Методическая статья

Эффективное протокол Изоляция для B и Т-лимфоциты из небных миндалин человека

DOI:

10.3791/53374

⸱

16 ноября 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Biochemistry and Microbiology, Uppsala Biomedical Center, Uppsala University, 2Department of Surgical Sciences, Otolaryngology and Head & Neck Surgery, Akademiska sjukhuset

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нёбные миндалины являются богатым источником В- и Т-лимфоцитов. Здесь мы предоставляем простой, эффективный и быстрый протокол для выделения В- и Т-лимфоцитов из небных миндалин человека. Описанный метод был специально адаптирован для изучения вирусной этиологии воспаления миндалин, известного как тонзиллит.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Миндалины являются частью иммунной системы, обеспечивая первую линию защиты от вдыхаемых патогенов. Обычно термин «миндалины» относится к нёбным миндалинам, расположенным у боковых стенок ротовой части глотки. Хирургически удаленные небные миндалины обеспечивают удобный доступный источник В- и Т-лимфоцитов для изучения взаимодействия между чужеродными патогенами и иммунной системой хозяина. В этом видеопротоколе описывается вскрытие и обработка хирургически удаленных небных миндалин человека с последующим выделением отдельных популяций В- и Т-клеток из одного и того же образца ткани. Мы представляем метод, который эффективно разделяет тонзиллярные В- и Т-лимфоциты с использованием антителозависимого аффинного протокола. Кроме того, мы используем этот метод, чтобы продемонстрировать, что аденовирус человека инфицирует именно фракцию Т-клеток миндалины. Установленный протокол в целом применим для эффективной и быстрой изоляции популяций В- и Т-клеток миндалин для изучения роли различных типов патогенов в иммунных реакциях на миндалины.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Миндалины представляют собой скопления не полностью инкапсулированных лимфоидных тканей, которые лежат под эпителием и находятся в контакте с эпителием в верхних слоях пищеварительного тракта. Обычно термин «миндалины» относится к нёбным миндалинам, расположенным у боковых стенок ротовой части глотки. Парные нёбные миндалины вместе с носоглоточной миндалиной (аденоидной), парными трубчатыми миндалинами и язычными миндалинами составляют так называемое «кольцо Вальдейера». Последний отвечает за первоначальный контакт между вдыхаемыми или проглоченными возбудителями и лимфоидными тканями аэропищеварительного тракта1,2. Действительно, многочисленные отчеты показали, что как бактериальные, так и вирусные антигены могут быть обнаружены в образцах ткани нёбных миндалин2-6.

Небные миндалины состоят из плотной лимфоидной ткани, покрытой многослойным плоскоклеточным неороговевающим эпителием. Миндалины имеют многочисленные крипты, эпителиальные инвагинации, которые проникают через паренхиму, увеличивая площадь поверхности. Гистологически небные миндалины содержат многочисленные лимфоидные фолликулы с зародышевыми центрами, которые являются местами созревания и дифференцировки В-клеток (В-клеточные области). Аналогичным образом, небные миндалины охватывают Т-клетки, которые в основном расположены во внефолликулярных областях (Т-клеточных областях). В дополнение к В- и Т-клеткам, в небных миндалинах могут быть обнаружены также различные фолликулярные дендритные клетки1,2.

Благодаря своему анатомическому расположению, небные миндалины легко доступны при хирургических вмешательствах. Например, хирургическое удаление миндалин, известное как тонзиллэктомия, регулярно проводится во всем мире7. У детей с гиперплазией тонзилляров иногда используется частичное хирургическое удаление миндалин (тонзиллотомия), что вызывает у пациентов меньшую послеоперационную боль. Учитывая накопление различных возбудителей в миндалинах, хирургически удаленные миндалины дают уникальную возможность изучить влияние вирусных и бактериальных агентов на функции тонзиллярных лимфоцитов2,8. Кроме того, можно изучить, предпочитают ли некоторые патогены обитать в специфических клеточных субпопуляциях9. Кроме того, поскольку миндалины являются богатым источником В-лимфоцитов, выделенные В-лимфоциты миндалин могут быть эффективно использованы для изучения активности различныхсубпопуляций В-клеток. Однако, поскольку небные миндалины содержат смесь типов клеток, необходим эффективный метод разделения различных клеточных субпопуляций.

Здесь мы описываем простой метод эффективной и быстрой изоляции популяций В- и Т-клеток тонзиллярных клеток из небных миндалин человека с использованием метода разделения клеток, активируемых магнитом (Рисунок 1). Описанный здесь метод полезен для ученых, которые хотят оценить роль различных инфекционных агентов в лимфоидных органах человека, таких как небные миндалины.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол описывает выделение лимфоидных клеток из человеческого материала пациента и, следовательно, требует этическим нормам. Проделанная работа в данном исследовании был предоставлен Упсалы этического наблюдательного совета (DNR. 2013/387).

1. Выделение мононуклеарных клеток (МНК) из небных миндалин человека

ВНИМАНИЕ: Все неэкранированный материалы человеческого происхождения, такие как кровь, ткани или жидкости организма должны рассматриваться как потенциально инфицированным материалом. Таким образом, рекомендуемые практики биобезопасности для обработки тканей человека должны быть соблюдены.

Примечание: Чтобы избежать загрязнения, все решения и оборудование для культивирования клеток, должны быть стерильными. Все буферы и растворы должны быть предварительно охлаждены, и хранили на льду. Миндалины тканей и изолированных клеток должны храниться и обрабатываться на льду.

  1. Получить свежие миндалины из пациентов тонзиллэктомии или удаление миндалин (рисунок 2). Окунитесь в ткани ClumPS в 50 мл центрифужную пробирку, наполненную ледяной стерильной сбалансированным солевым раствором Хенкса (HBSS) с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 10 мМ глутамина, 0,05 мг / мл гентамицина и 1% антибиотиков-противогрибковое смеси (пенициллин, стрептомицина и амфотерицин).
  2. Держите трубки с погруженными образцами тканей миндалин во все времена на льду. Попробуйте обрабатывать миндалины, как только возможно, и не позднее, чем 3 часа после хирургического удаления.
  3. Поместите миндалину на 60 мм пластик клеток культуры пластины на льду и держать ткань, смоченную HBSS. Удалить видимые сгустки крови, жировой и соединительной ткани с чистыми щипцами с поверхности миндалин.
  4. Использование нового 60 мм культуральный планшет, содержащий 5 мл HBSS. Вырезать ткани миндалин комок в 3-10 мм фрагментов с использованием стерильного ножницы и / или скальпель.
  5. Подготовьте новый 60 мм культуральный планшет, содержащий 10 мл HBSS и поместить пластиковый клеточный фильтр 100 мкм в растворе HBSS.
  6. Передача DISSected миндалин фрагментов в ячейки фильтра стерильной щипцами. Использование конец плунжера пластиковый шприц, плавно сжать фрагментов ткани через ячейки сетчатого фильтра. Убедитесь, что фрагменты миндалины полностью погружены в HBSS.
  7. Отменить клеточный фильтр с тканью остатки и передавать полученную клеточную суспензию из 60 мм культуральный планшет в 50 мл пластиковые центрифужные пробирки. Оставьте пробирку на льду, а исходя с шагом 1,8 и 1,9.
  8. В случае больших миндалин, больше, чем 2 см в диаметре (Рисунок 2), выжать фрагменты миндалин в двух сотовых сетчатых, чтобы избежать засорения сетки в сито.
  9. Получение конечного объема 35 мл клеточной суспензии.
    Примечание: На этом этапе можно приготовить суспензию клеток для криоконсервации (см раздел 2).
  10. Добавьте 10 мл в градиенте плотности раствором, таким как Ficoll в новую 50 мл центрифужную пробирку. Аккуратно наложить клеточных suspensион (шаг 1,9) в верхней части градиента плотности раствора. Избегать смешивания клеточной суспензии и в градиенте плотности раствора.
    Примечание: градиент плотности раствора должен быть разогрет до комнатной температуры.
  11. Центрифуга клеточной суспензии в поворотно-откидной ротор 700 мкг на 20 мин при комнатной температуре. Не активируйте функцию тормоза на центрифуге в быстрого торможения может нарушить градиент. Кроме того, использовать низкие функцию ускорения доступной на центрифуге.
    Примечание: После этого стадии центрифугирования, наблюдается МНК в виде пушистого белого слоя на границе, и эритроцитов (эритроцитов), фибробласты и клеточного дебриса в качестве осадка на дне пробирки.
  12. Осторожно собрать слой МНК с помощью 10 мл пипетки. Поместите клеточной суспензии в новый 50 мл центрифужную пробирку.
  13. Добавить 25 мл охлажденной льдом PBS к клеточной суспензии, и спина трубки при 300 х г в течение 5 мин в поворотно-откидной ротор при 4 ° С.
  14. Удалить супернатант, используя 25 мл пипеткии повторить осадок клеток стиральной шаг два раза больше. Наконец ресуспендируют осадок клеток в 15 мл PBS.
    Примечание: После окончательного этапа промывки, можно криоконсервируют клеточной суспензии (см раздел 2).
  15. Применить 10 мкл клеточной суспензии в гемоцитометр клеток Счетной палаты и подсчитать количество клеток под микроскопом. Не включать соответствующее количество клеток (например, 2-3 х 10 7) в 15 мл центрифужную пробирку для последующего разделения борта магнитного. Держите эту аликвоту на льду до шага 3.2.

2. Криоконсервация клеток миндалин

  1. Подготовьте среду замораживания (90% FBS и 10% ДМСО) и держать его на льду. Для долговременного хранения держать замораживания средств массовой информации при -20 ° С.
  2. Определить общее количество клеток с использованием подсчета клеток гемоцитометр камеру (этап 1.15). Рассчитать необходимое количество замерзания среды в соответствии с требуемой плотностью замороженной клеточной (например, 10 7 клетокс / мл морозильной среде).
  3. Центрифуга клеточной суспензии в 300 мкг в течение 5 мин. Слейте супернатант, не нарушая клеточный осадок и ресуспендируют осадок клеток в ледяной замерзания среды (со стадии 2.1).
  4. Разливают по 1 мл аликвоты клеточной суспензии в стерильные флаконы, предназначенных для длительного хранения в жидком азоте. Замораживание ампул в изопропанол камеры и хранить их при температуре -80 ° CO / N. Для долгосрочного хранения передать флаконов в жидком азоте, содержащей резервуар или -140 ° C морозильник клеток.
  5. Для таять флаконы с замороженных клеток, согреть их быстро в С на водяной бане 37 °. Сразу при оттаивании, разогнать клеточной суспензии в 10 мл подогретого HBSS (с добавками, шаг 1.1) в 15 мл центрифужную пробирку. Спин трубку при 300 х г в течение 5 мин, удалить HBSS и ресуспендируют осадок клеток в желаемой плотности клеток в HBSS (с добавками, шаг 1.1).
    Примечание: жизнеспособность AF МНКтер оттаивания имеет значение, так как присутствие мертвых клеток снизится окончательный выход очищенного В и Т-лимфоцитов.
    Примечание: В соответствии с нашим опытом жизнеспособность клеток менее 80% снизит эффективность изоляции клеток.

3. Положительный Выбор Т-лимфоцитов из миндалин населения МНК

Примечание 1: Этот протокол основан на позитивной селекции человеческих CD3 + Т-лимфоцитов из миндалин МНК с использованием магнитных шариков, соединенных с антителом CD3. Можно начать этот раздел из свежих (раздел 1) или замороженных (раздел 2) МНК.

Примечание 2: Начните с 3 х 10 7 МНК. Не превышать это число клеток, так как разделительные колонны могут засорить и это приведет к снижению эффективности изоляции. Используйте большие колонки, если больше клеток будут обработаны. Объемы, используемые в этом протоколе были экспериментально оптимизирована для количества клеток насред в нашей экспериментальной установки.

  1. Подготовка буфера разделения [PBS (рН 7,2), 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 2 мМ ЭДТА]. Фильтр буфер разделения через фильтр и хранят 0,45 мкм при 4 ° С.
  2. Спин подвеску МНК (шаг 1,14) при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Ресуспендируют полученный осадок клеток в 240 мкл (80 мкл на 10 7 клеток) охлажденного льдом буфера разделения. Передача клеточной суспензии в стерильную пробирку 2 мл.
  3. Добавьте 20 мкл антител CD3 магнитного к раствору клеток. Инкубировать пробирки в течение 1 часа при 4 ° С при непрерывном осторожном перемешивании, чтобы клетки в суспензии.
  4. Передача всех клеточной суспензии в 15 мл пробирку, содержащую 5 мл охлажденного льдом буфера разделения мыть клетки.
  5. Центрифуга трубки при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С в поворотно-откидной ротор.
  6. Между тем создание магнитного сепаратора и колонны. Прикрепите магнитный сепаратор к подставке, и поместите колонку в SEPARАТОР. Промыть колонку с применением 500 мкл охлажденного льдом буфера разделения. Откажитесь от потока через.
  7. Поместите новую пробирку 15 мл колонке ниже. Держите пробирку на льду.
  8. Удалите супернатант (этап 3.5) по пипетки и осторожно ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл буфера разделения. Применение клеточной суспензии в верхней части предварительно промытой колонке и пусть это проходит через.
    Примечание: скопления клеток может засорить колонку и тем самым уменьшить расход. Чтобы избежать этой проблемы, место 40 мкм пластиковый клеточный фильтр в верхней части колонны. Прохождение клеток через этот сетки будет весьма повысить эффективность этого метода.
  9. Промыть колонку 4 раза с 1,5 мл буфера для разделения (500 мкл в течение 10 7 клеток). Подождите водохранилища столбца, чтобы быть пустым (жидкость не должна наблюдаться в колонке) перед нанесением следующего стиральной шаг.
    Примечание: Получите немеченые клетки CD3, считаются лимфоцитов фракции, так как ониэлюировали в пробирки.
  10. Удалить столбец из сепаратора и места в новой 15 мл пробирку. Пипетка 2 мл буфера для разделения на колонку. Использование поршень, прилагаемый к колонке элюирования положительно выбранные Т-лимфоциты, которые рассматриваются в качестве фракции лимфоцитов Т.
  11. Определить количество очищенных клеток (шаг 1,15), если это необходимо. Клеточные суспензии теперь готовы для последующих экспериментов.

4. проточной цитометрии изолированных миндалин B и Т-лимфоциты

ВНИМАНИЕ: Параформальдегид решение раздражителем и канцероген. Носить соответствующую защитную одежду, перчатки и средства защиты глаз / лица.

Примечание 1: Этот протокол описывает способ прямого окрашивания изолированной В- и Т-клеток с активацией флуоресценции сортировки клеток (FACS анализ). Основная цель этого этапа является оценка чистоты изолированной камере населения AFтер CD3 разделение магнитного антитела. Для этого, установленном В- и Т-клеточных маркеров, флуорофорные-сопряженных моноклональных антител CD20-FITC и CD2, APC-используются. Также включение управления изотипу антител рекомендуется различать неспецифический «фон» связывания антител CD2 и CD20 (см шаг 4,8).

Примечание 2: Можно не держать очищенные фракции клеточных в 1% параформальдегидом (PFA) раствор в темноте при 4 ° С до момента окрашивания (например, на следующий день.). Также же процедура применяется, если есть промежуток времени между окрашиванием и анализа FACS. Следует помнить, что в обоих случаях клетки должны быть вымыты должным образом с PBSA (PBS, содержащий 0,2% BSA) буфер перед окрашиванием или анализа FACS.

  1. Выньте 6 х 10 6 клеток МНК шагом 1,15 (перед нанесением на колонку), B-лимфоцитов фракции из стадии 3.9 и Т-лимфоцитов фракции со стадии 3.10.
  2. Спин ячейкиСуспензии при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С с использованием откидную ротора.
  3. Удалить супернатант с пипетки и мыть осадок клеток один раз 1 мл ледяного PBSA. Спин клеточные суспензии при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант с пипетки и ресуспендируют Клетки в 600 мкл охлажденного льдом буфера. PBSA
  4. Добавить 100 мкл клеточной суспензии в нижней части трубки FACS.
  5. Добавить 100 мкл PBS, содержащего 10% инактивированной нагреванием человеческую сыворотку в каждую пробирку, хорошо перемешать и инкубировать в течение ~ 1 мин при комнатной температуре или 20 минут на льду.
    Примечание: B-лимфоциты несут рецепторы Fc. Для того, чтобы блокировать Fc рецепторы очищенные фракции клеток инкубируют с 10% инактивированной нагреванием сыворотки крови человека. Сыворотки человека является инактивированной нагреванием инкубированием при 56 ° С в течение 1 часа. Разделите термоинактивированной сыворотку в малых аликвоты и хранить замороженные при -20 ° С.
  6. Центрифуга клеточной суспензии в 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С в SWИн-из ротора.
  7. Удалить супернатант с пипетки и мыть осадок клеток с 1 мл PBSA. Повторите центрифугирования (300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С).
  8. Добавить 100 мкл PBSA в каждую пробирку на льду. Добавить соответствующее количество флуорофора-сопряженных моноклональных антител, в соответствии с рекомендациями производителя (например, 20 мкл анти-CD20 и / или 5 мкл анти-CD2 антитела в 100 мкл PBSA). Примечание: Не забудьте установить достаточно трубы управления для анализа FACS. В этом протоколе должны быть включены следующие элементы управления: 1) клетки окрашивали антителами к CD2 и анти-CD20-отдельности, 2) клетки, окрашенные анти-CD2 и анти-CD20-контроля изотипа антител в отдельности и, 3) клетки без добавления антител.
  9. Кратко вихрь трубку и инкубировать в течение 30 мин при 4 ° С в темноте.
  10. Вымойте 2 раза PBSA. Добавляют 2 мл 1% раствора PFA с образцами. Пусть клетки остаются в растворе при 4 PFA76; С в темноте до момента анализа FACS.
  11. Непосредственно перед запуском образцов в машине FACS, промыть клетки 2 раза PBSA (300 мкг в течение 5 мин при 4 ° C). Образцы Ресуспендируйте в 1 мл PBS и держать при 4 ° С (или на льду), защищенном от света месте, до разделения на цитометра.
  12. Сделайте сортировку FACS следующий протокол от цитометра производителя.

5. ПЦР обнаружения аденовируса ДНК в изолированных миндалин B и Т-лимфоциты

Примечание 1: аденовирусные генные праймеры Hexon являются AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 ') и AdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3') 11. Эти праймеры генерируют ампликон 139 б.п.. Хост гена рРНК 18S могут быть обнаружены с праймерами tp206 (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') и TP207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3'). Ожидаемый размер ампликона составляет 300 б.п..

Примечание 2: Каждый ПЦРпробег включает в себя отрицательный контроль (дистиллированная H 2 O) и положительный контроль ДНК, полученной из клеточной линии человеческого (BJAB) инфицированного человека типа аденовируса 5 12.

  1. Извлечение ДНК (по крайней мере, 1 × 10 6 клеток, шаг 3.11) с использованием диоксида кремния мембраны способ очистки колонки на основе. Извлечение РНК с помощью фенола и гуанидинизотиоцианата решение 13.
  2. Добавить 100 нг ДНК из В- и Т-лимфоцитов в реакционной смеси, содержащей 1х HF буфер, 0,2 мМ дезоксинуклеотидтрифосфатов смеси (дНТФ), 0,25 мкМ каждого праймера и 1 ед Высококачественное ДНК-полимеразы в общем объеме 20 мкл.
  3. Выполнение ПЦР-амплификации при следующих условиях велосипедных: 30 сек денатурация при 98 ° С, затем 30 циклов 98 ° С в течение 10 сек, 67 ° С (Hexon) или 58 ° C (18S рРНК) в течение 30 сек и 72 ° С в течение 30 сек. Реакцию ПЦР закончился конечной стадии расширения 7 мин при 72 ° С.
  4. Отделите полученный ПЦР amplification изделия на 1,5% агарозном геле в 1X TBE буфер и визуализировать ожидаемых диапазонов окрашиванием красителем нуклеиновых кислот.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эффективный разделение миндалин МНК приводит высокоочищенных субпопуляций В и Т-лимфоцитов. Это было подтверждено с помощью анти-CD20 и анти-CD2 антитела для выявления В- и Т-лимфоцитов популяции соответственно (фиг.3А) с помощью анализа FACS. В противоположность этому, неэффективный отделение МНК результатов в клеточных фракций, которые представляют собой смесь клеток из двух В- и Т-лимфоцитов (субпопуляций Фиг.3В).

Выделенный миндалин В- и Т-лимфоциты

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Один из самых важных факторов, влияющих на исход этого протокола является использование свежего материала миндалин в качестве исходного материала. Таким образом, образцы миндалины должны быть обработаны в течение 3 ч после операции. Миндалины могут быть получены из взрослых, так и детей. Миндалин материал от детей, как правило, меньше, из-за частичного хирургического удаления миндалин (тонзиллэктомия). Таким образом, количество МНК получены из образцов удаление миндалин (1 х 10 7 -1 × 10 8) меньше ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Шведским онкологическим обществом (11 0253, 13 0469), Шведским исследовательским советом (K2012-99X-21959-01-3), Фондом Маркуса Боргстрёмса и Шведским исследовательским советом через грант Уппсальскому исследовательскому центру РНК (2006-5038-36531-16). Мы в долгу перед основным подразделением BioVis в Уппсальском университете за большую помощь в анализе FACS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS) Gibco14175-053Содержит 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 10 мМ глютамина,     0,05 мг/мл гентамицин и 1% антибиотик-антимикотическая смесь
Замораживающая среда90% FBS и 10% буфер
DMSO MACSPBS (pH 7,2), 0,5% BSA и 2mM EDTA
PBSA PBS, содержащий 0,2% BSA
PFAPBS, содержащий 1% параформальдегида (PFA). Приготовьте свежий. ПФА подозревается в канцерогене. Надевайте перчатки и защитные очки.
Антибиотико-антимикотическая смесьGibco15240-062
60 мм PetridishNunc150326
Препарирование форепсаFisher Scientific1381241
Прямые ножницы для ириса Fisher Scientific12912055
одноразовые скальпелиSwann-MortonREF 0501
100 μ m пластиковый сетчатый фильтрCorning Life Sciences352360
40 μ m Пластиковые сетчатые фильтры Corning Life Sciences352340
пластиковый шприц 2 млBD Biosciences 
конические центрифужные пробирки 15 млSARSTEDT62554502
конические центрифуги 50 млSARSTEDT62547254
Низкоскоростная центрифуга с фиксированным углом наклона или ротором с качающимся ведромThermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll– HypaqueSigma-AldrichF5415-50MLFicoll раствор
Сыворотка теленкаплода Биологическая промышленность040071A
Диметилсульфоксид (ДМСО)SIGMAD2650-5X5ML
MACS MS колонки Miltenyi Biotec130-042-201
MACS человеческие CD3 микрогранулыMiltenyi Biotec130-092-881
MACS сепаратор (Octo MACS)Miltenyi Biotec130-042-109
Бычья сыворотка альбумин (BSA)Merck Millipore1120180100
EDTAAnalaR NORMAPUR20302.293
CD2 конъюгированный с аллофикоцианином ( CD2-APC) BD Biosciences 
CD20 конъюгирован с флуоресцеина изотиоцианатом (CD20-FITC) BD Biosciences 
Сыворотка крови человека Rockland ImmunochemicalsD119-0100
Phusion Высокоточная ДНК-полимеразаThermo ScientificF-530L
FACS пробиркиBD Falcon352003
CryotubeSARSTEDT72379
BD LSRII flowcytometerBD Biosciences 
Программное обеспечение BD FACSDiva 4.1BD Biosciences 
Nucleospin Кровь Macherey-Nagel740951.50Набор для выделения ДНК
TRIzol  реактивLife technologies15596Реактив для выделения РНК
ГемоцитометрThe Paul Marienfeld GmbH & Co. KG0610030счетчик клеток
GelRedBiotium41003Гель для окрашивания нуклеиновых кислот 
300185560642556632

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nave, H., Gebert, A., Pabst, R. Morphology and immunology of the human palatine tonsil. Anat Embryol (Berl). 204, 367-373 (2001).
  2. Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology today. 19, 414-421 (1998).
  3. Alkhalaf, M. A., Guiver, M., Cooper, R. J. Prevalence and quantitation of adenovirus DNA from human tonsil and adenoid tissues. J Med Virol. 85, 1947-1954 (2013).
  4. Brandtzaeg, P., Halstensen, T. S. Immunology and immunopathology of tonsils. Adv Otorhinolaryngol. 47, 64-75 (1992).
  5. Imai, S., et al. Epstein-Barr virus (EBV)-carrying and -expressing T-cell lines established from severe chronic active EBV infection. Blood. 87, 1446-1457 (1996).
  6. Veen, J., Lambriex, M. Relationship of adenovirus to lymphocytes in naturally infected human tonsils and adenoids. Infect Immun. 7, 604-609 (1973).
  7. Friedman, M., Wilson, M., Lin, H. C., Chang, H. W. Updated systematic review of tonsillectomy and adenoidectomy for treatment of pediatric obstructive sleep apnea/hypopnea syndrome. Otolaryngol Head Neck Surg. 140, 800-808 (2009).
  8. Garnett, C. T., et al. Latent species C adenoviruses in human tonsil tissues. J Virol. 83, 2417-2428 (2009).
  9. Garnett, C. T., Erdman, D., Xu, W., Gooding, L. R. Prevalence and quantitation of species C adenovirus DNA in human mucosal lymphocytes. J Virol. 76, 10608-10616 (2002).
  10. Perez, M. E., Billordo, L. A., Baz, P., Fainboim, L., Arana, E. Human memory B cells isolated from blood and tonsils are functionally distinctive. Immunol Cell Biol. 92, 882-887 (2014).
  11. Cooper, R. J., Yeo, A. C., Bailey, A. S., Tullo, A. B. Adenovirus polymerase chain reaction assay for rapid diagnosis of conjunctivitis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 90-95 (1999).
  12. Zhang, Y., Huang, W., Ornelles, D. A., Gooding, L. R. Modeling adenovirus latency in human lymphocyte cell lines. J Virol. 84, 8799-8810 (2010).
  13. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. biochem. 162, 156-159 (1987).
  14. Watanabe, T., Yoshizaki, K., Yagura, T., Yamamura, Y. In vitro antibody formation by human tonsil lymphocytes. J Immunol. 113, 608-616 (1974).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

BTCD3 TB CD20

Похожие статьи