Прививка шариков в развивающихся куриных эмбрионов Конечности выявлять пути передачи сигналов, влияющие экспрессии генов

Краткое содержание

Путем прививки бусин, пропитанных факторами роста или специфическими ингибиторами сигнальных путей, в развивающиеся эмбрионы можно напрямую проверить их эффекты in vivo. В этом протоколе бусины прививаются в зачаток конечности для определения влияния этих молекул на экспрессию генов и передачу сигнала.

Аннотация

Использование куриных эмбрионов можно проверить непосредственно эффектами или факторы роста или специфических ингибиторов пути на экспрессию генов и активацией пути передачи сигналов сигнализации. Этот метод позволяет доставку сигнальных молекул на четко определенных этапах развития для конкретных времен. После этого эмбрионы могут быть собраны и изучены экспрессия гена, например, путем гибридизация, или активации путей передачи сигнала с использованием иммунной наблюдаемых.

В этом видео гепарин бисера, пропитанных FGF18 или AG 1-X2 бисера, пропитанных U0126, ингибитора MEK, привиты в зачатках конечностей в яйце. Это показывает, что FGF18 индуцирует экспрессию MyoD и ЭРК фосфорилирования и как эндогенного и FGF18 индуцированной экспрессии MyoD подавляется U0126. Бусы, пропитанные антагониста ретиноевой кислоты может потенцировать индукцию преждевременное MyoD по FGF18.

Этот подход может быть намиред с широким спектром различных факторов роста и ингибиторов и легко адаптировать для других тканей в развивающегося эмбриона.

Введение

Эмбрионов птиц обеспечили мощный инструмент для изучения развития в течение многих лет ^1. Один из их самых полезных характеристик является то, что они относительно легко манипулировать. Внешний разработка позволяет открыть яйцо открыть зародыш и выполнять различные микроманипуляций в том числе такие примеры, как классического перепела-цыпленок химера системы для изучения клеток судьбу ^2,3, инъекции ретровирусов для избыточной экспрессии в определенных тканях в ходе развития ^4,5 и эксплантов культуры, чтобы определить источники развития сигнализации ^6. Совсем недавно химер возникает между немеченых хозяев с трансплантатами из трансгенной линии, экспрессирующей куриного GFP показал, что сочетание классической прививки и генетической модификации может обеспечить важную информацию в развитие ^7,8.

Легкость, с которой птичий эмбрион можно манипулировать сделал его отличным модель для изучения конечностьразвитие ^9. Применение специфических факторов роста для развивающихся конечностей в естественных условиях играет важную роль в выявлении факторов, которые изменяют паттерна конечностей ^10,11 и продолжает оказывать понимание этого процесса ^12. Этот подход был также использован для изучения факторов, которые регулируют развитие мышц и обнаружили роли для многочисленных сигналов, таких как Wnts ¹³ БМП и ¹⁴ HGF ^15.

В последнее время эта техника была использована для исследования сигналов, контролирующих экспрессию генов в миогенную почки конечности и показал, что взаимодействие между FGF18 и ретиноевой кислоты может контролировать сроки MyoD выражения ^16. Используя комбинацию факторов роста и малых молекул, которые могут быть загружены на бусы, а затем непосредственно в привитых определенных тканях в определенных стадиях развития дает возможность вмешаться в практически в любое время и регион в процессе развития. Это была использована для INVEstigate многие процессы, включая сомитов паттерна ^17,18, нервной спецификации ¹⁹ нервного гребня миграции ²⁰ и расширение ²¹ оси.

Здесь мы опишем метод пересадки шарики, смоченные в либо факторов роста или ингибиторов в развитии куриные конечности. Это было использовано, чтобы определить влияние этих сигналов на миогенеза путем анализа экспрессии конкретного гена мышечной с в гибридизация. Опишем трансплантатов с использованием либо гепарином, пропитанной шарики, которые используются для факторов роста, или AG 1-Х2, бусы для малых гидрофобных молекул, таких как ретиноевая кислота или низкомолекулярные ингибиторы специфических сигнальных путей. Однако другие шарики, также доступны, которые были использованы для доставки как FGFs ^{22 и 23} Shh.

Протокол

О себе Этика: Все эти эксперименты следовать уход за животными и этических принципов в Университете Ноттингема.

1. Подготовка гепарина шариков для прививки

1. Вымойте тщательно гепарин шарики в PBS перед использованием. Примечание: бисер можно хранить при температуре 4 ° С в виде суспензии в PBS.
   1. Выберите шарики для прививки, удалив их из запаса с 20 мкл пипетки в капле 1 мл PBS. Затем с помощью микропипетки установлен в 2 мкл передать шарики в каплю 20 мкл PBS в 3 см чашки Петри. Выберите шарики, основанные на размере и, используя стерео микроскоп рассекает, передать выбранные бусы с наконечником пипетки Р2; те, около 100 мкм диаметр идеально.
2. Снимите PBS из бисера. Удалить большую часть жидкости с 20 мкл пипетки и остаточной жидкости под действием капиллярных сил с тонкой часовщиков щипцы. Примечание: Важно, чтобы удалить как можно больше, чтобы рост фактоR не разбавляют при добавлении к гранулам.
3. Внесите фактор роста непосредственно на шарики. Для добавления FGF18 0,5 мкл рекомбинантного FGF18 восстановленного в 0,5 мг / мл в 0,1% БСА в PBS. Место несколько капель воды вокруг краев тарелки, чтобы предотвратить испарение жидкости.
4. Инкубируйте бусины в течение 1 часа при комнатной температуре. Удалить капли воды из сосуда с помощью пипетки Пастера и поместите на лед готов для пересадки.
5. При необходимости (для прозрачных бусин) передача 4-5 бусы до 2% фенола красного, прежде чем прививки, чтобы помочь визуализировать их. Полоскание в PBS до передачи эмбриона.

2. Подготовка AG 1-X2 шариков для прививки

1. Перед использованием дериватизации шарики 0,2 н муравьиной кислотой.
   1. Для этого используйте лопаточку, чтобы передать бисером 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Добавить 1 мл 0,2 N муравьиной кислоты и мыть на качалке платформы в течение 1 часа.
   2. Затем снимите муравьиной кислоты с P1000 пипетки и заменить 1мл воды. Промыть в течение 1 ч и повторить шесть раз, чтобы удалить остатки муравьиной кислоты.
   3. Удалить оставшуюся жидкость с P1000 пипетки и хранить шарики при 4 ° С. Примечание: Это не нужно, чтобы удалить все остатки воды на этом этапе.
2. Удалить небольшой шарик шариков примерно 5-10 мкл объем со склада с помощью небольшого шпателя в 3 см чашки Петри и добавить 1 мл ДМСО (в зависимости от того или растворитель препарата растворяют в). Примечание: Это должно обеспечить несколько сотен шарики, из которых, чтобы выбрать те, нужного размера.
3. Затем используйте P2 пипетки набор 2 мкл передать шарики примерно 100 мкм диаметром до капли 20 мкл растворителя в другой 3 см чашке Петри.
4. Растворитель удаляют с 20 мкл пипетки и любой остаточный растворитель с 2 мкл пипетки. Замените 20 мкл препарата следует применять.
   Примечание: для последовательности растворения лекарственного средства в концентрации 100 мкМ в ДМСО (или которые используют либо растворителем),аликвоту в 20 мкл и хранить при температуре -80 ° С в некоторых низкомолекулярные ингибиторы являются неустойчивыми, и это лучше, чтобы избежать повторного замораживания-оттаивания. При необходимости затем разбавить препарат до желаемой концентрации перед замачивания шарики. Эффективные концентрации могут должны быть определены эмпирически для каждого препарата.
5. Инкубировать в течение 1 часа. Защищать от света, как многие из этих молекул чувствительна к свету.
6. Перед прививкой трансфер 4-5 бусы с p2 пипетки, установленным в 2 мкл в 20 мкл 2% фенола красного, растворенных в воде. Выполните этот шаг, используя стерео микроскоп рассекает визуализировать бисером. Удалить один шарик с тонкой часовщиков щипцы или проволочную петлю и промыть в PBS до передачи эмбриона. Не оставляйте шарики в 2% фенола красного для более чем на 15 мин перед использованием, так как это может привести к потере активности.

3. Подготовка вольфрама Иглы

1. Нарезать мелкими вольфрамовой проволоки в 3-4 см длины. Вставьте один кусок проволоки в концестакан пипетки Пастера и расплавить в горелку, чтобы исправить на месте. Подготовка до 10 игл для того, чтобы есть запасные, если они повреждены во время использования.
2. Поместите конец провода в паяльную лампу пламени и удерживайте ее там, пока не вольфрама светится белым, а кончик острый (около 2-3 мин). Примечание: При использовании иглы можно очищать и повторно заточены в паяльной лампы по мере необходимости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти иглы также может быть использован, чтобы сделать петли для передачи бусы. Осторожно коснитесь иглу на скамейку, и он будет сгибаться, образуя петлю.

4. Подготовка эмбрионов для бисера трансплантатов

1. Выдержите яйца с тупого конца, пока они не достигнут желаемого этап (3-5 дней для большинства почки конечности манипуляций). Использование тупой щипцы кран на тупом конце, чтобы разбить скорлупу, а затем использовать пинцет, чтобы удалить оболочку и подвергать эмбрион. Убедитесь, что мембрана яичной скорлупы удаляется также.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 1-2 мл PBS могут быть добавлены с пипетки Пастера, чтобы помочь сэто, если мембрана прилипает к желтка. Аккуратно пипетки PBS на поверхности желтка, понять мембрану с пинцетом, стараясь не повредить желток, и аккуратно выньте ее от яйца.
2. Удалить до 5 мл белка из яйца с 10 мл шприца и иглы 19 G. Возьмите столько, сколько нужно, чтобы обеспечить эмбрион не вступать в контакт с лентой, используемой для герметизации яйцо как удаление больших объемов может уменьшить выживаемость эмбрионов.
3. Для визуализации эмбрион добавить 5-6 капель художников тушь 15 мл PBS, содержащим 100 Е пенициллина и 0,1 мг стрептомицина / мл. Вводят 0.5-1 мл непосредственно под эмбриона с 1 мл шприца и иглы 25 G.
4. Добавьте 2-3 мл PBS с 1% фетальной телячьей сыворотки и 100 ед пенициллина и стрептомицина 0,1 мг / мл в яйцо, чтобы обеспечить эмбрион не дегидратации. Использование заточенные часовщиков щипцы удалить желточный мембрану и открыть амнион над развивающихся зачатках конечностей. Убедитесь, что эмбрион не высыхают иПри необходимости, добавить еще PBS / FCS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: почки конечностей может быть хорошо видно, как парных выростов на фланге эмбриона. На этих стадиях эмбрион превратится такие правая обычно верхний. В результате, как правило, легче привить шарики в правых конечностях и использовать левые контралатеральную управления.
5. Используйте заостренный вольфрамовой проволоки, чтобы сделать разрез в зачатках конечностей, где шарик будет имплантирован. Избегайте резки всю дорогу через почки конечности, где возможно, хотя у младших стадиях это трудно.
   Примечание: В старых эмбрионов (HH стадии 22 и выше) можно выбрать определенные участки почки конечности для прививки, но в более раннем этапе, это труднее, поскольку почки конечности сама мала. Важно также помнить, что почки конечности вырастет мимо валика привитого, так, особенно в младших стадий, шарик будет оставаться в проксимальной конечности.
6. Возьмите шарик из любой фактор роста или лекарства, используя либо дополнительный штраф ваtchmakers щипцы или петля изготовлена ​​из вольфрамовой иглы. Если шарик, смоченной в любом ДМСО или фенола красного, промыть в PBS до обращения в зародыше. Передача шарик эмбриона с щипцов / проволочной петлей. Затем используйте заостренный вольфрамовой проволоки, чтобы вставить шарик в разрез.
7. Добавить 1-2 мл PBS / FCS в яйце гарантируя, что эмбрион хранится увлажненной, но избежать применения непосредственно на самой эмбриона, так как это может привести к повреждению эмбрионов и вызвать шарик быть смещены. Печать яйцо с лентой и вернуться в инкубатор.

Результаты

В HH стадии 21 MyoD не выражается в развитии конечностей миобластов хотя окрашивание можно увидеть в миотом развивающихся сомитов (рис 1а). Рисунок 1B показывает в гибридизация для MyoD 6 ч после проведения FGF18 борта трансплантата. MyoD индуцируется в миобластов, близких к борта, а нет выражение в контралатеральной конечности. Со прививки шарик, пропитанный в U0126, специфический ингибитор МЕК, блоки FGF18 индукции MyoD (рис 1С). Аналогично привитой U0126 шар...

Обсуждение

Использование бортовых трансплантатов, применяемых непосредственно к разработке тканей в яйце является мощным инструментом для анализировать роль сигнализации фактора роста во время развития дает беспрецедентный контроль над стадии развития, на которой они применяются и продолжительности воздействия.

Выбор валика для каждого типа молекулы важно. Небольшие гидрофобные молекулы, такие как ингибиторы, описанные здесь и ретиноевой кислоты, как правило, связывают с дериватизированный хорошо AG 1-...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Гепариновые акриловые бусины	Sigma	H5263	Использованные акрил-гепариновые бусины сняты с производства. Тем не менее, доступен продукт на замену, агарозные бусины гепарина, номер кошки H6508. Они прозрачные, поэтому с ними сложнее работать, но их можно окрашивать феноловым красным таким же образом, как и бусины AG 1-X2,
бусины AG 1-X2	Bio-Rad	140-1231
Affi Gel синие бусины	Bio-Rad	153-7301; 153-7302	Эти бусины использовались с рядом факторов роста, включая Shh и FGF, и могут использоваться для замены гепариновых бусин
FGF18	Peprotech	100-28	Повторно суспендируйте в PBS с 0/1% BSA, приготовьте одноразовые аликвоты 0,5-1 мкл и храните при -80°C. Партии и поставщики могут варьироваться, поэтому для определения эффективной дозы следует тестировать разные концентрации.
U0126	Сотовая сигнализация	9903	Изготавливайте до 20 мМ в ДМСО и храните в одноразовых аликвотах при температуре -80°C. Беречь от света.
BMS-493	Tocris Biosciences	3509	Ресуспендировать в ДМСО и хранить в одноразовых аликвотах при -80°C. Беречь от света.
Черные индийские чернила	Windsor and Newton	5012572003384 (30 мл)Хотя	доступны альтернативы этому продукту, следует соблюдать осторожность, так как некоторые чернила токсичны для эмбрионов
Вольфрамовая проволока, диаметр 0,1 мм 99,95%	Альфа Аэсар	10404
Пенициллин / стрептомицин	Sigma	P0781	Разбавить в 100X PBS/чернила и PBS/FCS