Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Экстракорпоральное анализе измерить фосфатидилэтаноламина метилтрансферазы активность

9.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53302

⸱

5 января 2016 г.

1Department of Biological Sciences, St John's University

В этой статье

Краткое содержание

В настоящем отчете описывается ферментативный анализ in vitro для измерения активности фосфатидилэтаноламинметилтрансферазы с использованием экстрактов клеток Leishmania. Этот анализ основан на переносе радиоактивной метильной группы из S-[Methyl-3H]аденозил-L-метионина на эндогенный фосфатидилэтаноламин.

Аннотация

Фосфатидилэтаноламинметилтрансферазы — это биосинтетические ферменты, которые катализируют перенос одной или нескольких метильных групп с S-аденозил-L-метионина на фосфатидилэтаноламин, монометил-фосфатидилэтаноламин или диметил-фосфатидилэтаноламин с образованием либо монометил-фосфатидилэтаноламина, либо диметил-фосфатидилэтаноламина, либо фосфатидилхолина. Эти ферменты повсеместно присутствуют в клетках животных, грибах, а также содержатся примерно в 10% бактерий. Они выполняют различные важные функции в клеточной физиологии, помимо их непосредственной роли в липидном обмене, такие как резистентность к инсулину, диабет, атеросклероз, рост клеток или вирулентность. В настоящей рукописи представлен простой бесклеточный ферментативный анализ, который измеряет перенос тритиированных метильных групп из S-[Methyl-3H]аденозил-L-метионина на фосфатидилэтаноламин с использованием экстрактов цельных клеток в качестве источника ферментов. Полученные метилированные формы фосфатидилэтаноламинана являются гидрофобными и, таким образом, могут быть отделены от водорастворимого S-[Methyl-3H]аденозил-L-метионина путем органической экстракции. Этот анализ потенциально может быть применен к любым другим типам клеток и использован для тестирования ингибиторов/препаратов, специфичных для представляющей интерес фосфатидилэтаноламинметилтрансферазы без необходимости очистки фермента.

Введение

Фосфатидилэтаноламин метилтрансферазы (PEMT) ферменты катализируют ковалентное присоединение одной или более метильными группами с использованием S -adenosylmethionine (SAM) в качестве донора метильной группы на ПЭ, ПЭ-монометиловый или диметил-PE, чтобы дать монометиловый-PE, диметил-PE и / или фосфатидилхолин (PC). Эти ферменты почти повсеместно в клетках животных и грибов. Они также могут быть найдены в некоторых растений 1 и примерно 10% бактерий, особенно те, которые взаимодействуют с эукариот 2.

PEMTs имеют отношение к биологии клетки не только вклад в производстве ПК, который является основным классом липидов в клетках животных, но также выполняет другие важные клеточные функции. У млекопитающих, в основном PEMTs экспрессируется в печени, где они необходимы для нормального секреции липопротеины очень низкой плотности, и они также способствуют индуцированным диетой ожирением 3, атеросклероз 4, и инсулин сопротивлениеANCE 5. Кроме того, PEMT млекопитающих также выражены в адипоцитах, хотя на более низкие уровни, и участвовать в отложение жира 6, 7. Было также показано, PEMT роль в развитии рака, апоптозе 8 9 и 10 клеточного роста. У бактерий, PEMT ферменты, как было показано, важна для нормального роста клеток 2 вирулентности 2 и симбиозе с растения-хозяина 11.

Цель и обоснование данного протокола является измерение PEMT деятельность с целыми клеточных экстрактов без необходимости очистки фермента. Две различные протоколы были разработаны для измерения PEMT активность. Первый и самый распространенный измеряет передачу тритием метил группы из радиоактивного SAM на ПЭ, которая является темой данной статьи. Этот протокол был изначально разработан для измерения активности PEMT из дрожжей 12 и в клетках млекопитающих (печени) 13, чтобы получить understАндинг ПК биосинтеза в этих клетках, а также для определения специфичности этих ферментов. В дальнейшем этот метод был применен к другим типам клеток, таких как бактерии 2 (с помощью базового значения рН для анализа, хотя 15) и простейшими паразитами 14. Эта методика может быть использована с целым клеточных экстрактов, а также очищенный фермент, и потенциально могут быть применены к любому клеточного экстракта системы. A Non радиоактивных анализ был также разработан, которая опирается на ферментативной количественного S -adenosylhomocysteine, в трансметилирования продукта SAM 16. Последнее анализ может быть более удобно, так как не предполагает радиоактивности, но это подходит только для очищенных ферментов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка экстракт клеток

  1. Выращивают клетки Leishmania в стерильной пластиковой бутылки запечатанной крышкой герметично при 26 ° С в среде из 1x M199 с добавкой 20 мМ HEPES рН 7,4, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 5 мкг / мл гема , 0,35 г / л Naco 2 Н, 0,1 мМ аденина и 2 мкг / мл biopterin без встряхивания. Сбора клеток центрифугированием при 1500 г в течение 5 мин при 4 ° С, когда они достигают плотности клеток 1-2 × 10 7 / мл.
  2. Жидкость над осадком сливают с пипеткой и промыть клетки путем ресуспендирования клеточного осадка с серологическим пипеткой в половине объема культуральной в холодной фосфатным буферным солевым раствором (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na 2 HPO 4, 1,8 мМ KH 2 PO 4, pH 7,4). Утилизировать клеток супернатантов в соответствии с директивами безопасности BL2.
  3. Центрифуга клетки снова при 1500 г в течение 5 мин при 4 ° С. Жидкость над осадком сливают с пипеткой. Действуйте тО следующем шаге или оснастки заморозить осадок клеток в жидком азоте для длительного хранения при -80 ° С (до трех месяцев).
  4. Подготовка 2x буфера для лизиса (0,5 М сахарозы, 0,1 М Трис HCl, рН 7,5, 2 мМ ЭДТА, и ингибитор протеазы коктейль 2x) и держать его в 4 ºC на льду.
  5. Ресуспендируют осадок клеток (свежие или замороженные) в равном объеме 2х буфера для лизиса. Добавить 1x объем стеклянных шариков. Вихревой энергично при 4 ° С в течение 10 мин.
  6. Добавить 2 тома 1x буфера для лизиса и перемешать. Клеточные экстракты центрифуге при 1500 мкг при 4 ° С в течение 10 мин для осаждения клеток и неразрывные ядра.
  7. Передача супернатант с пипеткой в ​​чистую центрифужную пробирку прохладном и держать клеточных экстрактов на льду до завершения эксперимента.

2. Определить концентрация белка клеточной Extract, используя белок Estimation Kit Такие, как бицинхониновой кислоты анализе

  1. Подготовка бицинхониновой кислоты (BCA) раствор (1 мл / пробирка) при смешивании BCA и меди (II) сulfate в соотношении 49: 1 (объем / объем).
  2. Подготовка белка стандарты 0, 10, 20, 30, 40, 50, и 60 мкг / мл разбавлением 10 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) маточного раствора в 1 мл аликвоты раствора BCA.
  3. Добавьте 2 мкл клеток экстрактов в 1 мл раствора БСА в дубликатах. Выдержите стандарты и образцы белка в течение 10 мин в водяной бане подогретого 60 °.
  4. Образцы передачи на лед в течение 3 мин. Измеряют поглощение стандартов и образцов белка с помощью спектрофотометра при длине волны 562 нм.
  5. Рассчитывают концентрации белка в клеточных экстрактах с использованием стандартного BSA в качестве ссылки, как описано в протоколе производителя. Развести клеточных экстрактов до концентрации белка 10 мг / мл лизирующего буфера 1x.

3. Ферментативный анализ в 200 мкл на пробирку

ПРИМЕЧАНИЕ: Carry следующие шаги в химической капотом.

  1. Проверьте каждый образец в двух экземплярах в 15 млконическую трубку. Подготовка 20 мкл 1 М Трис HCl рН 7,5 трубки и держать его на льду. Подготовка 2 мл смеси хлороформ / метанол (1: 1 (объем / объем); стоп-раствора) при КТ в течение каждой пробирке.
  2. Внесите 20 мкл 1 М Трис HCl рН 7,5 в каждой 15 мл коническую трубку на льду.
  3. Соблюдайте рекомендации радиационной безопасности здесь на. Добавить эквивалент 0,06 мкМ (0,2 мкКи) S - [метил- 3 H] аденозил-L-метионина и 50 мкМ холодным SAM за трубки в общей сложности 50,06 мкМ SAM. Добавить х мкл холодной воды, где х = 200- (20 (для буфера) + 20 (для клеточных экстрактов) + объем холодной и радиоактивных SAM) на пробирку.
  4. Передача каждого коническую трубку, чтобы водяной бане подогретого 30 ° C. Добавить в каждую пробирку 20 мкл клеточных экстрактов (эквивалент 200 мкг белка), чтобы начать реакцию. Инкубируют в течение желаемого времени (от 0 до 45 мин).
  5. Остановки реакции добавлением 2 мл смеси хлороформ / метанол (1: 1 об / об; стоп-раствора) в каждую пробирку. Перевести коническую трубку комнатной температуре (20-256; С).

4. Добыча липидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Carry следующие шаги в химической капотом.

  1. Добавить 700 мкл воды в каждую пробирку, содержащую образец ферментативной реакции. Вортексе в течение 30 сек. Центрифуга при 1500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы отделить органический от водной фазы.
  2. Передача нижнюю органическую фазу в новую 15 мл коническую пробирку при помощи пипетки. Добавить 1 мл воды на каждую "фазу" нижней содержащей трубку и вихрь энергично в течение 30 сек. Центрифуга снова в 1500 мкг в течение 5 мин, чтобы отделить органический от водной фазы.
  3. Передача нижнюю органическую фазу в сцинтилляционный трубки с помощью пипетки. Сухие образцы в потоке N 2. Утилизируйте воды фазы, содержащие нон-включены радиоактивные SAM и радиоактивные конические пробирки как за принципов излучения.
  4. Добавить 2 мл / трубки сцинтилляционного жидкости. Измерьте включенной радиоактивности с помощью сцинтилляционного куГюнтер согласно протоколу производителя и использования инструмента.
  5. Рассчитать ферментативной активности в нмоль / мг белка с использованием следующего общего уравнения:
    CPM значение х 10 х 3 [всего (радиоактивные и холодной) Концентрация SAM (мм)] х 5 удельная активность радиоактивных SAM (Ки / ммоль) [х концентрации радиоактивных SAM (мМ)]
    ПРИМЕЧАНИЕ: выше протокол может быть изменен для концентрации SAM зависимой или зависимой белка PEMT анализа. Для концентрации САМ зависимого ферментативного количественного анализа, время остается постоянным (15 мин, что в линейном диапазоне) и различные количества холодной SAM добавляются в анализе, а для белка зависимой PEMT анализа, концентрации SAM (мы выбрали 0,05 мм) и время остаются постоянными (15 мин). Кроме того, рН буфера может быть изменен при необходимости, если некоторые ферменты PEMT иметь различное оптимальное значение рН.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 показана времени зависит PEMT анализа, который проводили с Leishmania экстракта цельноклеточной качестве источника фермента с использованием эндогенной PE в качестве субстрата. Количество радиоактивности в органической фазе количественно с помощью сцинтилляционного счетчика. Полученные цифры были использованы для расчета количества меченного тритием метильных групп переносится на ПЭ. PEMT деятельность была линейной в течение примерно 20 мин. Затем д...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Это просто, быстро PEMT анализ позволяет количественно метилированных форм ПЭ, что приводит от переноса радиоактивных метильных групп из SAM на ПЭ, используя экстракт цельных клеток в качестве источника белка. Это быстро, чувствителен, воспроизводимым, а также подходит для очищенных ферментов 17. Монометил- или диметил-РЕ могут быть добавлены к пробе если метилтрансферазы интерес является специфическим для этих субстратов, а не PE 12,13,18,19. Если используется очищенный фермент PEMT, ПЭ могут быть...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

О столкновении интересов не заявлено

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами NIH ARRA RO3 AI078145 и 1SC3GM113743 для RZ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
S-[Methyl-3H]аденозил-L-метионин (удельная активность 5-15 Ки/моль)Perkin ElmerNET155050UCаликвотировать реагент и заморозить при -20°; C; соблюдать правила радиационной безопасности при использовании этого реагента
коктейля ингибитора протеазыRoche Life Sciences11836170001разбавить его в свежем виде;
Стеклянные бусины, промытые кислотой, 425-600 ммSigma AldrichG8772
Раствор бицинхониновой кислотыSigma AldrichB9643
Сульфат меди (II)Sigma AldrichC2284
Сцинтилляционный счетчик MicroBeta2 с 1-детекторомPerkin Elmer 2450-0010
Спектрофотометр Biomate 3Thermo Scientific840208300
стоковый раствор BSA (10 мг/мл)New England BiolabsB9001S
Сцинтилляционная жидкость Research Product International Corp111198
S-(5'-аденозил)-L-метионин хлорид (гидрохлорид) Cayman Chemicals13956разбавляют реагент в 20 мМ HCl и замораживают аликвоты при -80 °°; С 

Ссылки

  1. Keogh, M. R., Courtney, P. D., Kinney, A. J., Dewey, R. E. Functional characterization of phospholipid N-.methyltransferases from Arabidopsis and soybean. J Biol Chem. 284 (23), 15439-15447 (2009).
  2. Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria. Biochim Biophys Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).
  3. Gao, X., et al. Decreased lipogenesis in white adipose tissue contributes to the resistance to high fat diet-induced obesity in phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase-deficient mice. Biochim Biophys Acta. 1851 (2), 152-162 (2015).
  4. Zhao, Y., et al. Lack of phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase alters plasma VLDL phospholipids and attenuates atherosclerosis in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (9), 1349-1355 (2009).
  5. Vance, D. E. Phospholipid methylation in mammals: from biochemistry to physiological function. Biochim Biophys Acta. 1838 (6), 1477-1487 (2014).
  6. Nishimaki-Mogami, T., Suzuki, K., Takahashi, A. The role of phosphatidylethanolamine methylation in the secretion of very low density lipoproteins by cultured rat hepatocytes: rapid inhibition of phosphatidylethanolamine methylation by bezafibrate increases the density of apolipoprotein B48-containing lipoproteins. Biochim Biophys Acta. 1304 (1), 21-31 (1996).
  7. Noga, A. A., Zhao, Y., Vance, D. E. An unexpected requirement for phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase in the secretion of very low density lipoproteins. J Biol Chem. 277 (44), 42358-42365 (2002).
  8. Li, D., et al. Epigenetic repression of phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase (PEMT) in BRCA1-mutated breast cancer. Oncotarget. 5 (5), 1315-1325 (2014).
  9. Cui, Z., Houweling, M., Vance, D. E. Suppression of rat hepatoma cell growth by expression of phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase-2. J Biol Chem. 269 (40), 24531-24533 (1994).
  10. Cui, Z., Shen, Y. J., Vance, D. E. Inverse correlation between expression of phosphatidylethanolamine.N-.methyltransferase-2 and growth rate of perinatal rat livers. Biochim Biophys Acta. 1346 (1), 10-16 (1997).
  11. Minder, A. C., de Rudder, K. E., Narberhaus, F., Fischer, H. M., Hennecke, H., Geiger, O. Phosphatidylcholine levels in.Bradyrhizobium japonicum. membranes are critical for an efficient symbiosis with the soybean host plant. Mol Microbiol. 39 (5), 1186-1198 (2001).
  12. Kodaki, T., Yamashita, S. Yeast phosphatidylethanolamine methylation pathway. Cloning and characterization of two distinct methyltransferase genes. J Biol Chem. 262 (32), 15428-15435 (1987).
  13. Tanaka, Y., Amano, F., Maeda, M., Nishijima, M., Akamatsu, Y. Purification and properties of phosphatidyl-N-.monomethylethanolamine N-.methyltransferase, the enzyme catalyzing the second and the third steps in the phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase system, from mouse liver microsomes. Jpn J Med Sci Biol. 43 (3), 59-73 (1990).
  14. Bibis, S. S., Dahlstrom, K., Zhu, T., Zufferey, R. Characterization of Leishmania major phosphatidylethanolamine methyltransferases LmjPEM1 and LmjPEM2 and their inhibition by choline analogs. Mol Biochem Parasitol. 196 (2), 90-99 (2014).
  15. deRudder, K. E., Thomas-Oates, J. E., Geiger, O. Rhizobium meliloti. mutants deficient in phospholipid N-.methyltransferase still contain phosphatidylcholine. J Bacteriol. 179 (22), 6921-6928 (1997).
  16. Aktas, M., Narberhaus, F. In vitro characterization of the enzyme properties of the phospholipid N-.methyltransferase PmtA from Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol. 191 (7), 2033-2041 (2009).
  17. Ridgway, N. D., Vance, D. E. Phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase from rat liver. Methods Enzymol. 209, 366-374 (1992).
  18. Gaynor, P. M., Carman, G. M. Phosphatidylethanolamine methyltransferase and phospholipid methyltransferase activities from Saccharomyces cerevisiae. Enzymological and kinetic properties. Biochim Biophys Acta. 1045 (2), 156-163 (1990).
  19. Arondel, V., Benning, C., Somerville, C. R. Isolation and functional expression in Escherichia coli. of a gene encoding phosphatidylethanolamine methyltransferase (EC 2.1.1.17) from Rhodobacter sphaeroides. J Biol Chem. 268 (21), 16002-16008 (1993).
  20. Wessel, M., Klusener, S., Godeke, J., Fritz, C., Hacker, S., Narberhaus, F. Virulence of Agrobacterium tumefaciens. requires phosphatidylcholine in the bacterial membrane. Mol Microbiol. 62 (3), 906-915 (2006).
  21. Klusener, S., Aktas, M., Thormann, K. M., Wessel, M., Narberhaus, F. Expression and physiological relevance of Agrobacterium tumefaciens. phosphatidylcholine biosynthesis genes. J Bacteriol. 191 (1), 365-374 (2009).
  22. Henderson, D. M., et al. Cloning of the gene encoding Leishmania donovani.S.-adenosylhomocysteine hydrolase, a potential target for antiparasitic chemotherapy. Mol Biochem Parasitol. 53 (1-2), 169-183 (1992).
  23. Koszalka, G. W., Krenitsky, T. A. 5'-Methylthioadenosine (MTA) phosphorylase from promastigote of Leishmania donovani. Purine and Pyrimidine Metabolism in Man V, Adv Exp Med Biol. Nyhan, W. L., Thompson, L. F., Watts, R. W. E. 131, Springer US. 559-563 (1986).
  24. Biastoff, S., Teuber, M., Zhou, Z. S., Dräger, B. Colorimetric activity measurement of a recombinant putrescine N.-methyltransferase from Datura stramonium. Planta Med. 72 (12), 1136-1141 (2006).
  25. Hendricks, C. L., Ross, J. R., Pichersky, E., Noel, J. P., Zhou, Z. S. An enzyme-coupled colorimetric assay for S.-adenosylmethionine-dependent methyltransferases. Anal Biochem. 326 (1), 100-105 (2004).
  26. Cannon, L. M., Butler, F. N., Wan, W., Zhou, Z. S. A stereospecific colorimetric assay for (S.,S.)-adenosylmethionine quantification based on thiopurine methyltransferase-catalyzed thiol methylation. Anal Biochem. 308 (2), 358-363 (2002).
  27. Hoffman, J. L. Chromatographic analysis of the chiral and covalent instability of S.-adenosyl-L-methionine. Biochemistry. 25 (15), 4444-4449 (1986).
  28. Wu, S. E., Huskey, W. P., Borchardt, R. T., Schowen, R. L. Chiral instability at sulfur of S.-adenosylmethionine. Biochemistry. 22 (12), 2828-2832 (1983).
  29. Dorgan, K. M., et al. An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for S.-adenosylmethionine-dependent methyltransferases. Anal Biochem. 350 (2), 249-255 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Анализ активности PEMTэкстракт целых клетокперенос тритиевой метильной группыразделение органических фазсцинтилляционный подсчетизмерение концентрации белказависимость от концентрации SAMрасчет ферментативной активностиэкстракт клеток Leishmania
Экстракорпоральное анализе измерить фосфатидилэтаноламина метилтрансферазы активность
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.