Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Воображение нейтрофилов и моноцитов в брыжеечных вен Прижизненное микроскопии на наркотизированных мышей в реальном времени

10.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53314

⸱

16 ноября 2015 г.

 ,  , 
1Department of Pathology and Immunology, University of Geneva

В этой статье

Краткое содержание

Мы подробно описываем протокол мониторинга поведения нейтрофилов и моноцитов в брыжеечных венах в равновесных и воспалительных условиях с использованием прижизненной конфокальной микроскопии на мышах под наркозом.

Аннотация

Эффективное иммунный ответ зависит от быстрой мобилизации лейкоцитов крови к месту инфекции или травмы. Исследуя миграцию лейкоцитов в естественных условиях имеет решающее значение для понимания молекулярной основы лейкоцитов трансэндотелиальной миграции и взаимодействия с сосудистого эндотелия. Один мощный подход предполагает прижизненный микроскопии на трансгенных мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки в клетках интерес.

Здесь мы приводим протокол для визуализации моноцитов и нейтрофилов в CX 3 CR1 GFP / мас мыши IV введенного с оранжевыми красителя помечены нейтрофилов с инверсной конфокальной микроскопии. Покадровой фильмы собрались от 30 мин до нескольких часов визуализации позволяют анализировать поведение лейкоцитов в брыжеечных вен под обеих стационарных и воспалительных состояний. Мы также описать шаги, чтобы побудить локально судно воспаление крови с TLR2 / TLR1 агониста Pam3SK4 и контролировать subsequeнт набор нейтрофилов и моноцитов.

Представленная методика может также использоваться для мониторинга других популяций лейкоцитов и исследовать молекулы, замешанных в лейкоцитов или торговли, используя другие стимулы или трансгенных мышей.

Введение

Нейтрофилов и моноцитов в клетки врожденной иммунной системы, которые непрерывно циркулируют в крови. После травмы или инфекции, воспалительные сигналы вызывают лейкоцитов диапедез в поврежденные и инфицированные ткани, в данном инициирования клеточного иммунного ответа 1-3. Быстрота мобилизации лейкоцитов определяет положительный результат иммунных реакций. Эти сложные процессы зависят от специфических молекул (например, Селектины, эндотелий-хемокинов связаны), присутствующих на воспаленной эндотелия, которые помогают для создания липких контактов между циркулирующих лейкоцитов и эндотелия 1-3 .Чтобы получить представление о молекулах, участвующих в лейкоцитарной кадровое каскада, важно, чтобы визуализировать кинетику набора клеток, а также отслеживать поведение каждой клеточной популяции /. Эффективным методом прижизненной микроскопии включает на трансгенных мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки в клетках, представляющих интерес.

Содержание "> На сегодняшний день, несколько подходов с использованием прижизненной микроскопии были разработаны для изображения сосудистой 4,5. Например, визуализация уха дермы сосудистой или брыжеечных вен прижизненной конфокальной микроскопии был использован для определения поведения патрулирования мышиный Ly6C низких моноцитов и человека CD14 + CD16 тусклым моноциты на стороне просвета кровеносных сосудов в стационарных условиях 6-8. Сосудистая мышиная модель кремастер часто используется для наблюдения за поведением нейтрофилов или воспалительных Ly6C высоких моноцитов при воспалительных или ишемических состояний у трансгенных мышей. В том, что так, кремастер стимулируется с помощью внутримошоночной инъекции IL1β, CCL2, TNFβ или ФМЛФ. После 2-4 часов, затем ткани хирургическим выводили и проанализированы прижизненной конфокальной микроскопии 9-11.

Следующий протокол описывает метод мониторинга моноцитов и нейтрофилов в то же время с любымперевернутый флуоресцентной конфокальной микроскопии. Кроме того, наш метод подробно описано, как изображение и тот же сосуд раньше (стационарный режим) и после воспаления и, как следовать кинетики лейкоцитов. Для этой цели мы используем CX 3 CR1 GFP / вес мыши, чей моноциты экспрессируют EGFP, вводили IV с оранжевым красителем мышиных нейтрофилов помечены. С использованием инвертированного конфокальной микроскопии, можно (1) для отслеживания и анализа патрулирование Ly6C низкие моноциты в стационарных условиях и (2), чтобы следовать набору обоих моноцитов и нейтрофилов в том же сосуде после местного воспаления. Здесь мы создаем воспалительных заболеваний с помощью агониста TLR2 / TLR1 Pam3CSK4 12. Кроме того, такие изображения могут помочь определить роль специфических молекул, представляющих интерес в различных этапах лейкоцитов каскада если осуществляется на определенных нокаут-мышей, или в присутствии блокирующих антител 6,9,13.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры животных были проведены в соответствии с институциональной Комитетом по этике уходу за животными в Женеве, Швейцарии и кантона ветеринарии. Номер разрешения GE / 63/14.

1. Подготовка Единой клеточной суспензии из костного мозга

  1. Жертва мыши (8-12 недель) путем смещения шейных позвонков. Стерилизовать задние ноги с 70% этанола. Удалить кожу от задних ног.
  2. Рассеките из бедра мыши и большеберцовые кости и удалить ткань с ног с помощью скальпеля. Промыть ноги с 90% -ным этанолом и поместить в культуральную чашку, наполненную PBS.
  3. Под капот культуры, чистой ткани из бедра и большеберцовые кости с помощью скальпеля и отдельный на коленном суставе. Отрежьте конец каждого из костей.
  4. Флеш костного мозга от каждой кости с использованием 23G иглу и шприц 1 мл, наполненную подготовки среды (без фенолового красного DMEM / F12, 1% сыворотки крыс), в 50 мл винт трубы. Лишить клеточных агрегатов деликатно пассажей через пе 23GEdle и 1 мл шприца. Доведите общий объем до 25 мл препарата среде.
  5. Центрифуга 250 мкг, 5 мин, 4 ° С. Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок в 1 мл красных кровяных клеток Лизис RBLC буфера (8,3 г NH 4 Cl, 1 г NaHCO 3, 1 мл ЭДТА (100 мМ), полное до 1 л дистиллированной водой, фильтруют 0,22 мкм) в 15 мл винт трубы. Выдержите 30 сек на льду.
  6. Добавить 10 мл препарата среды и центрифуги 250 мкг, 5 мин, 4 ° C. Удалите супернатант и ресуспендируют в 2 мл препарата среде.

2. нейтрофилов Обогащение негативный отбор

  1. Добавить 150 мкл мыши коктейль обогащения нейтрофилов (клеток изоляции комплект платформы, такие как EasySep). Смешайте и инкубировать на льду в течение 10 мин.
  2. Добавьте 10 мл фенола красного свободной DMEM. Инверсия раз и центрифуги 250 мкг, 3 мин, 4 ° С.
  3. Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок в 1,75 мл препарата среды в 5 мл полистирола с круглым дном пробирки. Добавить 250 мкл Биов коктейль Selection. Смешайте и инкубировать на льду в течение 10 мин.
  4. Vortex магнитных частиц (от платформы набор для выделения клеток) в течение 30 сек ресуспендировать частиц. Добавить 500 мкл магнитных частиц в суспензии клеток. Смешайте и инкубировать на льду в течение 10 мин.
  5. Поместите пробирку в магнит. Подождите 3 мин.
  6. Обратить магнит на новый 5 мл полистирола с круглым дном пробирки для сбора нужных немеченые клетки. Не принимайте последнюю каплю висит в трубке. Нежелательных клеток останется в трубке внутри магнита. Откажитесь эту трубку в биологической отходов.
  7. Поместите новую трубку в магнит. Подождите 3 мин.
  8. Обратить магнит на новый 15 мл винт трубы для сбора нужных немеченые клетки. Не принимайте последнюю каплю висит в трубке.
  9. Полный объем до 5 мл с фенолом красным свободного DMEM.

3. Маркировка нейтрофилов

  1. Добавить 0,5 мкл оранжевой краски, такие как сотовый Tracker Orange (работает концентрация1 мкМ, CMRA - хлорметил-rodol-ацетат, акции 10 мМ в ДМСО). Инкубируют 2 мин при 37 ° С.
  2. Добавить 2,5 мл препарата среде. Центрифуга 250 мкг, 5 мин, 4 ° С.
  3. Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок в 1 мл препарата среде в 1,5 мл пробирку.
  4. Возьмите аликвоту рассчитывать с гематоцитометр.
  5. Инкубируйте 5 минут при 37 ° С. Центрифуга 250 мкг, 5 мин, 4 ° С.
  6. Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок в 1 мл PBS. Центрифуга 250 мкг, 5 мин, 4 ° С, чтобы вымыть.
  7. Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок в 10х10 6 клеток в 100 мкл PBS. Держите на льду до внутривенной инъекции. Примечание: клетки должны быть IV вводят как можно быстрее. 6-12x10 6 нейтрофилы / мышь обычно получают.

4. Подготовка Мышь прижизненной микроскопии

Примечание:.. Шаг 4,1) и 4,2) должны быть выполнены в начале эксперимента, чтобы избежать длительного времени ожидания меченых нейтрофилов на IC нае.

  1. Взвесьте CR1 GFP мышь CX 3 (8-12 недель).
  2. Подготовьте 800 мкл анестетиков (кетамин 60 мг / кг, 4,5 ксилазина мг / кг, acepromazone 1,75 мг / кг в PBS).
  3. Обезболить мыши. Инъекцией 200 мкл / 20 г мышь. Управление анестезия пальца щипать и проверки дыхания.
  4. Вводите нейтрофилов (10x10 6 ячеек в 100 мкл PBS) внутривенно, используя боковые вены хвоста или ретро-орбитальной пазухи, в удобное экспериментатора.
  5. Положите мышь на грелку и защищать глаза глазной гель.
  6. Стакан покровное (диаметр 35 мм) помещают в 10 см блюдо культуры ткани, которая имеет 30 мм отверстие диаметром. Использование масла для поддержания блюдо культуры ткани в контакте с покровным.
  7. Надрезать кожи живота с ножницами, чтобы разоблачить брюшины. Надрезать брюшины ножницами, чтобы разоблачить кишечник.
  8. Добавить 200 мкл PBS (предварительно нагревают при 37 ° С) в рeritoneal полости. Возьмите мышь в руке и поверните его лицом вниз, так что кишечник выходит из брюшной полости с нежным давлением. Наведите в культуре ткани блюдо.
  9. Аккуратно deroll кишечник с стерилизованных ватные палочки на покровное для того, чтобы разоблачить сосудов брыжейки.
  10. Вырезать бумажные салфетки в полосах и влажный их 37 ° C нагретого PBS. Остановите кишечник с кусочками бумажных салфеток, чтобы уменьшить движения, вытекающие из перистальтики.
  11. Поставьте блюдо культуры тканей и мышь внутри камеры 37 термостатируемом ° C на заказ стадии трее инвертированного микроскопа. Ввести шприц, содержащий анестетики подкожно в заднюю ногу. Примечание: Кроме того, мышь может получать кислород (0,5 л / мин) с маской.
  12. Управление мышь для анестезии палец щипать и проверки частоты дыхания каждые 30 мин. При необходимости, доставить заряд анестетиков (20 мкл), чтобы должным образом поддерживать анестезию. НЕЕ: Сушка сосудистой следует избегать. Таким образом, его влажность поддерживается регулярно смачивая бумажные салфетки, используемые для иммобилизации кишечника с 37 ° С-подогретое PBS.

5. Измерение нейтрофилов и моноцитов Поведение в воспаленных сосудов в Vivo помощью прижизненной микроскопии

  1. Набор лазеры 488- 561- и по самой низкой мощности, необходимой, чтобы избежать лазерного индуцированных фототоксичность. В наших экспериментах, это меньше, чем 0,5%. Интенсивность GFP в моноцитов и оранжевого красителя в нейтрофилов так ярко, что, как правило, 0,3% достаточно. Примечание: Это представляет собой мощность лазера 0,15 до 0,25 МВт с нашей системы.
  2. Получение изображений по 512 х 512 пикселей (т.е. 635 мкм) в 2,2 сек с открытым отверстием, используя 20X сухой цели инвертированного микроскопа. Используйте Z-глубину от 10 до 20 мкм, что обеспечивает устойчивый сигнал с низким лазерных полномочий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обычно проводят эксперименты с г-глубине между 12 до 1656; м. В случае, представленных фигур и фильмы, Z-глубина 20 мкм. Фазового контраста позволяет идентифицировать эндотелиальных стен и изображений осуществляется на мезентериальных вен. Так, патрулирующие клетки перемещаются довольно медленно со скоростью 5-10 мкм / мин 6, записи поле интереса каждые 20 сек удовлетворительное. С описанных настроек, моторизованная этап позволяет записывать до 7 областях, представляющих интерес в то же время.
  3. Наведите и сосудов брыжейки в термостат камеры микроскопа позволит им оправиться от подготовки в течение 30 мин до приобретения первого фильма. В течение этого времени, выбрать несколько полей, представляющих интерес. Фокус на поверхности просвета сосуда, ближайшей к цели. При необходимости, воспользоваться небольшим автофлуоресценции эндотелия, чтобы установить фокус.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургическое при подготовке мыши слегка подчеркивает эндотелий. Следовательно, прокатки нейтрофилов и/ или моноциты могут наблюдаться в первые 15 мин следующей подготовки мыши.
  4. Запишите первый фильм в течение 30 мин в стационарных условиях, одно изображение каждые 20 сек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение приобретает каждое поле интереса 2.2 сек и моторизованный этап автоматически перемещается из одной области в другую. Она восходит к первой позиции в 20 сек в течение 30 мин записи фильма.
  5. Чтобы инициировать воспаление кровеносных сосудов, добавить каплю 20 мкл PBS, содержащего 100 мкг TLR2 / TLR1 агонистом Pam3CSK4 12 непосредственно на отображаемого сосудов.
  6. Управление фокус для каждой из сфер интересов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время приобретения, всегда есть небольшие изменения фокуса на оси. Несмотря Z-глубины 10-20 мкм, это может привести к снижению интенсивности флуоресценции. Таким образом, вручную переориентировать каждое поле интереса в конце каждого фильма, если это необходимо. Записывайте фильмы за 30 мин периодов и до 3 часов вТаль после начала воспаления.
  7. В конце эксперимента, пожертвовать наркозом мыши цервикальным сдвигом.

6. Формирование файлов фильмов и слежения лейкоцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение Nikon приобретение генерирует .nd2 файлы, но следующая процедура будет похожа с другим программным обеспечением и брендов.

  1. Экспорт файлов в формате TIFF, как серии.
  2. Перейти к ПО ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/~~HEAD=pobj). Импорт серии TIFF. Каждый канал в другой файл.
  3. Нанесите медианный фильтр с радиусом 2.0 пикселя из за зеленого и красного каналов, чтобы уменьшить фоновый шум (процесс> Фильтры> Медиана ...).
  4. Преобразование файлов в двоичный (Process> Binary> Сделать Binary). Включение программного обеспечения для расчета порога для каждого изображения.
  5. Слияние каналов в одной серии изображений (Image> Color> Merge Channels ...). Выберите моноцитов в Greeп канала, нейтрофилы в красном канале и проходящего света в сером канале.
  6. Преобразование сложены изображений в RGB цвета (изображение> Цвет> Стек для RGB).
  7. Сохранить файл как .avi
  8. Данные импортируются и составлен в программном обеспечении Imaris (битовой плоскости). Движения моноцитов и нейтрофилов затем отслеживается с помощью мастера отслеживания пятна.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рукопись описывает оптимизированный протокол легко контролировать поведение моноцитов и нейтрофилов в брыжеечных вен наркозом мышей в режиме реального времени. Использование 37 ° C-термостатированный камеры является обязательным для поддержания температуры мыши, а также из-за зависящей от температуры движения лейкоцитов. Подготовка мыши отображается на рисунке 1. Рисунок 2 показывает всю площадь видел под микроскопом. Проходящий свет позволяет идентифицировать брыжеечных вен (красная ст...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Методологии, описанные в этой рукописи обеспечить последовательный подход, чтобы эффективно изучить моноцитов и нейтрофилов в поведение брыжеечных вен в стационарных и воспалительных состояний.

Решающим шагом в подготовке является иммобилизация кишечника с PBS, контактирующих с тканями. Если выполнены должным образом, мезентериальных сосудов красиво выставлены на покровное для получения изображения. Это позволяет выбрать из нескольких областях, представляющих интерес для мониторинга поведени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана EMBO (для Y.E.), Foundation Machaon (для Y.E.) и SNSF (для B.A.I.). Мы благодарим Bioimaging Core Facility за предоставление микроскопа Nikon A1r и техническую поддержку. Мы благодарим госпожу Клариссу Бартли за исправление английского языка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
5 мл трубки из полистирола с круглым дном Beckton Dickinson352058
10x CFI Plan Apochromat 0.45    DT:4mm Nikon
20x CFI план Apochromat VC 0.75 DT:1мм Трекер для клеток Nikon
Orange CMRA DyeLife TechnologiesC34551
EasySep MagnetStem Cell Technologies18000
EasySep Mouse Neutrophil Enrichment kitStem Cell Technologies19762
EDTASigma AldrichE6758
FCSPAAA15-042
Погружное масло типа АNikonлюбое вязкое масло 
Life Box Система контроля температурыLife Imaging
NaHCO3Sigma AldrichS5761
NH4ClSigma AldrichA9434
Nikon A1R конфокальный микроскопNikonA1R, инвертированный микроскоп, моторизованный x/y/z столик, элементы NIS программное обеспечение
PBSLife TechnologiesD8537
фенол красный свободный DMEM/F12Life Technologies21041-025любая феноловая красная свободная среда подходит
PAM3CSK4Invivogentlrl-pmsrestatus in PBS
Rat serumStem Cell Technologiesвключен в набор EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit
Чашка для культуры тканей 100TPP93100

Ссылки

  1. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
  2. Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).
  3. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41, 694-707 (2014).
  4. Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).
  5. Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).
  6. Auffray, C., et al. Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior. Science. 317, 666-670 (2007).
  7. Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33, 375-386 (2010).
  8. Hanna, R. N., et al. The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes. Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).
  9. Woodfin, A., et al. The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo. Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).
  10. Proebstl, D., et al. Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo. J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).
  11. Wantha, S., et al. Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes. Circ Res. 112, 792-801 (2013).
  12. Ozinsky, A., et al. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).
  13. Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498, 371-375 (2013).
  14. Carlin, L. M., et al. Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal. Cell. 153, 362-375 (2013).
  15. Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. , (2015).
  16. Iqbal, A. J., et al. Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo. Blood. 124, e33-e44 (2014).
  17. Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PloS One. 6, e25109(2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

TLR2 TLR1CX3CR1 GFP
Воображение нейтрофилов и моноцитов в брыжеечных вен Прижизненное микроскопии на наркотизированных мышей в реальном времени
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.