Методическая статья

Использование однозначных сенсиллы запись для обнаружения обоняния нейронных ответов постельных клопов в Semiochemicals

DOI:

10.3791/53337

⸱

18 января 2016 г.

 , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, Auburn University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Постельные клопы полагаются на нейроны обонятельных рецепторов, расположенные в их обонятельной сенсилле усиков, для обнаружения семиохимических веществ в окружающей среде. Используя запись одиночного сенциллума, мы демонстрируем метод оценки реакции постельных клопов на семиохимические вещества и исследуем связанный с этим процесс кодирования.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Насекомое обонятельная система играет важную роль в обнаружении semiochemicals в окружающей среде. В частности, усиков, которые сенсиллы размещения одного или нескольких нейронов внутри, считаются дают основной вклад в ответ на химические раздражители. Непосредственно запись потенциал действия в обонятельной сенсиллы после воздействия раздражителей, один записи сенсиллы (ССР) методика обеспечивает мощный подход для исследования нейронных ответов насекомых к химическим стимулам. Для кровать ошибка, которая является печально известным паразиты человека, несколько типов обонятельной сенсиллы были охарактеризованы. В этом исследовании мы показали, нервные реакции кровать ошибка обонятельного сенсилл двух химических раздражителей и дозозависимое ответов на одного из них, используя метод SSR. Этот подход позволяет исследователям проводить скрининг на раннее отдельных химических раздражителей на кровать ошибка обонятельного сенсилл, которые обеспечивали бы ценную информацию для развитие новых аттрактантов кровать ошибка или репеллентов и выгод усилия управления ошибка кровать.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общая ошибка кровать Cimex lectularius L (Hemiptera: Cimicidae), в качестве временной эктопаразитов, является обязанным кровососущих насекомых, что означает их выживание, развитие, размножение и требуют источников крови от хозяев, в том числе человека и животных 1,2. Хотя передача вируса редко сообщалось в связи с C. lectularius, клев неприятность порождается заражения серьезно влияет хозяев и физически, и психологически 3. Внедрение и широкое использование химических инсектицидов, особенно ДДТ, снижает риск заражения, и к концу 1950-х годов заражения были на таком низком уровне, что они больше не были серьезной проблемой общественного. Тем не менее, число возможных факторов привели к возрождению в популяциях кровать ошибка по всему миру, таких как сокращение использования инсектицидов, снижение информированности общественности, повышение активности путешествия, и развитие резистентности к инсектицидам 4-9.

Химические сигналы в окружающей среде обнаружены и признаны насекомых через органы обоняния, таких как антенны и верхней челюсти щупальца. Обонятельный сенсиллы на насекомых антенн играют решающую роль в обнаружении этих химических реплики. Химические молекулы введите усиков кутикулу через поры на поверхности кутикулы. Одоранта связывания белков в лимфатической усиков связываются с этими химическими молекулами и транспортировать их на пахучих рецепторов 10. Одоранта рецепторы и их корецептором от неселективного канала катионов ионов на мембране нервной, который будет деполяризованном раз этих химических молекул признаны одоранта рецепторов 11.

Одно записи сенсиллы (ССР) был разработан для обнаружения внеклеточный изменение потенциала действия, вызванного применением либо химических или нехимических раздражители. Вставив записи электрод в лимфе и сенсиллы электрода сравненияв какой-то другой части тела насекомого (обычно либо сложных глаз или живота), то скорострельность нейронов в ответ на стимулы, могут быть записаны 12. Изменение количества шипов представляют чувствительность насекомых на специфические стимулы. Химические раздражители различных идентичностей и концентрации вызывают различные будет нейронных ответов, с разной скоростью стрельбы и временных структур, и, следовательно, может быть использован для изучения процесса кодирования насекомого конкретных химических веществ.

Для ошибка общего кровать, оба сексуальные формы и тот же шаблон обонятельной сенсилл на антеннах: девять рифленые колышек С сенсилл, 29 волос, как E (E1 и E2) сенсиллы, и одна пара каждого из Dα, Dβ, Dγ гладкой колышек сенсиллы 13,14. В нескольких нейронов были определены в каждом типе сенсиллы, это не легко отличить потенциалов действия от различных нейронов, размещенных в том же сенсиллы, так и для этом эксперименте TOTAчисло л потенциалов действия были подсчитаны офф-лайн для 500 мс периода до и после стимуляции. Количество потенциалов действия после стимуляции затем вычитается из числа потенциалов действия до стимуляции и умножается на два, чтобы количественно определить изменения в скорости стрельбы в каждой отдельной сенсиллы шипами на второй 15.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка инструментов, стимулов Solutions, и постельных клопов

  1. Готовят 50% -ный раствор KNO 2 (вес / объем) в бутылке 20 мл.
  2. Резкость два вольфрамовых микроэлектродов в КНО раствора 2 при 5 В, неоднократно погружения электродов в вольфрама и из раствора.
    1. Грубо резкость вольфрамовой проволоки путем погружения около 10 мм в вольфрамовой проволоки в и из раствора KNO 2 со скоростью 2 провалов / сек в течение приблизительно 5 мин, которые могут значительно потреблять передний конец вольфрамовой проволоки.
    2. Тонко обострить электрод путем погружения около 1 мм кончика провода в и из раствора со скоростью 2 провалов / сек, по крайней мере 1 мин с тем, чтобы сделать прекрасный и острие электрода. Проверьте диаметр кончика электрода под микроскопом часто, пока не достигнет 0,2-0,5 мкм, которые должны быть достаточно тонкой, чтобы проколоть кутикулу кровать ошибка обонятельного сенсиллы.
      Примечание: В то время как вручную острыйEning электрода, скорость погружение вольфрамовой проволоки в раствор KNO 2 не является постоянным все время. С большим количеством практики, это гораздо легче держать относительно постоянную скорость в заточки электрода. Время заточка также неопределенной зависимости от того, как отлично электрод должен быть. Здесь An конец электрода с диаметром ~ 0,2 мкм достаточен, чтобы проколоть через обонятельный сенсиллы.
  3. Развести каждый из химических раздражителей в диметилсульфоксиде (ДМСО) с аккуратным соединения начальной концентрации 1:10 об / об в качестве исходного раствора. Создание серию разведений декадно зависимости от того, сколько доз, необходимых в эксперименте, вновь ДМСО, от каждого из исходных растворов для каждого химического вещества. Здесь используют 10% (+) - бета-пинен и эвкалиптол.
  4. Поместите голодных или семь дней после подачи взрослых, клопы (мужского или женского пола) от Ft. Дикс колония (подарок от доктора Хейнса в Университете штата Кентукки), которые будут использоваться в тон экспериментировать в чашке Петри.
    Примечание: Там нет точной номер для постельных клопов, помещенных в чашку Петри. Это может быть мало или много.

2. Кровать ошибка Усики Подготовка

  1. Анестезировать ошибки на льду кровать (2-3 мин).
  2. Fix как антенны и тело насекомого на предметное покровного с двухсторонней ленты и снимите ноги с тонкими ножницами.
  3. Используйте маленькую булавку, чтобы мягко коснуться антенны таким образом, чтобы наклеить их на ленте стабильно.
  4. Отдых покровное против маленького шара (~ 1 см в диаметре) стоматологического воска, чтобы облегчить манипуляции и настроить его на нужный угол (~ 90 °) для записи электрода (рис 1).
  5. После защиты разместить кровать ошибка под стерео микроскопом, включите холодного источника света и регулировать интенсивность освещения, пока антенна не будет четко представлена, и сосредоточить микроскоп на второй жгутик антенны кровать ошибка при большом увеличении (720x) ,
    Заметка: Интенсивность освещения, используемого в эксперименте не количественно, что на самом деле зависит от того, как глаза экспериментатора чувствовать интенсивность освещения.

3. Одноместный сенсиллы Запись

  1. Подключите усилитель (10X) с контроллером сбора сигнала, который соединен с компьютером для записи сигнала и визуализации. Включите компьютер и запустите программное обеспечение, например, AutoSpike32 и нажмите режим "Запись" в строке меню. Затем выберите "волна", с тем, чтобы начать запись волновые сигналы.
    Примечание: Плоская линия работает с левой стороны на правую монитора неоднократно сейчас должно быть видно. Здесь окно записи длится 40 сек. Макс записи волна 10 сек. Выбранные частота дискретизации 96000 и цифровой частота дискретизации 240. Существует 0% смещения и нет фильтрации, не устранение для записи сигналов. Все эти настройки параметров в программном обеспечении могут быть изменены по мере необходимости.
  2. Включить громкоговорителя, подключенного к предусилителю, который используется для представления режим тонизирующее для нейрональных ответов усиков сенсиллы.
  3. Вставьте электрод в брюшную полость стабилизированного кровать ошибка.
    Примечание: электрод был проведен металлической подставке магнитно прикреплены к воздушным столом.
  4. После электрод был подключен к брюшной полости кровать ошибка, отойдите записи электрод, который соединен с предусилителя и манипулировать с помощью микроманипулятора, к заднему концу антенны кровать ошибка в.
  5. Когда запись электрод находится в контакте с правой оконечности антенну, включите микроскопом и найти электрод при низком увеличении.
  6. Регулировка регистрирующего электрода при постепенном увеличении увеличение пока оба электрод и усиков сенсиллы находятся в одной плоскости и четко видны под микроскопом.
    Примечание: К этому времени, микроскоп обычнолы при максимальном увеличении.
  7. Вставьте записи электрод в валу сенсиллы использованием микроманипулятора и пойти немного глубже, если фоновый шум является высоким по сравнению с потенциалом действия.
  8. После того, как четкие потенциалы действия наблюдаются от записанного сенсиллы, заполните микропипетку 10% (+) - бета-пинена. Использование микропипетки внести 10 мкл аликвоты 10% (+) - β-пинена на фильтровальной бумаги полосы (~ 3 х 15 мм), расположенной внутри стеклянной пипетки Пастера.
    1. Подключение загружалась пипетки на выходе из потока импульсов трубки контроллера стимула и поместить кончик пипетки в небольшое отверстие в трубке, ориентированной антенны.
  9. Когда все эти соединения стабилизировались, нажмите на педаль контроллера стимула доставить 0,5 сек затяжку стимула (0,5 л / мин) в непрерывном потоке воздуха увлажненной. Запись потенциалов действия будут начаты одновременно, когда footswitcч подавлен. Процесс записи будет длиться 10 сек, начиная с 1 сек до стимуляции.
  10. Граф потенциалы действия офф-лайн в течение двух периодов 500 мс, один до и один после стимуляции. Вычитание любое изменение в скорости шип в течение 500 мс после стимуляции от спонтанной активности, записанной в течение предыдущих 500 мс и конвертировать отсчеты в обычном масштабе шипы / с умножением их на 2.

4. Стимул Замена в ССР

  1. После того, как ножной переключатель был вызван, доставить 10% (+) - бета-пинен в пипетку на кровать ошибка антенн и записывать ответ на этой конкретной одоранта в течение 10 сек, после чего пипеткой удаляют.
  2. Добавьте еще один новый пипетки с 0,001% эвкалиптол быть проверены. Поместите кусочек фильтровальной бумаги, на которой 10 мкл стимула была применена, в новой пипетки.
  3. Подождите 2-5 мин, пока стимул не будет полностью vaporiзет в стеклянной пипетки. Установите пипетку на выходе из потока импульсов трубки.
  4. Вставьте кончик пипетки в маленькое отверстие трубки, ориентированной на антенне. Нажмите на педаль и начать запись 10 сек.
  5. Отключите пипетки и подготовить другой пипетки с 0,01% эвкалиптол.
  6. Проверьте все остальные дозы эвкалиптол (от 0,001% до 10%) на усиков сенсилл соблюдать дозозависимое ответов. Испытание из наиболее разбавить наименее разбавить дозах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одноместный записи сенсиллы является мощным средством расследования используются в исследованиях насекомых химической экологии и нервной физиологии. Исследуя нервные реакции насекомых на различных летучих соединений, особенно тех, считается экологически связанные с выживанием и развитием насекомых, не только дает нам ценную информацию о процессе обоняния насекомых, но также открывает новые перспективные направления, которые потенциально могут привести к развитию новых полезных реагентов ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Техника Одноместный сенсиллы Запись была широко используется в тестировании нервные реакции насекомых, таких как плодовых мушек, комаров и клопов в различных химических раздражителей в окружающей среде. Эти химические стимулы часто растворяют и разбавляют в общем растворителе, чтобы подготовить различные дозы лечения. Тем не менее, различные растворители могут производить различные темпы высвобождения для раздражителей. Предыдущие исследования на некоторых изученных насекомых, таких как дрозофилы, Anopheles...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Проект был поддержан премией AAES 461Hatch/Multistate Grants ALA08-045 и ALA015-1-10026 для N.L.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Вольфрамовая проволокаA-M SYSTEMS#716500Используется для подготовки электрода
KNO2Sigma#310484Используется для заточки вольфрамовой проволоки
AC Power SupplyBK Precision1653AОбеспечение напряжения при заточке вольфрамовой проволоки
Leica Z6 APO МикроскопLeica10447424Используется для наблюдения сенсиллы на антеннах
Контроллер симуляцииSyntechCS-55Используется для управления приложением стимула
4-канальный USB-контроллер сбора данныхSyntechIDAC-4Отображение на экране в режиме реального времени всех сигналов до и во время записи
Источник светаSCHOTTA20500Предоставление источников света для наблюдения
МикромануляторLeica115378Используется при незначительных перемещениях Электрод
ДинамикJuster95aСоединен с контроллером сбора данных IDAC-4 и обеспечивает подачу звука для сигнала
Магнитная стойкаNarishigeGJ-1Используется для удержания электрода сравнения, стабилизирован постельный клоп и трубка подачи стимула
TMC Виброизоляционный стол TMC63-500Используется для изоляции вибрации от оборудования
CoverslipTedpella2225-1Используется для удержания постельного клопа
Двухсторонний скотч3MXT6110Используется для фиксации постельного клопа на покровном зажиме
Стоматологический воскDentakitDK-R012Используется для поддержки покровного зажима в месте стабилизации постельного клопа.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bartonicka, T., Gaisler, J. Seasonal dynamics in the numbers of parasitic bugs (Heteroptera, Cimicidae): a possible cause of roost switching in bats (Chiroptera, Vespertilionidae). Parasitol Res. 100 (6), 1323-1330 (2007).
  2. Thomas, I., Kihiczak, G. G., Schwartz, R. A. Bed bug bites: a review. Int J Dermatol. 43 (6), 430-433 (2004).
  3. Anderson, A. L., Leffler, K. Bed bug infestations in the news: a picture of an emerging public health problem in the United States. J Environ Health. 70 (9), 24-27 (2008).
  4. Boase, C. Bed bugs (Hemiptera: Cimicidae): an evidence-based analysis of the current situation. Sixth international conference on urban pests. OOK-Press Kft. Robinnson, W., Bajomi, D. Budapest, Hungary, , (2008).
  5. Doggett, S. L., Geary, M. J., Russell, R. C. The Resurgence of bed bugs in Australia: with notes on their ecology and control. Environ Health. 4 (2), 30-38 (2004).
  6. Ter Poorten, M. C., Prose, N. S. The return of the common bedbug. Pediatr Dermatol. 22 (3), 183-187 (2005).
  7. Yoon, K. S., Kwon, D. H., Strycharz, J. P., Craig, S., Lee, S. H., Clark, J. M. Biochemical and molecular analysis of deltamethrin resistance in the common bed bug (Hemiptera: Cimicidae). J Med Entomol. 45 (6), 1092-1101 (2008).
  8. Wang, L., Xu, Y., Zeng, L. Resurgence of bed bugs (Hemiptera: Cimicidae) in mainland China. Fla Entomol. 96 (1), 131-136 (2013).
  9. Haynes, K. F., Potter, M. F. Recent progress in bed bug management. Advanced technologies for managing insect pests. Ishaaya, I., Palli, S. R., Horowitz, A. R. , Springer. New York. 269-278 (2013).
  10. Carey, A. F., Carlson, J. R. Insect olfaction from model systems to disease control. Proc Natl Acad Sci. 108 (32), 12987-12995 (2011).
  11. Leal, W. S. Odorant reception in insects: roles of receptors, binding proteins, and degrading enzymes. Annu Rev Entomol. 58, 373-391 (2013).
  12. Den Otter, C. J., Behan, M., Maes, F. W. Single cell response in female Pieris brassicae. (Lepidoptera: Pieridae) to plant volatiles and conspecific egg odours. J Insect Physiol. 26 (7), 465-472 (1980).
  13. Levinson, H. Z., Levinson, A. R., Muller, B., Steinbrecht, R. A. Structural of sensilla, olfactory perception, and behavior of the bed bug, Cimex lectularius., in response to its alarm pheromone. J Insect Physiol. 20 (7), 1231-1248 (1974).
  14. Harraca, V., Ignell, R., Löfstedt, C., Ryne, C. Characterization of the antennal olfactory system of the bed bug (Cimex lectularius). Chem Senses. 35 (3), 195-204 (2010).
  15. Liu, F., Haynes, K. F., Appel, A. G., Liu, N. Antennal olfactory sensilla responses to insect chemical repellents in the common bed bug, Cimex lectularius. J Chem Ecol. 40 (6), 522-533 (2014).
  16. Olson, J. F., Moon, R. D., Kells, S. A., Mesce, K. A. Morphology, ultrastructure and functional role of antennal sensilla in off-host aggregation by the bed bug, Cimex lectularius. Arthropod Struct Dev. 43 (2), 117-122 (2014).
  17. Bruyne, M., Foster, K., Carlson, J. R. Odor coding in the Drosophila antenna. Neuron. 30 (2), 537-552 (2001).
  18. Qiu, Y. T., Loon, J. J. A., Takken, W., Meijerink, J., Smid, H. M. Olfactory coding in antennal neurons of the malaria mosquito, Anopheles gambiae. Chem Senses. 31 (9), 845-863 (2006).
  19. Ghaninia, M., Ignell, R., Hansson, B. S. Functional classification and central nervous projections of olfactory receptor neurons housed in antennal trichoid sensilla of female yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Eur J Neurosci. 26 (6), 1611-1623 (2007).
  20. Hill, S. R., Hanson, B. S., Ignell, R. Characterization of antennal trichoid sensilla from female southern house mosquito, Culex quinquefasciatus Say. Chem Senses. 34 (3), 231-252 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи