мл Трийод-L-тиронин, 10 нг / мл EGF, и 10 мкг / мл ципрофлоксацин гидрохлорид. Не фильтр СМИ через фильтр и хранят 0,22 мкм при 4 ° С до готовности к использованию.
    3. Возьмите дермы из 4-кратным ручка / стрептококк + решения PBS и мыть 2 раза в КГМ, а затем инкубировать в КГМ при 37 ° С в течение двух дней до использования.
    4. Вырезать дермы с помощью скальпеля до 1,5 см х 1,5 см по размеру куски, а затем поместить на органотипической кассеты. Поместите дермы с верхней части дермы вверх. В верхней части дермы будет та сторона, которая входит в контакт с кератиноцитами (Фигура 1В).
    5. Поместите нарезанные дермы на квадратный отверстие органотипического кассеты с верхней стороны дермы вверх (фиг.3А).
    6. Переверните весь органотипической кассету, содержащую более дермы с помощью щипцов (рис 3B). Оттепель внеклеточного матрикса решение на льду. Используйте иглу и шприц, чтобы вытянуть 100 мкл внеклеточного матрикса раствора на кассете. Добавить 5 капель на дно дермы (глянцевая сторона) и встряхивают слегка обеспечения равномерного распределения всей дермы (Фиг.3В).
    7. Разрешить 5 мин для коммерческого дополнительной решения сотовой матрицы полностью затвердеть (3С). После затвердевания, используйте щипцы, чтобы перевернуть кассету обратно старше. Добавить 4 мл КГМ на 6 см блюдо.
    8. Поместите 0.5-1 млн генетически модифицированных кератиноцитов на органотипических кассет, содержащих дермы (рис 3D).
      1. Trypsinize кератиноциты путем размещения 4 мл 0,05% трипсина на 10 см пластинах в течение 5 мин и гасят 4 мл полной DMEM средств массовой информации.
      2. Граф кератиноцитов использованием гемоцитометра и затем спин вниз при 200g в течение 5 минут. Млн Ресуспендируйте 0,5-1 клетки (в зависимости от количества клеток, имеющихся в) 90 мкмл КГМ и поставить все клетки на дерму.
        Примечание: Важно, чтобы разместить то же количество клеток дермы на течение того же эксперимента, чтобы гарантировать, что любые различия в толщине видно из эпидермиса регенерированных не из-за различий в стартовый номер клеток. Размещение менее чем 0,5 млн клеток на дермы может привести к ухудшению стратификации и дифференциации.
    9. Изменить КГМ СМИ на органотипических культур каждый день. Урожай ткани 1-14 дней после размещения кератиноцитов на дерму. Полное расслоение и дифференциация эпидермиса обычно происходит после того, как 5-й день.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первым шагом в создании органотипической человеческую кожу, чтобы удалить эпидермис от дермы. Два неделю инкубации кожи при 37 ° С в 4х ручка / стрептококк / PBS должны позволить разделение дермы из эпидермиса (1А). Если разделения эпидермиса и дермы трудно затем поместите ткань при 37 ° C в 4-кратным ручка / стрептококк / PBS в течение другой недели, а затем попытаться снова пилинг с помощью щипцов.

Один из ключей к регенерации эпидермиса человека на нежизнеспособных дермы ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Генетические манипуляции в коже человека органотипической культуры предлагают много преимуществ обычно рассматривается 2D культивированных клеток, а также модели мыши. 2D культуры не имеют трехмерные клеточно-клетка и клетка-внеклеточный взаимодействия матрицы, найденной в интактных тканей и органов. Последние исследования также обнаружили огромные различия между 2D и 3D культивированных раковых клеток кожи с культивируемых клеток 3D, показывая намного больше экспрессии генов сходство с первичной человеческой опухолей к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была supportedby Американское общество рака научных работников Грант (RSG-12-148-01-DDC) и биологии премии МКМР Basic (RB4-05779).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Человеческая кожаНью-Йорк Пожарные Кожа Банкhttp://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html
PEN/STREPGIBCO15140-122
амфотропные клеточные линии фениксаATCCCRL-3213
FUGENE 6 трансфекция реактивPromegaE2691
Кератиноцитарная среда (KCSFM)Life Technologies17005042
DMEMGIBCO11995
Ham's F12Cambrex12-615F
FBSGIBCO10437-028
АденинсигмаA-9795
Холерный токсинсигма  C-8052
ГидрокортизонCalbiochem3896
ИнсулинсигмаI-1882
EGFInvitrogen13247-051
Трансферрин SigmaT-0665
Ципрофлоксацин гидрохлоридСерологический89-001-1
прижиганиеBovie Medical CorporationAA01
MatrigelCorning354234
Кератин 1 антителоBiolegendPRB-149P
квадратные колышки Магазиныдекоративно-прикладного искусства
человека неонатальные кератиноцитыATCCPCS-200-010
неонатальные кератиноциты человекаКлеточное применение102K-05n
MSCV ретровирусный векторClontech634401
LZRS ретровирусный векторAddgene
pSuper.Retro.Puro Ретровирусный векторOligoengineVEC-PRT-0002 
гексадиметрина бромид SigmaH9268-5G

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tadeu, A. M., Horsley, V. Epithelial stem cells in adult skin. Current topics in developmental biology. 107, 107-131 (2014).
  2. Sen, G. L. Remembering one's identity: the epigenetic basis of stem cell fate decisions. FASEB J. 25, 2123-2128 (2011).
  3. Segre, J. A. Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders. J Clin Invest. 116, 1150-1158 (2006).
  4. Eckert, R. L., Sturniolo, M. T., Broome, A. M., Ruse, M., Rorke, E. A. Transglutaminase function in epidermis. J Invest Dermatol. 124, 481-492 (2005).
  5. Lopez-Pajares, V., Yan, K., Zarnegar, B. J., Jameson, K. L., Khavari, P. A. Genetic pathways in disorders of epidermal differentiation. Trends Genet. 29, 31-40 (2013).
  6. Fuchs, E. Epidermal differentiation: the bare essentials. J Cell Biol. 111, 2807-2814 (1990).
  7. Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5665-5668 (1979).
  8. Khavari, P. A. Modelling cancer in human skin tissue. Nat Rev Cancer. 6, 270-280 (2006).
  9. Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., Rosenberg, M. The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology. 9, 163-171 (1992).
  10. Oh, J. W., Hsi, T. C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V. Organotypic skin culture. J Invest Dermatol. 133, e14(2013).
  11. Sen, G. L., et al. ZNF750 Is a p63 Target Gene that Induces KLF4 to Drive Terminal Epidermal Differentiation. Dev Cell. 22, 669-677 (2012).
  12. Sen, G. L., Webster, D. E., Barragan, D. I., Chang, H. Y., Khavari, P. A. Control of differentiation in a self-renewing mammalian tissue by the histone demethylase JMJD3. Genes Dev. 22, 1865-1870 (2008).
  13. Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Zhang, K., Sen, G. L. SNAI2 controls the undifferentiated state of human epidermal progenitor cells. Stem Cells. 32, 3209-3218 (2014).
  14. Truong, A. B., Kretz, M., Ridky, T. W., Kimmel, R., Khavari, P. A. p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes. Genes Dev. 20, 3185-3197 (2006).
  15. Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493, 231-235 (2013).
  16. Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nat Med. 16, 1450-1455 (2010).
  17. Mistry, D. S., Chen, Y., Sen, G. L. Progenitor function in self-renewing human epidermis is maintained by the exosome. Cell Stem Cell. 11, 127-135 (2012).
  18. Kretz, M., et al. Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR. Genes Dev. 26, 338-343 (2012).
  19. Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nat Cell Biol. 14, 753-763 (2012).
  20. Boxer, L. D., Barajas, B., Tao, S., Zhang, J., Khavari, P. A. ZNF750 interacts with KLF4 and RCOR1, KDM1A, and CTBP1/2 chromatin regulators to repress epidermal progenitor genes and induce differentiation genes. Genes Dev. 28, 2013-2026 (2014).
  21. Jameson, K. L., et al. IQGAP1 scaffold-kinase interaction blockade selectively targets RAS-MAP kinase-driven tumors. Nat Med. 19, 626-630 (2013).
  22. Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Sen, G. L. Transcriptional profiling of SNAI2 regulated genes in primary human keratinocytes. Genomics data. 4, 43-46 (2015).
  23. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
  24. Doebis, C., et al. Efficient in vitro transduction of epithelial cells and keratinocytes with improved adenoviral gene transfer for the application in skin tissue engineering. Transpl immunol. 9, 323-329 (2002).
  25. Melo, S. P., et al. Somatic correction of junctional epidermolysis bullosa by a highly recombinogenic AAV variant. Mol Ther. 22, 725-733 (2014).
  26. Nanba, D., Matsushita, N., Toki, F., Higashiyama, S. Efficient expansion of human keratinocyte stem/progenitor cells carrying a transgene with lentiviral vector. Stem cell res ther. 4, 127(2013).
  27. Sen, G. L., Reuter, J. A., Webster, D. E., Zhu, L., Khavari, P. A. DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue. Nature. 463, 563-567 (2010).
  28. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
  29. Krejci, N. C., Cuono, C. B., Langdon, R. C., McGuire, J. In vitro reconstitution of skin: fibroblasts facilitate keratinocyte growth and differentiation on acellular reticular dermis. J Invest Dermatol. 97, 843-848 (1991).
  30. Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Adv Drug Deliv Rev. 69-70, 81-102 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи