В настоящем отчете описывается ферментативный анализ in vitro для измерения активности фосфатидилэтаноламинметилтрансферазы с использованием экстрактов клеток Leishmania. Этот анализ основан на переносе радиоактивной метильной группы из S-[Methyl-3H]аденозил-L-метионина на эндогенный фосфатидилэтаноламин.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Экстракорпоральное анализе измерить фосфатидилэтаноламина метилтрансферазы активность
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Фосфатидилэтаноламинметилтрансферазы — это биосинтетические ферменты, которые катализируют перенос одной или нескольких метильных групп с S-аденозил-L-метионина на фосфатидилэтаноламин, монометил-фосфатидилэтаноламин или диметил-фосфатидилэтаноламин с образованием либо монометил-фосфатидилэтаноламина, либо диметил-фосфатидилэтаноламина, либо фосфатидилхолина. Эти ферменты повсеместно присутствуют в клетках животных, грибах, а также содержатся примерно в 10% бактерий. Они выполняют различные важные функции в клеточной физиологии, помимо их непосредственной роли в липидном обмене, такие как резистентность к инсулину, диабет, атеросклероз, рост клеток или вирулентность. В настоящей рукописи представлен простой бесклеточный ферментативный анализ, который измеряет перенос тритиированных метильных групп из S-[Methyl-3H]аденозил-L-метионина на фосфатидилэтаноламин с использованием экстрактов цельных клеток в качестве источника ферментов. Полученные метилированные формы фосфатидилэтаноламинана являются гидрофобными и, таким образом, могут быть отделены от водорастворимого S-[Methyl-3H]аденозил-L-метионина путем органической экстракции. Этот анализ потенциально может быть применен к любым другим типам клеток и использован для тестирования ингибиторов/препаратов, специфичных для представляющей интерес фосфатидилэтаноламинметилтрансферазы без необходимости очистки фермента.
Введение
Фосфатидилэтаноламин метилтрансферазы (PEMT) ферменты катализируют ковалентное присоединение одной или более метильными группами с использованием S -adenosylmethionine (SAM) в качестве донора метильной группы на ПЭ, ПЭ-монометиловый или диметил-PE, чтобы дать монометиловый-PE, диметил-PE и / или фосфатидилхолин (PC). Эти ферменты почти повсеместно в клетках животных и грибов. Они также могут быть найдены в некоторых растений 1 и примерно 10% бактерий, особенно те, которые взаимодействуют с эукариот 2.
PEMTs имеют отношение к биологии клетки не только вклад в производстве ПК, который является основным классом....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка экстракт клеток
- Выращивают клетки Leishmania в стерильной пластиковой бутылки запечатанной крышкой герметично при 26 ° С в среде из 1x M199 с добавкой 20 мМ HEPES рН 7,4, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 5 мкг / мл гема , 0,35 г / л Naco 2 Н, 0,1 мМ аденина и 2 мкг / мл biopterin без встряхивания. Сбора клеток центрифугированием при 1500 г в течение 5 мин при 4 ° С, когда они достигают плотности клеток 1-2 × 10 7 / мл.
- Жидкость над осадком сливают с пипеткой и промыть клетки путем ресуспендирования клеточного осадка с серологическим пипеткой в половине объема культуральной в холодно....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
На рисунке 1 показана времени зависит PEMT анализа, который проводили с Leishmania экстракта цельноклеточной качестве источника фермента с использованием эндогенной PE в качестве субстрата. Количество радиоактивности в органической фазе количественно с помощью сцинтилляционного счетчика. Полученные цифры были использованы для расчета количества меченного тритием метильных групп переносится на ПЭ. PEMT деятельность была линейной в течение примерно 20 мин. Затем д.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Это просто, быстро PEMT анализ позволяет количественно метилированных форм ПЭ, что приводит от переноса радиоактивных метильных групп из SAM на ПЭ, используя экстракт цельных клеток в качестве источника белка. Это быстро, чувствителен, воспроизводимым, а также подходит для очищенных ферментов 17. Монометил- или диметил-РЕ могут быть добавлены к пробе если метилтрансферазы интерес является специфическим для этих субстратов, а не PE 12,13,18,19. Если используется очищенный фермент PEMT, ПЭ могут быть.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
О столкновении интересов не заявлено
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами NIH ARRA RO3 AI078145 и 1SC3GM113743 для RZ.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| S-[Methyl-3H]аденозил-L-метионин (удельная активность 5-15 Ки/моль) | Perkin Elmer | NET155050UC | аликвотировать реагент и заморозить при -20°; C; соблюдать правила радиационной безопасности при использовании этого реагента |
| коктейля ингибитора протеазы | Roche Life Sciences | 11836170001 | разбавить его в свежем виде; |
| Стеклянные бусины, промытые кислотой, 425-600 мм | Sigma Aldrich | G8772 | |
| Раствор бицинхониновой кислоты | Sigma Aldrich | B9643 | |
| Сульфат меди (II) | Sigma Aldrich | C2284 | |
| Сцинтилляционный счетчик MicroBeta2 с 1-детектором | Perkin Elmer | 2450-0010 | |
| Спектрофотометр Biomate 3 | Thermo Scientific | 840208300 | |
| стоковый раствор BSA (10 мг/мл) | New England Biolabs | B9001S | |
| Сцинтилляционная жидкость | Research Product International Corp | 111198 | |
| S-(5'-аденозил)-L-метионин хлорид (гидрохлорид) | Cayman Chemicals | 13956 | разбавляют реагент в 20 мМ HCl и замораживают аликвоты при -80 °°; С |
Ссылки
- Keogh, M. R., Courtney, P. D., Kinney, A. J., Dewey, R. E. Functional characterization of phospholipid N-.methyltransferases from Arabidopsis and soybean. J Biol Chem. 284 (23), 15439-15447 (2009).
- Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. Phosphatidylcho....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
