Здесь мы предлагаем стратегию изучения влияния интересующего фактора транскрипции на транскриптом микроРНК с использованием общедоступных данных, вычислительных ресурсов и высокопроизводительных данных из массивов микроРНК после трансфекции клеток с малой шпилькой (sh)РНК, нацеленной на интересующий фактор транскрипции.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Описание фактора транскрипции зависимая регуляция микроРНК Транскриптом
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В то время как регуляция транскрипции генов, кодирующих белок был хорошо изучен, очень мало известно о том, как факторы транскрипции, принимают участие в транскрипции некодирующих РНК, в частности микроРНК. Здесь мы предлагаем стратегию для изучения потенциальной роли фактора транскрипции в регуляции транскрипции микроРНК с использованием общедоступный данных, вычислительные ресурсы и высокие данные пропускной способности. Мы используем эпигенетическую подпись H3K4me3 для идентификации микроРНК промоторы и иммунопреципитации хроматина (CHIP) данные характерны чередования проекта ENCODE для выявления микроРНК промоутеров, которые обогащены сайтов связывания транскрипционных факторов. Трансфекцией клетки, представляющие интерес с shRNA ориентируетесь на транскрипционный фактор интереса и подвергая клетки к микроРНК массива, мы изучаем влияние этого фактора транскрипции на транскриптома микроРНК. В качестве иллюстративного примера мы используем наше исследование о влиянии STAT3 на микроРНК транскриптома хронического Lymphocytic лейкоз (ХЛЛ) клетки.
Введение
MicroRNAs являются эндогенными малые не кодирующие регуляторные РНК, которые, как правило, функционируют как негативные регуляторы экспрессии мРНК на пост-транскрипционном уровне. Приблизительно 1000 некодирующих от 20 до 25 нуклеотид длинные микроРНК обнаружены в геноме человека 1,2. MicroRNAs регулируют экспрессию генов посредством канонического спаривания оснований между последовательностью семенем микроРНК и ее комплементарной последовательностью соответствия семян, которая обычно расположена в нетранслируемой области 3 '(UTR) мишени мРНК. Все вместе, микроРНК регулируют более 30% протеина генов , кодирующих 3, но только очень мало извес....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Определение фактора транскрипции сайтов связывания в промоторе микроРНК Гены Использование интеллектуального анализа данных подход
- Используйте Калифорнийский университет Санта-Круз (УСК) генома браузер для извлечения данных иммунопреципитация (ЧИП) секвенирования хроматина, сгенерированные в рамках проекта Энциклопедии элементов ДНК (ENCODE).
- Откройте браузер таблицы в геноме браузера УСК.
- Используйте следующие спецификации для извлечения таблицы: клады: (Млекопитающие), геном: (человека), Ассамблея: (Feb2009 (GRch37 / hg18)), группа: (регулирование), дорожки (TxnFactorChIP), таблица: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), область : (Геном), ф....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
STAT3 представляет собой фактор транскрипции , который обычно индуцирует транскрипцию генов , которые обладают противовоспалительными апоптическая и пролиферативные эффекты 12. Является ли STAT3 также влияют на некодирующие РНК транскриптом в настоящее время неизвестно. Во всех ХЛЛ клетках STAT3 является конститутивно фосфорилируется по остаткам серин 707 остатков 10,13. Фосфосерин STAT3 челноки к ядру, связывается с ДНК и активирует гены , как известно, активируетс.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Механизм, лежащий в основе РНК-полимеразы II-зависимую транскрипцию белок-кодирующих генов хорошо изучена. В то время как эти элементы составляют лишь 1% - 2% генома человека, данные из проекта ENCODE предполагают , что более 80% генома человека может подвергаться транскрипцию 17 и что регулирует транскрипцию некодирующих элементов ДНК остается в значительной степени неизвестны 6 ,
Несколько исследований, в которых указано , что Pol II также отвечает за транскрипцию нек.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Это исследование было поддержано грантом Фонда ХЛЛ Global Research. Университет Техаса MD Anderson Cancer Center поддерживается частично Национальным институтом здоровья через онкологический центр поддержки Грант (P30CA16672).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Липофектамин 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| 0,45 м шприцевой фильтр | Thermo Scientific (Nalgene) | 190-2545 | |
| Амикон ультрацентробежный фильтрующий аппарат с порогом 100 kDa | Merck Millipore | ||
| Polybrene | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| TRIzol реагент | Life Tachnologies (Invitrogen) | 15596-026 | |
| 293 Клеточная линия человека | Sigma-Aldrich | 85120602 |
Ссылки
- Bentwich, I., et al. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet. 37, 766-770 (2005).
- Hata, A. Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease. Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).
- Bar....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
