Методическая статья

Геомагнитное поле (Gmf) и завод Эволюция: Исследуя эффекты ГМП Разворот на

14.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53286

⸱

30 ноября 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences and Systems Biology, University of Turin, 2Radcliffe Department of Medicine, University of Oxford, John Radcliffe Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает метод проверки гипотезы о том, что инверсия эффективного геомагнитного поля (GMF) индуцирует дифференциальную экспрессию генов и изменяет морфологию Arabidopsis thaliana. Трехосная восьмиугольная система пар спиралей Гельмгольца была использована для искусственного создания обратных условий GMF в камере роста растений.

Аннотация

Один из самых стимулирующих наблюдений в эволюции растений корреляция между возникновением геомагнитного поля (ГМП) развороты (или экскурсии) и момент излучения покрытосеменных. Это привело к предположению, что изменения в GMF полярности может играть роль в эволюции растений. Здесь мы опишем метод, чтобы проверить эту гипотезу, подвергая Arabidopsis THALIANA искусственно обратную условия ГМП. Мы использовали три оси магнитометр и собранные данные были использованы для расчета величины ГМП. Три источника питания постоянного тока были связаны с тремя парами катушек Гельмгольца и контролировались с помощью компьютера, чтобы изменить условия ГМП. Растения, выращенные в чашках Петри были подвержены как прямой и обратной условия ГМП. Также были выполнены с имитацией экспериментов по воздействию. Открытые растения были сфотографированы во время эксперимента и изображения были проанализированы, чтобы рассчитать длину корней и листьев области. Arabidopsis Суммарную РНК экстрагировали и количественныйВ режиме реального времени-ПЦР (КПЦР) проводились анализы экспрессии генов круциферина 3 (CRU3), медь транспортной protein1 (COTP1), окислительно-восстановительного потенциала Отзывчивый Транскрипция Factor1 (RRTF1), Fe супероксиддисмутазы 1, (FSD1), Catalase3 (CAT3), Thylakoidal аскорбатпероксидазы (TAPX), цитозольным Аскорбат Peroxidase1 (APX1), и НАДФН / респираторный взрыв оксидазы белок D (RbohD). Четыре различных опорных генов были проанализированы, чтобы нормализовать результаты количественной ПЦР. Лучший из четырех генов была выбрана и был использован наиболее стабильный ген нормализации. Наши данные показывают, впервые, что изменение полярности ГМП использованием трехосных катушек оказывает значительное влияние на рост растений и экспрессии генов. Это подтверждает гипотезу о том, ГМП разворота способствует индукции изменения в развитии растений, которые могли бы оправдать более высокую селективное давление, в конечном итоге приводит к рLant эволюция.

Введение

Магнитное поле Земли (или, что эквивалентно геомагнитное поле, ГМП) является неизбежным фактором окружающей среды для всех организмов, живущих на планете, в том числе растений. ГМП всегда была естественной чертой Земли, так в процессе эволюции, все живые организмы испытали его действие. Растет количество доказательств показывает, что ГМП имеет возможность влиять на многих биологических процессах 1. ГМП не является равномерным, и существуют значительные различия в местных его величине и направлению на поверхности Земли. ГМП на поверхности Земли показывает широкий спектр величин, начиная с менее чем 30 мкТл почти 70 мкТл. ГМП защищает Землю и ее биосферу от смертельных последствий солнечного ветра, отклоняя большинство его заряженных частиц через магнитосферу 2.

Растения реагируют на стимулы окружающей среды; и классические ответы на абиотических факторов, таких как свет и тяжести были тhoroughly описывается определение так называемых фототропным и ГРАВИТРОПИЧЕСКУЮ ответов. Очень мало, или ничего, как известно, на механизмы восприятия и реакций растений к воздействию магнитных полей, несмотря на множество работ, опубликованных по этой теме, а недавно рассмотренных 1. В отличие от гравитационного поля, ГМП изменилось последовательно в ходе эволюции растений, таким образом, представляет собой важный фактор абиотической стресс, который недавно был рассматриваться в качестве потенциального движущей силой в конечном итоге способствует диверсификации и посадить видообразование 2. Геомагнитных инверсий (или экскурсии) изменения в полярности ГМП. Во время жизни земной истории, инверсии ГМП произошло несколько раз. Они подвергаются планеты периодов пониженной прочности GMF во время каждого перехода полярности. Некоторые авторы предположили, что эти переходы периоды низкой прочностью GMF может позволили ионизирующего излучения от солнечного ветра, чтобы достичь поверхности Земли, тем самым индуцируясоответствует стресс для живых организмов, которые могли бы быть достаточно сильным, чтобы вызвать генные изменения в конечном итоге приводит к эволюции растений 2.

Детальный анализ экспериментов, описывающих эффекты магнитных полей на растения показывает большое количество противоречивых сообщений, характеризующихся нехваткой вероятных механизмов взаимодействия биофизических. Многие эксперименты просто нереально, а другие не имеют проверяемые гипотезы и, в конечном счете, являются неубедительными 3. За последние годы, прогресс и состояние исследований по влиянию магнитных полей на заводе был рассмотрен 2,4-11. Недавно, эффект низких и высоких магнитного поля была подробно рассмотрена 1, с особым акцентом на участии разворота событий ГМП на эволюции растений 2.

Наиболее прямым способом обосновать гипотезу, что инверсии ГМП влияет эволюция завод синтезировать ГМПразворот в лаборатории тестированием ответа растений к прямой и обратной магнитных полевых условиях. Чтобы проверить гипотезу, поэтому мы построили трехосный восьмиугольную Кольца Гельмгольца-пар магнитное поле компенсационной системы (трехосные катушки), которая в состоянии точно вспять нормальные условия ГМП.

Мы использовали Arabidopsis THALIANA в качестве модели завода, и мы протестировали эффект обратной ГМП на экспрессию генов некоторых важных генов: круциферина 3 (CRU3), который кодирует хранения белка 12S семян, тирозин-фосфорилированный и его фосфорилирование состояние модулированный в ответ АБА в семенах Arabidopsis THALIANA 12,13; Медный Транспорт Protein1 (COTP1), который кодирует тяжелых металлов транспорт / детоксикации сверхсемейства белок с преобладающей функцией в почве приобретения Cu и развития пыльцы 14; и окислительно-восстановительного потенциала Отзывчивый Транскрипция Factor1 (RRTF1),который кодирует член ERF (коэффициент отклика этилена) подсемейства B-3 ERF / AP2 фактора транскрипции семейства, который содержит один домен AP2, что облегчит синергетический сотрудничество активации генов путей выражения и присваивать кросс толерантность к абиотическим и биотическим стрессам 15.

Кроме того, мы также проанализировали пять генов, участвующих в окислительных реакции на стресс: Fe супероксид Dismutase1, (FSD1), который кодирует цитоплазматический фермент, который ферментативно и быстро преобразует супероксид-анион (O2 -) и воды (H 2 O) с перекисью водорода (Н 2 О 2) и молекулярный кислород (O 2), 16; Catalase3 (CAT3), что, что кодирует и фермент, который катализирует распад H 2 O 2 в воде кислорода и 17,18; Thylakoidal аскорбатпероксидазы (TAPX), который кодирует хлорпластического тилакоидной пероксидазы, что очищает H 2 O2 19; Аскорбат Peroxidase1 (APX1), который кодирует пероксидазу цитозольную, что очищает H 2 O 2 и является одним из потенциальных мишеней пост-трансляционных модификаций, опосредованных NO-производных молекул 20; и NADPH- респираторный взрыв оксидазы белок D (RbohD), который кодирует фермент, который генерирует O 2 - и играет центральную роль в регулировании роста, развития и ответные реакции на стресс Arabidopsis 21.

Наша методология поля разворота обеспечивает первое свидетельство, что ГМП разворот может вызвать значительные изменения в морфологии и генной экспрессии А. THALIANA корни и побеги. Этот протокол обеспечивает инновационный способ оценки влияния ГМП разворота на морфологию растений и экспрессии генов и могут быть использованы для оценки потенциального влияния ГМП разворота по другим аспектам поведения растений и тем самым вести обсуждение роле ГМП разворота на эволюции растений.

Протокол

1. Установка трехосного катушки

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показаны трехосных катушек, используемых для обратного ГМП.

  1. Включите трехосного магнитометра, чьи зонд вводится в трехосных катушек.
  2. Включите компьютер и запустите магнитометр программное обеспечение, позволяющее собирать данные от трех-осевой магнитометр.
  3. Используйте компонент значения, сообщенные магнитометра для расчета величины ГМП. Например, с магнитометра значений: Bx = 6.39 мкТл, от = 36.08 мкТл, Bz = 20.40 мкТл вычислить напряженность поля 41,94 мкТл с помощью следующего уравнения: B = B ГМП + В дополнительной, где B Дополнительные = (Вх 2 + По 2 + Bz 2) ½ (т.е. 41,9 мкТл в примере.)
  4. Включите трех блоков питания постоянного тока (двойное диапазон: 0-8V / 5A и 0-20 / 2.5A 50W,) каждый подключенный к трем couplЭС Гельмгольца и подключен к компьютеру с помощью подключения GPIB (рис 1B).
  5. Набор напряжения электропитания для получения желаемого магнитное поле с обратным вектором магнитного поля. Например, при B ГМП как на стадии 1.3, и с размером катушки аппаратуры, описанной здесь, установить напряжение на V х = 0,00 V, V у = 30,52 V, V г = 0,00 V, чтобы генерировать новый полученного B = В + В ГМП трехосные катушки = (6.38, -36,08, 20.39) мкТл, т. е новое поле с тем же величины, как B ГМП, но указывая на другую сторону.
  6. Проверка новое поле с программным обеспечением магнитометра с помощью процедуры, описанной в разделе 1.3.
  7. Expose растения в нормальных и отменил условия ГМП с помощью чашки Петри, как описано в разделе 2.
  8. Выполните имитацию эксперименты экспозиции, сохраняя величину поля, равную | В ГМП | и хранениевертикальная составляющая поля равна ГМП, но изменения направления (то есть "Север, Восток или Запад") горизонтальной составляющей поля с одинаковыми токами в катушках трехосных по сравнению с состоянием поля разворота. Для этого изменения напряжения катушки, как описано в 1.5.
    Примечание: Эта экспозиция обман исключает потенциальную тонкий отопления или вибрационные эффекты либо из катушек сами или с электроникой, используемых для управления катушки.
  9. Запустите двойных слепых экспериментов с применением полевых условиях ослепленные от персонала, выполняющего оставшуюся часть экспериментов и / или интерпретации данных.

2. Подготовка материалов и условия для роста растений завода

  1. Использование семена Arabidopsis THALIANA, экотипа Columbia 0 (Col 0), то место в 1,5 мл трубки и поверхностью стерилизации путем обработки 5% (вес / объем) раствор гипохлорита кальция и 0,02% (об / об) Тритон X-100 в 80% -ном этаноле (EtOH), в течение 10-12 мин при 25-28 ° С при непрерывном встряхивании. Затем промыть дважды 80% этанолом, промывают 100% этанолом и, наконец, промыть стерильной дистиллированной водой.
  2. Подготовка 1 л Мурашига и Скуга 22 (MS) модифицированной среде, добавив: 2.297 г МС (0,5 х МС базальной смесь солей), 10 г сахарозы, деионизированная вода до 1 л, рН 5,8-6,0, скорректированной с КОН. Добавить 16 г агара и автоклаве в течение 20 мин, 120 ° С.
  3. Перед затвердевания, залить 80 мл среды в каждую (120 х 120 мм 2) квадратных чашки Петри. Сейте семена тридцать стерильных на тарелку, а затем запечатать пластины с восковым налетом.
  4. Vernalize пластины горизонтально в темноте при 4 ° С в течение 2 дней, чтобы усиливать и синхронизации прорастание, а затем подвергнуть чашках Петри либо нормальный или обратный ГМП.
  5. Expose семена в контролируемой среде климата при 22 ° C в вертикальном положении в параллельных экспериментов как внутри трехосных катушек и за пределами трехосных катушекв соответствии с графиком фотопериода 8 ч темноты и 16 ч света, используя натриевые лампы паров (220 х 10 -6 м Е -2 с -1). Использование синий желатин пленку для внимания, чтобы уменьшить красный компонент ламп.
  6. Expose растения за 10 дней до экстракции РНК для обоих нормальной (контроль) и разворот (лечение) условиях ГМП.
  7. После экспозиции снимать чашках Петри.
  8. Используйте программное обеспечение ImageJ для расчета длины корня и листьев области.
    1. Вкратце, измерить сторону чашки Петри, затем откройте изображение чашки Петри и с помощью опции "прямо" линии, чтобы нарисовать линию, что именно пересекает стороны пластины.
    2. В меню "Анализ" выберите "Задать шкалу" и вставьте длине в поле "известно расстояние" (например, 120 мм), затем вставьте блок длины (мм); наконец, нажмите кнопку "глобальной", чтобы сделать настройки для всех измерений.
    3. Для кенгуруДлина т, внимательно следить за форму корня при помощи функции от руки. Измерьте длину с помощью опции "мера" в меню "Анализ". Продолжайте измерять все корни в картинке и сохраните файл для дальнейшего статистического анализа.
    4. Для листовой поверхности, в меню "Image" использовать настройки опции, а затем "цвета порог". Выберите отдельный лист и в меню "Анализ" выберите "проанализировать частицы". Сохранить отдельные измерения для статистического анализа.

3. Arabidopsis Всего Экстракция РНК, Количественный реальном времени ПЦР (КПЦР) Условия реакции и праймеры для Arabidopsis

  1. Соберите отдельно 30 побегов и 30 корни и немедленно заморозить в жидком азоте. Затем растереть в жидком азоте в ступке пестиком.
  2. Изолировать общей РНК с использованием набора для очистки и РНКазы ДНКазы комплект лечения с помощью ManufacturИнструкции Эра.
  3. Проверьте качество пробы и количество с помощью РНК нано комплект и капиллярного гель-электрофореза в соответствии с инструкциями изготовителя. Подтвердите количественную РНК спектрофотометрически.
  4. Используйте 2 мкг тотальной РНК и случайных праймеров с использованием набора для обратной транскрипции кДНК для получения первой нити кДНК в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя.
  5. Выполните все эксперименты на системы реального времени, используя SYBR зеленый I с ROX в качестве внутреннего стандарта нагрузки.
  6. Провести реакцию с 25 мкл смеси, состоящей из 12,5 мкл 2x SYBR Green КПЦР Master Mix, 0,5 мкл кДНК и 100 нМ праймеров. Используйте праймеров, перечисленных в таблице 1. Включить в управления Управление не-RT (используя тотальную РНК без обратной транскрипции для отслеживания геномной ДНК загрязнения) и контролирует, не шаблон (вода вместо шаблона).
  7. Рассчитать праймера эффективности для всех праймеров пар, использующих стандартМетод кривой 23.
  8. Используйте следующие ПЦР условия: CRU3, COTP1, RRTF1. 10 мин при 95 ° С, 40 циклов 15 сек при 95 ° С, 30 сек при 58 ° С и 30 сек при 72 ° С; UBP6, eEF1Balpha2, СИГН.1, GAPC2, cat3, TAPX, APX1, RbohD, FeSOD1 10 мин при 95 ° С, 40 циклов 15 с при 95 ° С, 20 сек при 57 ° С, 30 сек и при 72 ° С.
  9. Читайте флуоресценции после каждой отжига и расширение фазы. Для всех трасс, выполнить анализ кривой плавления от 55 до 95 ° С, включив диссоциации сегмент тепловой профиль. Используйте экран кривую диссоциации, доступном через вкладку результатов, чтобы посмотреть профиль диссоциации (участок флуоресценции в зависимости от температуры). Убедитесь, что набор данных, собранные в ходе диссоциации сегменте эксперимента выбран для анализа с помощью экрана анализа / Setup.
  10. Определить лInear диапазон концентрации шаблона к значению пороговый цикл (Ct) стоимости путем проведения серии разбавления десятикратное (1 до 10 3-кратное), используя кДНК из трех независимых РНК экстракции анализируемых в трех повторах технических 24,25.
  11. Анализ всех амплификации участков с Real-Time PCR программного обеспечения прибора для получения значений Ct. Калибровка и нормализовать уровни РНК относительные с уровнем лучших генов домашнего хозяйства следующим: 3.11.1) доступ амплификации экранировать Земельные участки на вкладке Результаты выберите рампы или плато, для которых данные должны быть проанализированы с помощью экрана / Setup Анализ выбора, а затем выберите DRn (базовый исправлены нормализуется флуоресценции) из меню флуоресценции в командной панели. Доступ пластину экран, показанный Значения на вкладке результатов для отображения значения Ct для выбранных скважин.
  12. Использование четырех различных эталонных генов [например, цитоплазматический глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPC2), убиквитин specifIC протеазы 6 (UBP6), Actin1 (СИГН.1) и коэффициент удлинения 1B альфа-субъединицы 2 (eEF1Balpha2)], чтобы нормализовать результаты ПЦР в реальном времени. Выберите верхнюю попал ген с помощью программного обеспечения для анализа 26; и использовать наиболее стабильный ген для нормализации.
    1. Вкратце, организовать входные данные в Excel на листе с первого столбца, содержащего имена ген и первый ряд, содержащие названия образцов. Затем выберите программное обеспечение для анализа из меню-баре. Используйте диалоговое окно для выбора входных данных.
    2. Далее, проверить поля Примеры названий, названий генов и простой выход только. Нажмите на кнопку Go для выполнения анализа. Выберите верхнюю попал ген (который имеет наименьшее значение стабильности) как кандидата гена наиболее стабильно выраженную.
  13. Земля данные, показывая выражение изменения перепада раза в обоих побегов и корней.

4. Статистический анализ

  1. Экспресс данные, как средние значения ± стандартная ошибка. Сравните сотрудничествауправляете и лечения группы, выполняя анализ дисперсии (ANOVA) и теста Тьюки с Бонферрони и Данн-Сидак Скорректированная вероятностей теста (0,95% достоверности).

Результаты

Целью настоящего Протокола является обеспечение способа оценить, насколько разворота геомагнитного поля (ГМП) может повлиять на развитие растений и экспрессию гена Arabidopsis THALIANA экотип Коль 0. трехосных катушек, как показано на рисунке 1А используется для изменения ГМП когда набор с соответствующими напряжениями привода (рис 1B), полученные, как описано в шаге 1.5 в протоколе. Размеры трехосных катушек ~ 2 х 2 х 2 м 3, что позволило достаточно места с обратным условиях ГМП в принимающих несколько пластин Петри. Управление выращивали в тех же условиях окружающей среды и при нормальных значений ГМП. Через 10 дней после контакта с прямой и обратной условиях ГМП, фенотип растений показали очевидные морфологические изменения. Как показано на рисунке 2, контрольные растения (т.е., выращенные в нормальных условиях ГМП) показали длины корня со значительно (Данн-Сидак и Бонферрони скорректированной вероят <0,001;Стьюдента т = 10,68, DF = 31) высокие значения (29,41 мм; SEM = 1,04, N = 32) по отношению к растений при обратном ГМП (17,53 мм; SEM = 0,58, N = 36). В ГМП с обратным растений, морфология побегов также изменены, показывая уменьшенную развитие расширения листовки. Растения подвергаются нормальных условиях показали среднюю площадь листьев 4,95 мм 2 (СЭМ 0,025, N = 54), в то время как растения подвергаются обратных условиях ГМП значительно показали (Данн-Сидак и Бонферрони скорректированной Prob = <0,001; студенческой т = 31,32, DF = 53) значения нижнего листа площадь (3,71 мм 2; SEM = 0,032; N = 54). Таким образом, воздействие Arabidopsis обращенной условиях ГМП вызывали уменьшение как длина корней и листьев области.

Расширение листа и рост корней зависит как от разделения и удлинения клеток 27. Таким образом, развитие растений, продуктивность и в целом фитнес зависят от оптимального съемкой и корень-архитектуры системы 28. Снижение длина корня и листьев растений размер, подверженных обратных условиях ГМП указывают наличие системы зондирования в состоянии не только воспринимать изменения в напряженности магнитного поля, но и реагировать на изменения в магнитном поле "направлении" по сравнению с действием силы тяжести. Гипотеза, что ГМП разворот может повлиять на рост растений находит убедительные доказательства в наших экспериментах, которые показывают, что ГМП условия разворота может существенно повлиять на развитие растений.

Морфологические изменения сопровождались также изменения в экспрессии генов. Среди Уборка генов, наиболее стабильной ген был фактор элонгации 1B альфа-субъединицы 2. Первая группа генов (CRU3, COTP1, RRTF1) показали резкое изменение в экспрессии генов (Рисунок 3). Стрелять выражение всех трех генов был значительно увеличен (Р <0,05) примерно в 2,5 раза в растениях подвергаются резерваD условия GMF. Корень выражение CRU3 был активируется в корнях у растений в условиях нормальных условиях ГМП, но был значительно (Р <0,05) подавляется в обратных условиях ГМП. Противоположная был найден для COTP1 и RRTF1, которые были подавляется в нормальных условиях и активируется в присутствии GMF разворота (рисунок 3).

Круциферина (12 S-глобулин) является наиболее распространенным белок хранения в семенах А. THALIANA и другие крестоцветные и синтезируется как предшественник в шероховатой эндоплазматической сети. Он затем транспортируется в вакуолях хранения белка 13. Рассаду прорастание требует разбивку круциферин, который используется в качестве исходного источника азота. Вниз-регулирование круциферина деградации снижает развитие эмбрионов, ослабляя клеточные структуры или клеточных компонентов развития 29,30. Наши результаты показывают, что регуляция CRU3 коррелирует снизший расширение листа и снижение длины корневой, что указывает, что этот ген в чувствительной к GMF разворота и его избыточной экспрессии может способствовать снижению развития растений. Кроме того, ГМП разворот вызывает значительное отрицательная регуляция CRU3 в корнях, что коррелирует с уменьшением длины корня. Медь является важным кофактором для ключевых процессов в растениях, но это оказывает вредное воздействие, превышающие; Таким образом, с гиперэкспрессией меди транспорт компрометирует рост растений. Эффект GMF тенденция была значительная избыточная экспрессия COTP1 в обоих побегов и корней, объясняя тем самым замедленный рост растений. Ион стресс ухудшает обмен веществ, хлоропластов, которые тесно связаны с окислительно-восстановительного состояния клетки. В Arabidopsis транскрипция фактором RRTF1 важен для экспрессии генов, связанных с возможностью приспособиться к окислительно-восстановительным изменения 31. Поэтому, когда растения подвергаются воздействию внешних раздражителей, способных изменить их физиологического и развитиеаль программы сверхэкспрессию этого важного фактора транскрипции ожидалось. Восстановление ГМП вызывали значительное сверхэкспрессию RRTF1 в обоих побегов и корней, что свидетельствует более высокие окислительные реакции стресса растений с обращенной условиях ГМП.

Интересные результаты получены при анализе пять генов, участвующих в окислительного стресса. В общем, все гены, извлеченные и проанализированные в побегах не показали существенных различий (P> 0,05), когда растения были выращены в нормальном или вспять условия ГМП (рис 4 и рисунок 5). Тем не менее, значительное вниз регулирования всегда наблюдалось в корнях растений, подвергшихся обратных условиях ГМП. В частности, CAT3 показал высокую негативную регуляцию (Рисунок 5), а затем в порядке понижающей по APX1, FSD1, RBOHD и TAPX (рисунок 4).

Крест терпимости кбиотических и биотических напряжений обеспечивается за счет активации различных генов, вовлеченных в несколько биохимических путей. фактором транскрипции RRTF1 облегчает синергическое взаимодействие активации экспрессии гена этих путей 15,31, и может быть потенциально участвуют в окислительном стрессе 32. Таким образом, регуляция RRTF1 ожидается, когда поглощающий кислород уменьшается. Подавление корневых поглощающих ферментов коррелирует с усилением активности RRTF1, который действует в ответ на увеличение окислительного стресса. Драматическая корневой подавление cat3, APX1 и TAPX указывает снижение способности корневых клеток, чтобы убрать мусор H 2 O 2, которая сопровождается пониженной способностью dismutate супероксид-анион в по подавлением FSD1. Ответы окислительный стресс выше в корнях, которые появляются, чтобы быть основным местом обратном ГМП восприятия.

figure-results-1
Рисунок 1. Геомагнитная полевая система компенсации. (А) трехосные катушки (содержащие пару восьмиугольные катушек для каждого из трех перпендикулярных осей) используется для изменения вектора геомагнитного поля. (B) с компьютерным управлением питания подключен к каждой пары катушек Гельмгольца. (Напряжения в этих цифрах произвольны) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2. Влияние геомагнитного поля на разворот Arabidopsis морфологии. После десяти дней пребывания, контрольных растений (например, тех, кто подвергается нормальных условиях ГМП) показывают значительно большую длину корня и больше ExpanDED листовки по сравнению с растениями, которые были подвержены обратных условиях ГМП. Метрическая бар = 18 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3. Влияние геомагнитного поля на разворот экспрессии генов арабидопсиса. Через десять дней после контакта, тотальную РНК из контрольных и обработанных растений экстрагировали и анализировали с помощью ПЦР в реальном времени для анализа экспрессии. Эффект инверсии ГМП было вызвать резкое изменение в экспрессии генов всех генов, которые были проверены CRU3, круциферина 3;. COTP1, медь транспорта Protein1; RRTF1, окислительно-восстановительного потенциала Отзывчивый Транскрипция Factor1. Бары указывают стандартную ошибку; звездочки обозначает значительные (р <0,05) различия между плмуравьи подвергаются отменено, и нормальных условиях ГМП. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4. Влияние геомагнитного поля на разворот экспрессии генов Arabidopsis антиоксидантной связанных. После десяти дней пребывания, общая РНК контроля и обработанных растений выделяют и используют для анализа экспрессии генов с помощью ПЦР в реальном времени. Эффект инверсии ГМП была не вызывают никаких существенных изменений в экспрессии генов стрелять; Однако, резкое подавление наблюдалось в корневом экспрессии генов растений, выращенных в условиях обращенных ГМП TAPX, Thylakoidal аскорбатпероксидазы;. APX1, аскорбиновая кислота Peroxidase1; FSD1, Fe супероксид Dismutase1; RbohD, Н.А.. DPH / респираторный взрыв оксидазы D белка Бары указывают стандартную ошибку; звездочки обозначает значительные (p <0,05) различия между растениями, подверженных вспять и нормальных условиях ГМП. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 5. Влияние геомагнитного поля на разворот Arabidopsis каталазы 3 (CAT3) экспрессии генов. После десяти дней пребывания, общая РНК контроля и обработанных растений выделяют и используют для анализа экспрессии генов с помощью ПЦР в реальном времени. Эффект инверсии ГМП была не вызывают никаких существенных изменений в экспрессии генов стрелять; Однако, резкое подавление наблюдалось в корневом экспрессии генов растений, выращенных в условиях обращенных ГМП. Бары показывают стандартное ERROр; звездочки обозначает значительные (p <0,05) различия между растениями, подверженных вспять и нормальных условиях ГМП. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Мы недавно показали, что удивительная корреляция между ГМП и время, когда отвлечение большинство семейных покрытосеменных линий произошло 2. Тем не менее, несмотря на стимулирующие гипотез и множество исследований о влиянии разнообразных интенсивности ГМП, в предположении, что ГМП разворот может сам вызывают значительные изменения в экспрессии генов растений и морфологии никогда не была продемонстрирована. Здесь показано впервые, метод, который использует трехосный восьмиугольную Гельмгольца катушку обратной ГМП в нашей лаборатории, и что поворот окружающего магнитного поля может привести к фенотипические изменения и модуляции экспрессии гена в растениях.

Для того чтобы получить GMF разворот (или изменения) в течение достаточного объема для экспериментов по выращиванию растений (2 х 2 х 2 м 3), мы создали систему восьмиугольную катушки Гельмгольца. Эта система не является коммерчески доступных (как правило, катушки Гельмгольца которые кольцеобразный и меньше)и затраты на строительство были значительными. Важно отметить, что эта система обеспечивает надежную модификацию поля, с исключительным времени стабильность и однородность в модифицированных магнитных полей.

Система спроектирована и построена, чтобы уменьшить значение ГМП до тысячной доли нормальных условиях или отменить любой из трех размеров магнитного поля. Однако конструкция из катушек не позволяет генерировать высокую напряженность магнитного поля. Таким образом, этот инструмент в настоящем виде не подходит для экспериментов, чтобы оценить эффект высокого магнитного поля на растения или других организмов.

В лаборатории, изменение ГМП, аналогичных описанным в данном методе было получено различными методами, в том числе защиты от окружающих экспериментальную зону ферромагнитными металлических пластин с высокой магнитной проницаемостью, которые отклоняются магнитных полей и концентрируют их в самом металле. Чте Преимущество использования катушки Гельмгольца, что система позволяет растениям быть подвержены более естественных условиях (света, циркуляции воздуха, и т.д.), что делает его идеально подходит не только для исследований в пробирке (как с использованием чашек Петри), но также для в естественных условиях роста растений и экспериментов в области развития. Размеры нашей системе создать пространство, которое позволяет подавление до <1/1000-природного ГМП в течение 25 х 25 х 25 см 3 сферического объема (рис 1А), что позволяет провести несколько пластин Петри или небольшие горшки для роста растений.

Метод, представленный здесь, был применен к биологии растений исследований; Однако, система позволяет широкий спектр экспериментов, в том числе вирусологии и микробиологии, а также исследования по нематод (например, Caenorhabditis Элеганс), членистоногих и мелких животных (в том числе мышей и крыс). Таким образом, испытания гипотезы, что инверсия ГМП способенчтобы вызвать морфологические и транскрипционные изменения также может быть распространено на многих других живых систем, возможно, в конечном счете, даже человеческих клеток.

ГМП постоянно меняется и колеблется. Таким образом, в наших экспериментах одним из основных задач является обеспечение постоянной компенсацию ГМП для того, чтобы получить желаемые новые значения ГМП. Это может быть достигнуто только путем непрерывного контроля магнитных полей значений посредством чтения значений магнитометра и компенсации напряжения. Таким образом, система может компенсировать медленно меняющуюся часть ГМП, но он ничего не делает для высших частоты колебаний.

В заключение, использование трехосных катушек переломить вектор GMF способствовал, чтобы продемонстрировать, что этот поворот вектора ГМП способен индуцировать морфологические изменения растений и дифференциальным выражением генов. Результаты, полученные с предложенного метода обеспечивают убедительные доказательства в пользу гипотезы, что ГМП повторногоversals, возможно, было одной из движущих сил для эволюции растений в течение геологических масштабах времени 2.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом MEM от Департамента наук о жизни и системной биологии Университета Турина, Италия. Авторы благодарят Г. Гнави за техническую помощь в проведении ряда экспериментов. CTR финансируется Wellcome Trust и Королевским обществом (грант No 098436/Z/12/Z).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Трехосевой магнитометрBartington Mag-03MCтрехосевой феррозондовый магнитометр
Блок питания магнитометраBartington Mag-03PSUтрехосевой феррозондовый магнитометр
программное обеспечениеBartington Трехосевой феррозондовый магнитометрMag03DAM
Agilent TechnologiesE3642A
Гипохлорит кальция Sigma211389
Triton X-100 SigmaX100 
ЭтанолSigma2860
GroLux Натриевые лампы для паров OSRAM Sylvania600W
RNeasy Набор для растительных РНК Qiagen74903
ДНКаза без РНКазы Qiagen79254
Agilent 2100 БиоанализаторAgilent TechnologiesG2938B
NanoDrop ND-1000 Thermo Fisher Scientificнедоступен
Набор для обратной транскрипции кДНК с высокой емкостью Прикладные биосистемы4368813
Mx3000PAgilent Technologies401512
2x MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix Fermentas International, IncK0221
ПарапленкаSigmaP7793-1EA
Murashige и Skoog Basal MediumSigmaM5519 
Чашка Петри квадратная (120 x120 мм2)SigmaZ692344 
постоянного тока

Ссылки

  1. Maffei, M. E. Magnetic field effects on plant growth, development, and evolution. Front. Plant Sci. 5, (2014).
  2. Occhipinti, A., De Santis, A., Maffei, M. E. Magnetoreception: an unavoidable step for plant evolution. Trends Plant Sci. 19 (1), 1-4 (2014).
  3. Harris, S. R., et al. Effect of magnetic fields on cryptochrome-dependent responses in Arabidopsis thaliana. J. Royal Soc. Interf. 6 (41), 1193-1205 (2009).
  4. Phirke, P. S., Kubde, A. B., Umbarkar, S. P. The influence of magnetic field on plant growth. Seed Sci. Technol. 24 (2), 375-392 (1996).
  5. Abe, K., Fujii, N., Mogi, I., Motokawa, M., Takahashi, H. Effect of a high magnetic field on plant. Biol. Sci. Space. 11, 240-247 (1997).
  6. Volpe, P. Interactions of zero-frequency and oscillating magnetic fields with biostructures and biosystems. Photochem. Photobiol. Sci. 2 (6), 637-648 (2003).
  7. Belyavskaya, N. A. Biological effects due to weak magnetic field on plants. Adv. Space. Res. 34 (7), 1566-1574 (2004).
  8. Weber Bittl, R., S, Transient radical pairs studied by time-resolved EPR. Biochim. Biophys. Acta- Bioenerg. 1707 (1), 117-126 (2005).
  9. Pazur Galland, P., A, Magnetoreception in plants. J. Plant Res. 118 (6), 371-389 (2005).
  10. Minorsky, P. V. Do geomagnetic variations affect plant function. J. Atm. Solar-Terrestr. Phys. 69 (14), 1770-1774 (2007).
  11. Burda Vanderstraeten, J., H, Does magnetoreception mediate biological effects of power-frequency magnetic fields. Sci. Tot. Environ. 417, 299-304 (2012).
  12. Job, C., Rajjou, L., Lovigny, Y., Belghazi, M., Job, D. Patterns of protein oxidation in Arabidopsis seeds and during germination. Plant Physiol. 138 (2), 790-802 (2005).
  13. Wan, L. L., Ross, A. R. S., Yang, J. Y., Hegedus, D. D., Kermode, A. R. Phosphorylation of the 12 S globulin cruciferin in wild-type and abi1-1 mutant Arabidopsis thaliana (thalecress) seeds.. Biochem J. 404, 247-256 (2007).
  14. Sancenon, V., Puig, S., Mira, H., Thiele, D. J., Penarrubia, L. Identification of a copper transporter family in Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 51 (4), 577-587 (2003).
  15. Foyer, C. H., Karpinska, B., Krupinska, K. The functions of Whirly1 and Redox-Responsive Transcription Factor 1 in cross tolerance responses in plants: A hypothesis. Philos.Trans.Royal Soc.B-Biol.Sci. 369 (1640), 20130226(2014).
  16. Myouga, F., et al. A heterocomplex of iron superoxide dismutases defends chloroplast nucleoids against oxidative stress and is essential for chloroplast development in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (11), 3148-3162 (2008).
  17. Mhamdi, A., Queval, G., Chaouch, S., Vanderauwera, S., Van Breusegem, F., Noctor, G. Catalase function in plants: a focus on Arabidopsis mutants as stress-mimic models. J. Exper. Bot. 61 (15), 4197-4220 (2010).
  18. Bassham Contento, A. L., C, D. Increase in catalase-3 activity as a response to use of alternative catabolic substrates during sucrose starvation. Plant Physiol. Biochem. 48 (4), 232-238 (2010).
  19. Kangasjarvi, S., et al. Diverse roles for chloroplast stromal and thylakoid-bound ascorbate peroxidases in plant stress responses. Biochem. J. 412, 275-285 (2008).
  20. Begara-Morales, J. C., et al. Dual regulation of cytosolic ascorbate peroxidase (APX) by tyrosine nitration and S-nitrosylation. J. Exper. Bot. 65 (2), 527-538 (2014).
  21. Li, N., et al. AtrbohD and AtrbohF negatively regulate lateral root development by changing the localized accumulation of superoxide in primary roots of Arabidopsis. Planta. 241 (3), 591-602 (2014).
  22. Skoog Murashige, T., F, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962).
  23. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nuc. Acids Res. 29 (9), (2001).
  24. Bustin, S. A., et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  25. Phillips, M. A., D'Auria, J. C., Luck, K., Gershenzon, J. Evaluation of candidate reference genes for real-time quantitative PCR of plant samples using purified cDNA as template. Plant Mol. Biol. Rep. 27 (3), 407-416 (2009).
  26. Andersen, C. L., Jensen, J. L., Orntoft, T. F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: A model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer Res. 64 (15), 5245-5250 (2004).
  27. Tsukaya, H. Developmental genetics of leaf morphogenesis in dicotyledonous plants. J. Plant Res. 108 (1092), 407-416 (1995).
  28. Szymanowska-Pulka, J. Form matters: morphological aspects of lateral root development. Ann. Bot. 112 (9), 1643-1654 (2013).
  29. Black Bewley, J. D., Seeds, M. Physiology of development and germination. , Plenum Press. New York. (1994).
  30. Kato-Noguchi, H., Ota, K., Kujime, H., Ogawa, M. Effects of momilactone on the protein expression in Arabidopsis germination. Weed Biol. Manage. 13 (1), (2013).
  31. Khandelwal, A., Elvitigala, T., Ghosh, B., Quatrano, R. S. Arabidopsis transcriptome reveals control circuits regulating redox homeostasis and the role of an AP2 transcription factor. Plant Physiol. 148 (4), 2050-2058 (2008).
  32. Haddad, J. J. Oxygen-sensing mechanisms and the regulation of redox-responsive transcription factors in development and pathophysiology. Respirat. Res. 3 (1), (2002).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи