Мы представляем протокол, описывающий полуколичественный метод измерения как прикрепления вируса гриппа А к клеткам A549, так и интернализации вирусных частиц в клетки-мишени с помощью проточной цитометрии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Измерение Вложений и интернализации вируса гриппа в клетках А549 методом проточной цитометрии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Прикрепление к клеткам-мишеням с последующей интернализацией является самым первым шагом в жизненном цикле вируса гриппа А (IAV). Здесь мы приводим подробный протокол измерения относительных изменений в количестве вирусных частиц, которые прикрепляются к клеткам A549, эпителиальной клеточной линии легких человека, а также в количестве частиц, которые интернализуются в клетку. Мы используем биотинилированный вирус, который легко обнаруживается после окрашивания стрептавидином, меченным Cy3 (STV-Cy3). Мы описываем выращивание, очистку и биотинилирование A/WSN/33, широко используемого лабораторного штамма IAV. Холодносвязанные биотинилированные частицы IAV на клетках A549 окрашивают STV-Cy3 и измеряют с помощью проточной цитометрии. Чтобы исследовать поглощение вирусных частиц, вирусу, связанному с холодом, позволяют интернализироваться при 37 °C. Для того чтобы дифференцировать внешние и внутренние вирусные частицы, применяется этап блокирования: свободные пятна связывания на биотине прикрепленного вируса на поверхности клетки связываются с немеченым стрептавидином (STV). Последующая пермеабилизация клеток и окрашивание STV-Cy3 позволяет обнаруживать внутренние вирусные частицы. Мы представляем расчет для определения относительного количества интернализованного вируса. Этот анализ подходит для измерения влияния медикаментозного лечения или других манипуляций на прикрепление или усвоение IAV.
Введение
Вступление вируса гриппа А (ИФО) является многоступенчатый процесс, который начинается с связывание вируса с рецепторами на плазматической мембране клеток-мишеней 1. Рецептор IAV является сиаловой кислоты который присутствует на большом разнообразии гликопротеинов и гликолипидов. Гемагглютинина (HA), белок IAV который присутствует в вирусной оболочке связывается с сиаловой кислотой и тем самым опосредует прикрепление вирусных частиц в плазменной мембране клеток-мишеней 2. Вирус проникает в клетки через клатрин эндоцитоза, но и альтернативные пути доступа, такие, как макропиноцитозом, были описаны 3-6. Взаимодействие между НА и сиалово....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Примечание Перед запуском: капот использования ламинарного потока и соответствующего биоизоляции при работе с живым вирусом. Здесь мы опишем условия, подходящие для роста вируса гриппа штамма культуры A / WSN / 33. Множественность заражения (МВД) и инкубации раз могут варьироваться в зависимости от штамма вируса, используемого.
1. Получение биотинилированных A / WSN / 33 вируса
- Клетки в T175 см 2 с использованием колбу Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина (Pen / Strep) Семя Madin Darby собак-kindey (MDCK). Культуры клеток при 37 ° С до приблизительно 70% слияния буд....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мультфильм описания четырех различных экспериментальных условиях показано на рисунке 1 Результаты типичного эксперимента представлены на рисунках 2 -. 5. В "0" образец мин, биотинилированный вирус холодной связаны с клетками-мишенями, которые могут быть визуализированы с помощью окрашивания СТВ-Cy3 (фиг.1 и 2). Когда блокирующий шаг (в "0 мин + STV" образца) применяется, вирус на поверхности клеток б.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Наш протокол описывает простой способ измерения вложение вирусов и интернализации с помощью проточной цитометрии. Это позволяет использование меченых вирус, который имитирует более близко вирусные инфекции по сравнению с использованием вирусоподобных частиц (VLP) дикого типа. В то время как наш протокол был оптимизирован для измерения привязанность и интернализации IAV он может быть легко адаптированы для других вирусов. Кроме того, как проточной цитометрии используется для считывания, со-окрашивание могут быть легко до.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом Швейцарского национального научного фонда (31003A_135278) к SST. СС является бенефициаром докторской гранта Фонда исследований AXA. Мы благодарим Патриция Нигг за помощь в оформлении рисунке 1.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life Technologies | 41966-052 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Пенициллин-стрептомицин | Life Technologies | 15140-163 | |
| PBS Life Technologies | 14190-169 | ||
| BSA | VWR Calbiochem | 126579 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-100 | |
| D-Sucrose | Fluka | 84100 | |
| TRIS | Biosolve BV | 20092391 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3680 | |
| EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit | Fisher Scientific | W9971E | |
| Bio Rad Protein Bio Assay | Bio Rad | 500-0006 | |
| глубокоскважинные пробирки (1,2 мл микропробирки) | Milian | 82 00 001 | |
| PFA | Lucerna chem Электронная микроскопия науки | 15710 | |
| ультрацентрифужные пробирки | Hemotec HmbH | 253070 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93420 | |
| STV-Cy3 | Life Technologies | 43-4315 | |
| STV | Life Technologies | 43-4302 | |
| азид натрия | Fluka | 71290 | |
| бактериальная нейраминидаза/ сиалидаза | Сигма-Олдрич | N6514-1УН |
Ссылки
- Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets. J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).
- Palese, P., Shaw, M. L. Fields Virolog. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
- Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
