Выделение вирусной репликации отсек обогащенных субъядерных фракций из аденовируса-инфицированных клетках человека нормальный

Summary

Мы предлагаем новую стратегию для выделения вирусных репликационных компартментов (RC) из инфицированных аденовирусом (Ad) клеток человека. Этот подход представляет собой бесклеточную систему, которая может помочь выяснить молекулярные механизмы, регулирующие репликацию и экспрессию вирусного генома, а также регуляцию взаимодействий вирус-хозяин, установленных в РЦ.

Abstract

Во время заражения клеток человека аденовирусом (Ad) ядро клетки-хозяина резко реорганизуется, что приводит к образованию ядерных микроокружений за счет рекрутирования вирусных и клеточных белков на участки, занимаемые вирусным геномом. Эти сайты, называемые репликационными компартментами (RC), можно считать вирус-индуцированными ядерными доменами, в которых локализуется вирусный геном и рекрутируются вирусные и клеточные белки, участвующие в репликации, транскрипции и посттранскрипционной обработке. Кроме того, клеточные белки, участвующие в противовирусном ответе, такие как белки-супрессоры опухолей, компоненты ответа на повреждение ДНК (DDR) и факторы врожденного иммунного ответа, также кооптируются в RC. Несмотря на то, что РК, по-видимому, играют решающую роль в обеспечении эффективного и продуктивного цикла репликации, детальный анализ их состава и связанной с ними деятельности не проводился. Чтобы облегчить изучение аденовирусных RC и, возможно, других ДНК-вирусов, которые реплицируются в ядре клетки, мы адаптировали простую процедуру, основанную на градиентах скорости, для выделения Ad RC и создали бесклеточную систему, пригодную для проведения морфологических, функциональных и композиционных исследований этих вирус-индуцированных субъядерных структур, а также для изучения их влияния на взаимодействие хозяина с клеткой.

Introduction

Аденовирусы содержат геном двухцепочечной ДНК, который воспроизводит в ядре зараженной клетки. Когда вирусная ДНК проникает в ядро, она локализуется рядом с ПМЛ ядерных ^тел 1. После вирусной экспрессии генов раннего, ядерная архитектура резко реорганизована, вызывая образование вирусных микросреды, называется вирусной репликации Отсеки (RC) ^2. Так аденовирус (объявление) RC сайты, где репликации вирусного генома и экспрессия вирусных генов конце происходят, они обеспечивают среду для вербовки всех необходимых вирусных и клеточных факторов, участвующих в этих процессах. Интересно, что различные клеточные белки, ответственные за сотовой противовир....

Protocol

1. HFF клеточной культуре и Ad-инфекции

1. Propagate вирус Ad5 WT в монослоев клеток НЕК-293 и титра, люминесцентных единиц (ФФУ) по HFF клеток, как описано ранее ^8.
2. Выращивают фибробласты крайней плоти человека (HFF) в 10 мл DMEM / 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), в стерильной культуральной 100 мм чашках при 37 ° С и _5% СО 2 в увлажненном инкубаторе. Определить количество клеток с помощью камеры Neubauer в подсчетом клеток в четырех 16-квадратных наборов. Число клеток на мл получают путем вычисления среднего количества клеток в четырех 16-квадратных наборов и умножения этого числа на ¹⁰ 4. Для каждого периода в....

Results

Так вирусные отсеки репликации (RC) являются субъядерных вирусные индуцированной структуры, состоящие из белков и нуклеиновых кислот, подобных других ядерных областей, они оказались пригодны для изоляции от градиентов скорости на основе биохимических особенностей. Критические шаги в протоколе фракционирования представлены на рисунке 1. На каждом шаге образцы должны быть проверены ярко микроскопии для обеспечения целостности различных субклеточных фракций. Например, когда отек клеток, вр.......

Discussion

Для выяснения молекулярных механизмов, которые регулируют регуляцию клеточной активности вирусной инфекции, понимание состава и активности, связанных с РЦ, будет полезным. Таким образом, чтобы провести детальный анализ RC, мы создали бесклеточную систему, которая использует преимущества размера и биохимического состава этих вирус-индуцированных структур для выделения субядерных фракций, обогащенных RC, с помощью простой процедуры, основанной на градиентах скорости с сахарозными подушками. Важнейшими этапами процедуры, тр.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	12100-046	Теплый в 37 º C водяная баня перед применением
Фетальная бычья сыворотка	Gibco	12484-028
Сахароза, ультра чистая	исследовательская органика	0928S	Приготовьте 2,55 М стоковый раствор и храните при 4 º C
Гомогенизатор Dounce	Kontess Glass Company	884900-0000
Branson 1800 Ультразвуковая ванна	Branson	Z769533  SIGMA	Включите за 15 минут до использования.
Козье антимышиное антитело IgG1 вторичное, конъюгат Alexa Fluor 488	Life Technologies	A-21121	Использование в разведении 1:2,000 в PBS
Silane-Prep Slides	Sigma	S4651-72EA	Открыть в ламинарном проточном шкафу
SuperSignal West Pico Хемилюминесцентная подложка	Pierce ThermoScientific	34080