Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Описание фактора транскрипции зависимая регуляция микроРНК Транскриптом

7.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53300

⸱

15 июня 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology, Davidoff Cancer Center, Rabin Medical Center, 2The Center of Nanoscience and Nanotechnology, Tel Aviv University, 3Experimental Therapeutics, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы предлагаем стратегию изучения влияния интересующего фактора транскрипции на транскриптом микроРНК с использованием общедоступных данных, вычислительных ресурсов и высокопроизводительных данных из массивов микроРНК после трансфекции клеток с малой шпилькой (sh)РНК, нацеленной на интересующий фактор транскрипции.

Аннотация

В то время как регуляция транскрипции генов, кодирующих белок был хорошо изучен, очень мало известно о том, как факторы транскрипции, принимают участие в транскрипции некодирующих РНК, в частности микроРНК. Здесь мы предлагаем стратегию для изучения потенциальной роли фактора транскрипции в регуляции транскрипции микроРНК с использованием общедоступный данных, вычислительные ресурсы и высокие данные пропускной способности. Мы используем эпигенетическую подпись H3K4me3 для идентификации микроРНК промоторы и иммунопреципитации хроматина (CHIP) данные характерны чередования проекта ENCODE для выявления микроРНК промоутеров, которые обогащены сайтов связывания транскрипционных факторов. Трансфекцией клетки, представляющие интерес с shRNA ориентируетесь на транскрипционный фактор интереса и подвергая клетки к микроРНК массива, мы изучаем влияние этого фактора транскрипции на транскриптома микроРНК. В качестве иллюстративного примера мы используем наше исследование о влиянии STAT3 на микроРНК транскриптома хронического Lymphocytic лейкоз (ХЛЛ) клетки.

Введение

MicroRNAs являются эндогенными малые не кодирующие регуляторные РНК, которые, как правило, функционируют как негативные регуляторы экспрессии мРНК на пост-транскрипционном уровне. Приблизительно 1000 некодирующих от 20 до 25 нуклеотид длинные микроРНК обнаружены в геноме человека 1,2. MicroRNAs регулируют экспрессию генов посредством канонического спаривания оснований между последовательностью семенем микроРНК и ее комплементарной последовательностью соответствия семян, которая обычно расположена в нетранслируемой области 3 '(UTR) мишени мРНК. Все вместе, микроРНК регулируют более 30% протеина генов , кодирующих 3, но только очень мало известно о транскрипции с ДНК микроРНК. Было высказано предположение о том , что регулирование транскрипции микроРНК аналогична мРНК 4,5. В частности, подобно его активности в продвижении транскрипции генов , кодирующих белок, факторы транскрипции , как полагают , чтобы активировать транскрипцию микроРНК 6. Транскрипция фактор-мicroRNA взаимодействие было сообщено как фактор модулятора экспрессии гена 7, а также может формировать обратную связь и прямой подачей петли. Например, Yamakuchi и др. Сообщили , контур обратной связи , в котором р53 индуцирует экспрессию microRNA34a, что , в свою очередь , ингибирует трансляцию р53 репрессора SIRT и тем самым увеличивая активность p53 8.

В то время как конкретные примеры зависимого фактора транскрипции экспрессии микроРНК сообщалось, общепринятый метод, который дает информацию о том, как фактор транскрипции интерес регулирует экспрессию микроРНК-транскриптом отсутствует. Целью протокола предлагаемого в настоящем документе, чтобы обеспечить описание углубленную фактора транскрипции-зависимой регуляции микроРНК-транскриптома. Объединив общедоступный данные, биоинформатики инструменты и с использованием технологии микрочипов, исследователи, которые следуют за этот алгоритм будет иметь возможность захватить на геномной шкале, как любойфактор транскрипции, в любом типе клеток, представляющих интерес регулирует экспрессию микроРНК-транскриптом, а также изучить предполагаемый вклад фактора транскрипции мРНК в регуляции экспрессии микроРНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Определение фактора транскрипции сайтов связывания в промоторе микроРНК Гены Использование интеллектуального анализа данных подход

  1. Используйте Калифорнийский университет Санта-Круз (УСК) генома браузер для извлечения данных иммунопреципитация (ЧИП) секвенирования хроматина, сгенерированные в рамках проекта Энциклопедии элементов ДНК (ENCODE).
    1. Откройте браузер таблицы в геноме браузера УСК.
    2. Используйте следующие спецификации для извлечения таблицы: клады: (Млекопитающие), геном: (человека), Ассамблея: (Feb2009 (GRch37 / hg18)), группа: (регулирование), дорожки (TxnFactorChIP), таблица: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), область : (Геном), формат вывода (все гены от выбранной таблицы).
    3. Сохранить вывод 1.1.2 как текстовый файл и в таблицу.
    4. Сортировка и фильтр для фактора транскрипции представляющего интерес (например, STAT2).
  2. Используйте список микроРНК промоутеров на основе H3K4me3 эпигенетических подписи имеющейся у Baeer и др. 9 . Скопируйте этот список в текстовый файл.
  3. Для того, чтобы соответствовать по координатам на геном человека, сопоставить данные из 1.1 и 1.2 (например, STAT3 связывания на предполагаемых микроРНК промоутеров) и определяют медианное аффинности связывания с использованием кода , написанного на C #, как указано в дополнительный файл 1 кодирования.

2. Используйте shRNA для понижающей регуляции экспрессии транскрипционного фактора интереса

  1. Пластина 1,5 х 10 6 клеток из 293 эмбриона человека линии клеток почки в 10 см пластины приблизительно 50% слияния (DMEM с 10% FBS).
  2. Трансфекции клеток от 293 эмбриона человека линии клеток почки с 5 мкг белка зеленой флуоресценции (GFP) лентивирусов, содержащего shRNA направленный к фактору транскрипции интересующего и с 5 мкг упаковочных векторов с использованием реагента для трансфекции для адгезивных клеток, в соответствии с протоколом производителя.
  3. В качестве контроля трансфекции клеток от 293 эмбриона человека линии клеток почки свскарабкался shRNA и упаковочные векторы в соответствии с протоколом производителя.
  4. Хранить смесь для трансфекции на клетках в течение 16 ч (при 37 ° С, СО 2 инкубатор), а затем замены среды до 10 мл свежей 10% DMEM среды с добавлением 10% FBS.
  5. Подождите 48 часов после трансфекции, центрифугирование клеточной культуры (300 XG, 5 мин) и собирают супернатант инфекционный. Фильтр супернатанта через фильтр в шприце с размером пор 0,45 мкм (25-мм поверхностно-активное вещество из ацетата целлюлозы без мембраны) для удаления плавающих клеток.
  6. Концентрат супернатант и собирают лентивирусов с использованием ultracentrifugal устройства фильтра с порогом 100 кДа. Спин при 950 мкг в течение 30 - 60 мин, пока объем был концентрат менее 250 мкл. Хранить концентрированный вирус при -80 ° С.
  7. Трансфекцию клетки с лентивирусов. Удалить замороженную лентивирус от -80 ° C морозильника и разморозить до комнатной температуры. Перенести 100 мкл вирусного супернатанта в свежую 1,5 мл пробирке.
    1. Бринг до объема в трубке до 1 мл со сниженной сывороточной средой. Добавить бромид hexadimethrine к 1 мл суспензии вируса в конечной концентрации 10 нг / мл, осторожно перемешать и дайте смеси отстояться в течение 5 мин.
  8. Центрифуга 5 × 10 6 клеток для каждой трансдукции и осторожно ресуспендируют осадок клеток в 0,5 мл среды , содержащей вирус. Пусть клетки остаются в инкубаторе в течение 4 - 24 ч, а затем добавляют 0,5 мл среды с 20% FBS до конечной концентрации 10% FBS.
  9. Подождите 48 до 72 ч и окрашивает клетки с пропидийиодидом (PI) и зеленого белка флуоресцентной (GFP) в соответствии с инструкциями изготовителя. Защищают клетки от света и использовать FACS сортировщик для измерения темпов GFP + / PI - клетки. Так как PI пятна только мертвые клетки, этот показатель является оценкой эффективности трансфекции в живых клетках.
  10. Сортировать положительную популяцию клеток к экспрессии GFP (GFP +) с помощью FACS сортировщик , как описано выше 10.
  11. Использование Westeгп иммунный блоттинг , как описано выше 10 , чтобы определить уровни фактора транскрипции интересующего до и после того, как инфицировать клетки интерес (например, ХЛЛ клетки) с назначенным shRNA.

3. Определение уровня экспрессии микроРНК Транскриптом в клетках, трансфицированных фактор транскрипции-shRNA

  1. Изолировать РНК с использованием коммерческого набора в соответствии с протоколом производителя.
  2. Добавьте РНК и гибридизуются его микроРНК микрочипов 11.
  3. Определить дифференциально выраженную микроРНК в клетках , трансфицированных фактор транскрипции-shRNA или с пустыми векторных элементов управления 5.
  4. Проверка результатов микрочипов для наиболее дифференциально экспрессируются микроРНК с использованием ПЦР в реальном времени 5.

4. Определить Промежуток между биоинформатики и подход shRNA в описании зависимых Транскриптом фактора транскрипции

  1. опргорностая ожидаемые и наблюдаемые соотношения генов микроРНК , которые укрывают сайтов связывания транскрипционных факторов в их промоутеров и были подавляются в транскрипции фактор-shRNA трансфицированных клеток, выполните следующие действия :
    1. Получить соотношение количества генов, которые укрывают фактор транскрипции интерес в их общей промотор / микроРНК из списка, генерируемого в 1.3. Этот список представляет собой ожидаемый коэффициент (например, гены микроРНК с STAT3 сайты связывания / всего генов микроРНК испытания = 0,25).
    2. Определить количество генов , которые были подавляются в фактор транскрипции-shRNA трансфицированных клеток из списка , генерируемого в 3.3 и имеет фактор транскрипции процентных связывающих сайтов из списка , генерируемого в 1.3. Это число / общее число генов подавляются является наблюдаемое отношение (например, гены микроРНК с STAT3 сайтов связывания / общее число подавляются микроРНК = 0,6).
  2. Используйте χ2 статистику для сравнения наблюдаемых и ожидаемых соотношений, которые были созданы выше, и определить, является ли список генов, которые были подавляются в фактор транскрипции-shRNA трансфицированных клеток обогащены сайтов связывания транскрипционных факторов в их промотор.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

STAT3 представляет собой фактор транскрипции , который обычно индуцирует транскрипцию генов , которые обладают противовоспалительными апоптическая и пролиферативные эффекты 12. Является ли STAT3 также влияют на некодирующие РНК транскриптом в настоящее время неизвестно. Во всех ХЛЛ клетках STAT3 является конститутивно фосфорилируется по остаткам серин 707 остатков 10,13. Фосфосерин STAT3 челноки к ядру, связывается с ДНК и активирует гены , как известно, активируетс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Механизм, лежащий в основе РНК-полимеразы II-зависимую транскрипцию белок-кодирующих генов хорошо изучена. В то время как эти элементы составляют лишь 1% - 2% генома человека, данные из проекта ENCODE предполагают , что более 80% генома человека может подвергаться транскрипцию 17 и что регулирует транскрипцию некодирующих элементов ДНК остается в значительной степени неизвестны 6 ,

Несколько исследований, в которых указано , что Pol II также отвечает за транскрипцию нек...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантом Фонда ХЛЛ Global Research. Университет Техаса MD Anderson Cancer Center поддерживается частично Национальным институтом здоровья через онкологический центр поддержки Грант (P30CA16672).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Липофектамин 2000Life Technologies11668027
0,45 м шприцевой фильтрThermo Scientific (Nalgene)190-2545
Амикон ультрацентробежный фильтрующий аппарат с порогом 100  kDaMerck Millipore
PolybreneMerck MilliporeTR-1003-G
TRIzol реагентLife Tachnologies (Invitrogen)15596-026
293 Клеточная линия человекаSigma-Aldrich85120602

Ссылки

  1. Bentwich, I., et al. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet. 37, 766-770 (2005).
  2. Hata, A. Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease. Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).
  3. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
  4. Piriyapongsa, J., Jordan, I. K., Conley, A. B., Ronan, T., Smalheiser, N. R. Transcription factor binding sites are highly enriched within microRNA precursor sequences. Biol Direct. 6, 61(2011).
  5. Rozovski, U., et al. Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 regulates microRNA gene expression in chronic lymphocytic leukemia cells. Mol Cancer. 12, 50(2013).
  6. Turner, M. J., Slack, F. J. Transcriptional control of microRNA expression in C. elegans: promoting better understanding. RNA Biol. 6, 49-53 (2009).
  7. Cui, Q., Yu, Z., Pan, Y., Purisima, E. O., Wang, E. MicroRNAs preferentially target the genes with high transcriptional regulation complexity. Biochem Biophys Res Commun. 352, 733-738 (2007).
  8. Yamakuchi, M., Lowenstein, C. J. MiR-34, SIRT1 and p53: the feedback loop. Cell Cycle. 8, 712-715 (2009).
  9. Baer, C., et al. Extensive promoter DNA hypermethylation and hypomethylation is associated with aberrant microRNA expression in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Res. 72, 3775-3785 (2012).
  10. Hazan-Halevy, I., et al. STAT3 is constitutively phosphorylated on serine 727 residues, binds DNA, and activates transcription in CLL cells. Blood. 115, 2852-2863 (2010).
  11. Melo, S. A., et al. A TARBP2 mutation in human cancer impairs microRNA processing and DICER1 function. Nat Genet. 41, 365-370 (2009).
  12. Akira, S. Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice. Stem Cells. 17, 138-146 (1999).
  13. Frank, D. A., Mahajan, S., Ritz, J. B lymphocytes from patients with chronic lymphocytic leukemia contain signal transducer and activator of transcription (STAT) 1 and STAT3 constitutively phosphorylated on serine residues. J Clin Invest. 100, 3140-3148 (1997).
  14. Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 11755-11760 (2004).
  15. Consortium, E. P. A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). PLoS biology. 9, e1001046(2011).
  16. Miranda, K. C., et al. A pattern-based method for the identification of MicroRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes. Cell. 126, 1203-1217 (2006).
  17. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489, 57-74 (2012).
  18. Lau, J. C., Hanel, M. L., Wevrick, R. Tissue-specific and imprinted epigenetic modifications of the human NDN gene. Nucl Acids Res. 32, 3376-3382 (2004).
  19. Corcoran, D. L., et al. Features of mammalian microRNA promoters emerge from polymerase II chromatin immunoprecipitation data. PLoS One. 4, e5279(2009).
  20. Bhattacharyya, M., Feuerbach, L., Bhadra, T., Lengauer, T., Bandyopadhyay, S. MicroRNA transcription start site prediction with multi-objective feature selection. Stat Appl Genet Mol Biol. 11, Article 6 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

H3K4me3ChIPSTAT3
Описание фактора транскрипции зависимая регуляция микроРНК Транскриптом
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.