Мембранные процессы переноса анализироваться Высококвалифицированные параллельной системы нанопор чип Разрешение одного белка

Summary

Представленный протокол описывает анализ опосредованного мембранным белком транспорта на уровне одного транспортера с использованием бислоев, не содержащих растворителей, охватывающих поры. Это достигается за счет создания массивных нанопоровых чипов массового производства в сочетании со сбором и анализом данных с высокой степенью параллельного развития, что позволяет в будущем проводить скрининг эффекторов мембранных белков.

Abstract

Мембранного белка транспорта на одном уровне белка все еще уклоняется детальный анализ, если субстрат транслоцируются не является электрогенный. Значительные усилия были предприняты в этой области, но методы, позволяющие автоматизированный анализ высокой пропускной способностью транспорта в сочетании с не содержащих растворителей методами двухслойных липидов, необходимых для анализа мембранных транспортеров являются редкими. Этот класс транспортеров однако имеет решающее значение в ячейке гомеостаза и, следовательно, ключевой целью в разработке и методологий, чтобы получить новое понимание наркотиков крайне необходимо.

Здесь представлена ​​рукопись описывает создание и обработку нового биочипа для анализа процессов переноса белковых опосредованной мембраны при одной резолюции переносчика. Биочипа состоит из микрорезонаторах приложенных нанопор, что чрезвычайно параллельный в своей конструкции и могут быть произведены в промышленном сортности и количестве. Белково-укрывает Липосомы могут непосредственно применяться кчип поверхность формирования самоорганизующихся пор остовного бислоев с использованием ССМ-методов (твердый поддерживается липидные мембраны). Поры остовного части мембраны отдельно стоящая, обеспечивая интерфейс для транслокации субстрата в или из пространства полости, что может сопровождаться мультиспектрального флуоресцентного считывания в режиме реального времени. Создание стандартных операционных процедур (СОП) позволяет прямое создание белка-укрывает липидного бислоя на поверхности чипа практически каждого мембранного белка, который может быть восстановленным функционально. Единственным условием является создание люминесцентной системы считыванием для не электрогенных транспортных субстратов.

высокопроизводительных приложений содержание скрининга осуществимы за счет использования автоматизированных перевернутых флуоресцентных микроскопов записи нескольких чипов параллельно. Большие наборы данных могут быть проанализированы с помощью свободно доступных специально разработанный программного обеспечения для анализа. Трехцветный мульти спектральная люминесцентнаясчитывание, кроме того, позволяет непредвзято дискриминации данных на различные классы событий, исключая ложные положительные результаты.

Технологии чипа в настоящее время базируется на SiO ₂ поверхностях, но дополнительно функционализации с использованием поверхности чипа с золотым покрытием также возможно.

Introduction

Анализ мембранных белков стал повышенный интерес к основной и фармацевтических исследований в течение последних 20 лет. Разработка новых лекарственных средств зависит от идентификации и детальной характеристики новых целей, в настоящее время является одним из факторов, ограничивающих. Тот факт , что около 60% всех лекарственных мишеней являются мембранными белками , ^1, делает разработку методов для выяснения их функции наиболее важной.

В прошлом, методы для изучения электрогенных каналов и транспортеров, были разработаны во множестве ^{2 - 4.} Non-электрогенных субстратов в наоборот представляют со....

Protocol

1. Подготовка Большой однослойные везикулы (БУВ)

1. Очистите круглодонную колбу (объем 10 мл) с газообразным азотом, чтобы удалить любые частицы пыли. Промойте круглодонную колбу с этанолом.
   Примечание: Остаточный этанол может быть допущено и не нарушает последующие шаги.
2. Промыть 1 мл стеклянный шприц 4 раза хлороформом, чтобы удалить любые загрязнения. Добавляют 4 SoyPC20 мл (25 мг / мл в хлороформе), в круглодонную колбу и легирование липидного раствора с дополнительным DOPE ^{ATTO 390} до конечной концентрации 0,1% мол.
   Примечание: вместо DOPE ^{ATTO 390} других флуорофоров меченных липидов или ....

Results

Поры остовного мембраны могут быть легко созданы на поверхности наноструктурированного стружки в самоорганизующейся образом. Однако основной процесс по-прежнему тонкий и зависит от многих параметров, таких как размер липосом, монодисперсности липосомной населения, ламеллярности, липид и солевыми концентрации и химических поверхностных свойств. Большинство из этих параметров были тщательно охарактеризованы и стандартизованы в вышеприведенном протоколе. Другие параметры, однако, должны быт.......

Discussion

Методика представлена ​​здесь позволяет высокопараллельной анализ мембранного транспорта белков. Восстановленные системы мембранного белка может быть непосредственно применен к биочипа, что делает приспособлении теоретически каждый мембранный переносчик или канал, это возможно. Анализ транспорта ограничивается только установлением люминесцентной системы считыванием, либо путем прямого изменения флуоресценции (транслокации флуорофоров или флуоресцентно меченых субстратов) или косвенное изменение флуоресценции (рН-чувстви.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<сильный>реагент
2-(триметиламмоний)этил] метантиосульфонат	Toronto Research Chemicals Inc.	T792900	MTSET; гидролизуется водой. Хранить в сухом виде при температуре -80 °C. Использовать немедленно (30 минут) после растворения в буфере.
Газонепроницаемый шприц 1 мл	Hamilton	#1001
10 мл круглая колба	Schott Duran
2,7 мм стеклянные бусины	Roth	N032.1
2-Propanole	Roth	9866.5
30 см Удлинительная трубка Luer-Lock	Sarstedt	744304
ацетоном	Roth	5025.5
Bio-Beads SM-2 Адсорбент	Bio-Rad	152-3920	необходимо активировать перед первым использованием
CaCl2 Dihydrat	Roth	HN04.3
Кальцеин	Sigma	C0875	хранить в темноте при -20 °°; C
Реагент хлороформа марки	VWR Chemicals	22711324
DOPEATTO390	ATTO-TEC	AD 390-165	хранить темным при -20 °°; C
Этанол абсолютный	Sigma-Aldrich	32205
Injekt Одноразовый шприц	Braun	460 60 51V
Injekt-F одноразовый шприц	Braun	91 66 017V
Keck clips	Schott	KC29
L-α-фосфатидилхолин, 20% (соя)	Avanti Полярные липиды	5416016	хранить в инертном газе при -20 °°; C
NaCl 99,5% годовых	Roth	3957.2
Nanopore E100 пластина/чип	Micromotive (Майнц/Германия)		доступно по запросу
Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 µ m	Ватман	800282
Орегон Грин Декстран 488 (70 кДа)	life Technologies	D-7173	магазин темный при -20 градусов; C
Oy647	Luminartis (Mü nster/Germany)	OY-647-T-1mg	хранить в темноте при температуре -20 °°; C
Ротилабо-шприцевая фильтрация, нестерильная, размер пор 0,22 и микро; m	Roth	P 818.1
Sephadex G-50	Sigma-Aldrich	G5080	материал колонки для эксклюзионной хроматографии
Silastic MDX4-4210	Dow Corning		отвердитель для фиксации чипа на опоре покровного стекла
липкий-Slide 8-луночный	ibidi	80828	многолуночная камера для монтажа на предметные стекла (чиподержатель)
Трехсторонний запорный кран синий	Sarstedt	744410001
Tris Pufferan 99,9% Ultra Quality Roth		5429.2
Triton-X 100	Roth	6683.1
Whatman 0.2 &; m Мембранный фильтр нитрата целлюлозы	Roth	NH69.1
Название	Company	Номер в каталоге	Комментарии
Equipment
Bü чи 461 водяная баня	Bü chi
Bü chi Rotavapor RE 111	Bü
Cary Eclipse	Varian
LiposoFast	Avestin
	Vaccubrand	15430
Nanosight Микроскоп с отслеживанием наночастиц	Malvern / Nanosight	LM 14C
NyONE Микроскоп	Synentec		доступен по запросу
Управление насосом	Vaccubrand	CVC 2II
Ультразвуковая ванна Sonorex RK100H	Brandelin электронный	31200001107477
Вакуумный насос RC5	Vaccubrand	1805400204
водяная баня W13	Haake	002-9910
Плазменный очиститель PDC-37G	Harrick Плазменная баня	PDC-37G
Название<	strong>Company	Номер в каталоге	Комментарии
Software
ImageJ	Open Source	http://imagej.nih.gov/ij/	программное обеспечение для обработки научных изображений
NanoCalcFX	Freeware	http://sourceforge.net/projects/nanocalc/	программное обеспечение для анализа/оценки данных для массивных кинетических наборов данных
транспорта NTA 2.3 Аналитическое программное обеспечение	Nanosight		для отслеживания наночастиц микроскоп
NTA 2.3 Temperature Comms	Nanosight		программное обеспечение для контроля температуры микроскопа с отслеживанием наночастиц