Методическая статья

Измерение Вложений и интернализации вируса гриппа в клетках А549 методом проточной цитометрии

DOI:

10.3791/53372

⸱

4 ноября 2015 г.

 , 
1Institute of Medical Virology, University of Zurich

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем протокол, описывающий полуколичественный метод измерения как прикрепления вируса гриппа А к клеткам A549, так и интернализации вирусных частиц в клетки-мишени с помощью проточной цитометрии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Прикрепление к клеткам-мишеням с последующей интернализацией является самым первым шагом в жизненном цикле вируса гриппа А (IAV). Здесь мы приводим подробный протокол измерения относительных изменений в количестве вирусных частиц, которые прикрепляются к клеткам A549, эпителиальной клеточной линии легких человека, а также в количестве частиц, которые интернализуются в клетку. Мы используем биотинилированный вирус, который легко обнаруживается после окрашивания стрептавидином, меченным Cy3 (STV-Cy3). Мы описываем выращивание, очистку и биотинилирование A/WSN/33, широко используемого лабораторного штамма IAV. Холодносвязанные биотинилированные частицы IAV на клетках A549 окрашивают STV-Cy3 и измеряют с помощью проточной цитометрии. Чтобы исследовать поглощение вирусных частиц, вирусу, связанному с холодом, позволяют интернализироваться при 37 °C. Для того чтобы дифференцировать внешние и внутренние вирусные частицы, применяется этап блокирования: свободные пятна связывания на биотине прикрепленного вируса на поверхности клетки связываются с немеченым стрептавидином (STV). Последующая пермеабилизация клеток и окрашивание STV-Cy3 позволяет обнаруживать внутренние вирусные частицы. Мы представляем расчет для определения относительного количества интернализованного вируса. Этот анализ подходит для измерения влияния медикаментозного лечения или других манипуляций на прикрепление или усвоение IAV.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вступление вируса гриппа А (ИФО) является многоступенчатый процесс, который начинается с связывание вируса с рецепторами на плазматической мембране клеток-мишеней 1. Рецептор IAV является сиаловой кислоты который присутствует на большом разнообразии гликопротеинов и гликолипидов. Гемагглютинина (HA), белок IAV который присутствует в вирусной оболочке связывается с сиаловой кислотой и тем самым опосредует прикрепление вирусных частиц в плазменной мембране клеток-мишеней 2. Вирус проникает в клетки через клатрин эндоцитоза, но и альтернативные пути доступа, такие, как макропиноцитозом, были описаны 3-6. Взаимодействие между НА и сиалово....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание Перед запуском: капот использования ламинарного потока и соответствующего биоизоляции при работе с живым вирусом. Здесь мы опишем условия, подходящие для роста вируса гриппа штамма культуры A / WSN / 33. Множественность заражения (МВД) и инкубации раз могут варьироваться в зависимости от штамма вируса, используемого.

1. Получение биотинилированных A / WSN / 33 вируса

  1. Клетки в T175 см 2 с использованием колбу Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина (Pen / Strep) Семя Madin Darby собак-kindey (MDCK). Культуры клеток при 37 ° С до приблизительно 70% слияния буд....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мультфильм описания четырех различных экспериментальных условиях показано на рисунке 1 Результаты типичного эксперимента представлены на рисунках 2 -. 5. В "0" образец мин, биотинилированный вирус холодной связаны с клетками-мишенями, которые могут быть визуализированы с помощью окрашивания СТВ-Cy3 (фиг.1 и 2). Когда блокирующий шаг (в "0 мин + STV" образца) применяется, вирус на поверхности клеток больше не может быть .......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наш протокол описывает простой способ измерения вложение вирусов и интернализации с помощью проточной цитометрии. Это позволяет использование меченых вирус, который имитирует более близко вирусные инфекции по сравнению с использованием вирусоподобных частиц (VLP) дикого типа. В то время как наш протокол был оптимизирован для измерения привязанность и интернализации IAV он может быть легко адаптированы для других вирусов. Кроме того, как проточной цитометрии используется для считывания, со-окрашивание могут быть легко до.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом Швейцарского национального научного фонда (31003A_135278) к SST. СС является бенефициаром докторской гранта Фонда исследований AXA. Мы благодарим Патриция Нигг за помощь в оформлении рисунке 1.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEMLife Technologies41966-052
FBSLife Technologies10270-106
Пенициллин-стрептомицинLife Technologies15140-163
PBS Life Technologies14190-169   
BSAVWR Calbiochem126579
HEPESLife Technologies15630-100
D-SucroseFluka84100
TRISBiosolve BV20092391
EDTASigma-Aldrich3680
EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kitFisher ScientificW9971E 
Bio Rad Protein Bio AssayBio Rad500-0006
глубокоскважинные пробирки (1,2 мл микропробирки)Milian82 00 001
PFA  Lucerna chem  Электронная микроскопия науки15710
ультрацентрифужные пробиркиHemotec HmbH253070
Triton X-100Fluka93420
STV-Cy3Life Technologies43-4315
STVLife Technologies43-4302
азид натрияFluka71290
бактериальная нейраминидаза/ сиалидазаСигма-ОлдричN6514-1УН

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets. J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).
  2. Palese, P., Shaw, M. L. Fields Virolog. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
  3. Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи