Методическая статья

Флуоресценции Восстановление после Слияние капли измерить двумерной диффузии фосфолипидов монослоя

10.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53376

⸱

15 октября 2015 г.

 ,  ,  , 
1Department of Bio and Brain Engineering, KAIST, 2Information and Electrical Research Institute, KAIST

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем новую методику измерения латеральной диффузии поверхностно-активного вещества на границе жидкость-жидкость путем слияния монослоя капли с плоским монослоем.

Аннотация

Мы представляем новый метод измерения боковой диффузии монослоя поверхностно-активного вещества на границе раздела жидкость-жидкость, называемый восстановлением флуоресценции после слияния (FRAM). FRAM использует те же принципы, что и метод восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP), особенно для измерения восстановления флуоресценции после обесцвечивания определенной области, но FRAM использует каплю коалесценции вместо молекул фотообесцвечивающего красителя для индуцирования градиента химического потенциала молекул красителя. Наша методика имеет ряд преимуществ перед FRAP: для этого требуется только флуоресцентный микроскоп, а не конфокальный микроскоп, оснащенный мощными лазерами; он практически свободен от отбора флуоресцентных красителей; Кроме того, он обладает гораздо большей свободой в определении измеряемой площади диффузии. Кроме того, FRAM потенциально обеспечивает путь для изучения смешивания или взаимной диффузии двух различных поверхностно-активных веществ, когда монослои на поверхности капли и на плоской границе раздела воздух/вода получают с различными веществами независимо друг от друга.

Введение

Фосфолипиды являются основными компонентами клеточных мембран и органелл мембран и текучесть этих слоев мембран часто влияет на клеточные функции изменения активности мембранных белков 1 - 3. Например, мембраны   гомеостаза липидов достигается путем регулирования текучесть мембран, который обнаруженный мембранных белков, и ненормальный уровень текучести вызывает тяжелые заболевания, такие как стеатоз печени и холестаза 4. Кроме того, текучесть фосфолипидного монослоя на границе жидкости с воздушным альвеолы ​​имеет важные последствия в своих функций. Высокая текучесть легких поверхностно фосфолипидов монослоя облегчает распространение слоя во время вдоха, в то время как текучесть при низких позволяет слой, чтобы остаться в альвеолах во время выдоха 5,6. Таким образом, важно, чтобы оценить текучесть фосфолипидных слоев, чтобы понять свои роли.

_content "> прямой мерой текучести является вязкость, а вязкость фосфолипидных слоев было измерено с помощью микронного размера коллоидных магнитных 7, иглы 8,9 и магнитные микро- кнопки 6,10,11. Однако эти методы ограничены относительно жестких пленок, и не может измерить менее вязкой пленки. В таких случаях диффузии бы быть альтернативой для количественного текучесть фосфолипидных слоев. В течение нескольких десятилетий, различные методы для измерения диффузионных свойств фосфолипидных слоев были разработаны, таких как флуоресценции методом закалки 12, ЯМР градиента импульсного поля 13 и флуоресценции корреляционной спектроскопии (FCS) 14. Один из самых представительных методов восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) 15,16. Благодаря простоте процедуры измерения и связанные с ними теории, несколько исследований по диффузии свойств фосфолипидных слоев были выполнены с помощью FRAP 17 - 19. Тем не менее, FRAP обычно требует дорогостоящего установки конфокальной микроскопии с лазером высокой мощности.

Здесь мы представляем новую технику, чтобы измерить боковой диффузии фосфолипидов монослоев, называемых также восстановления флуоресценции после слияния (FRAM). Ключевое различие между FRAP и FRAM является то, что шаг фотообесцвечивание заменяется раскрывающегося слияния. Слияние капельку покрытый без флуоресценции монослоя на флуоресцентно меченного плоской монослоя оставляет круговой темное пятно на светлом плоской монослоя, таким образом, создание того же начального состояния с шагом фотообесцвечивания. Затем мы наблюдаем восстановление флуоресценции в темное пятно со временем измерения бокового диффузии. Это новое "отбеливание" шаг за падения коалесценции обеспечивает значительные преимущества по сравнению FRAP: FRAM требует только флуоресцентного микроскопа, а не дорогой конфокальной микроскопии с высокой мощности лазера, необходимой для FRAP. Ян Кроме того, FRAM имеет широкий выбор флуоресцентных красителей, так как оно не связано с процессом фотообесцвечивания. Наконец, два различных монослоев, капелька монослой и плоский монослой, могут быть получены независимо, таким образом позволяя взаимной диффузии должна быть измерена, а FRAP измеряет только самодиффузии монослоев.

FRAM обеспечивает широкий диапазон измерений диффузии из вязких материалов для почти невязкой материалов. В принципе, FRAM может измерить максимальное диффузии 10 6 мкм 2 / с, что сравнимо с существующими методами, когда диффузия происходит по всей территории 100 мкм на 100 мкм в течение времени для процесса падение слияния (~ 10 мс). Кроме того, медленный процесс диффузии может быть легко измерены, если монослои не являются твердыми. FRAM может использоваться для любых видов поверхностно-активных веществ тех пор, пока соответствующие флуоресцентно меченые молекулы имеются.

Протокол

Осторожно: См паспорте безопасности (MSDS) перед использованием ацетона и хлороформа, которые канцерогенны.

1. Подготовка Phospholipid монослоя на плоским воздух-вода интерфейс

  1. Формирование фосфолипидного монослоя
    1. Приготовление раствора фосфолипидов
      1. Очистите 4 мл флакон с крышкой из политетрафторэтилена с покрытием, используя ацетон, этанол и деионизированной воды, по крайней мере в три раза, и взорвать азота тщательно во флакон, чтобы избавиться от воды.
      2. Растворите 1 мг фосфолипида (например, dioleoylphosphatidylcholine, ДОФХ) в 1 мл хлороформа в ампуле, чтобы получить 1 мг / мл концентрации. Выполните эту процедуру в вытяжном шкафу для безопасности. Используйте более низкие или более высокие концентрации раствора фосфолипидов при необходимости.
      3. Добавить краситель помечены фосфолипиды (например, родамин dipalmitoylphosphatidylethanolamine, родамин DPPE) с менее чем 1% мол фосфолипидного Солуции, чтобы визуализировать фосфолипидный монослой с флуоресцентным микроскопом. Выполните эту процедуру в вытяжном шкафу для безопасности.
      4. Заверните флакон с политетрафторэтилена лентой, чтобы предотвратить испарение растворителя, и хранить образцы в морозильной камере при температуре -20 ° С.
    2. Отложение фосфолипидов на границе раздела воздух-вода
      1. Очистить чашку Петри (55 мм в диаметре и 12 мм в высоту) этанолом и деионизированной воды, по крайней мере в три раза.
      2. Заполните чашку Петри с 10 мл деионизированной воды, чтобы создать раздела воздух-вода.
      3. Распространение несколько мкл раствор фосфолипида с микро-шприца на чистую интерфейс для достижения требуемого давления поверхности и подождите не менее 30 мин, чтобы испарить растворитель полностью, до делать эксперимент.
        Примечание: Ленгмюра желоб может быть использован вместо чашки Петри, если точный контроль температуры поверхности необходимо.
  2. СуИзмерение давления rface
    1. Измерьте давление поверхности монослоя фосфолипидов с плиты тензиометра Вильгельми. Подождите, по крайней мере 30 мин, чтобы получить бумажный фильтр смачивают достаточно, если бумажный фильтр используется в качестве пластины Вильгельми. Детальный протокол доступен в Куна и др. 20.
    2. Регулировка осажденный количество фосфолипида точно контролировать давление на поверхность. Добавить 4 мкл раствора DOPC (1 мг / мл) на 30,25 см 2 -площадь интерфейса, если ~ 5 мН / м поверхностного давления не требуется.
      Примечание: Если фильтровальная бумага полностью не смачиваются, давление на поверхность резко меняется в течение первых 30 мин эксперимента из-за изменения веса фильтровальной бумаги.
  3. Минимизация конвективных потоков монослоя
    1. Использование конусообразную аппарат, содержащий 3 мм резервуар с двумя тонких каналов, подключенных к значительной части чашки Петри, чтобы подавить конвективный поток измонослой, которые могут нарушить измерения давления морфология поверхности изображений и.
    2. Убедитесь в соответствии уровней воды между внутренней и внешней стороне конуса формы аппарата для того, чтобы свободно перемещаться фосфолипиды по всей области перед нанесением фосфолипиды на границе раздела воздух-вода.

2. Подготовка фосфолипида монослоя на криволинейной поверхности капли

  1. Сужение процесс из стеклянного капилляра с помощью микропипетки съемник
    1. Поставьте стеклянный капилляр (OD 1 мм, ID 0,78 мм, длина 100 мм) на держателе капиллярного микропипеткой съемника.
    2. Дизайн программы для вытягивания капилляров с соответствующими значениями параметров (тепла: Ramp, Pull: 60, Vel: 70, 70: Delay и давление 200) и вытяните капилляры с разработанной программой в соответствии с протоколом производителя.
      Примечание: капиллярная заканчиваться несколько микрометров диаметра необходимо сформировать 100 мкм капли по Applин давление с ~ 10 кПа. Если верхний конец капилляра слишком мала, намного более высокое давление,> 600 кПа, необходимо, чтобы получить капли, в то время как трудно контролировать размер капель со слишком большим конце капиллярного наконечника.
  2. Поглощение фосфолипидов на поверхности капли
    Примечание: Для формирования фосфолипидный монослой на изогнутой поверхности раздела капли, фосфолипид раствор без красителя помечены фосфолипиды используется для получения контраста интенсивности, к плоской монослоя, получали по методике 1. Кроме того, обе процедуры 2.2.1 и 2.2 0,2 допустимы здесь. Если точный контроль давления на поверхности на поверхности капель необходимо, процедура 2.2.2 настоятельно рекомендуется. Тем не менее, если нет, процедура 2.2.1, которая является гораздо более простой способ, чем процедуры 2.2.2, является полезным.
    1. Процесс фосфолипидов покрытия на верхнего конца
      1. Очистить предметное стекло с помощью ацетона, этанола и деионизированной воды, по крайней мере в три раза.
      2. Plтуз конический капилляр на очищенную предметное стекло, и наклоните капилляр для облегчения касаясь слайд стекла с конца наконечника.
      3. Бросьте несколько капель раствора фосфолипидов (1 мг / мл) на верхнем конце капилляра, что приклеена к стеклу с помощью стеклянного шприца, и подождите не менее 30 минут, чтобы испариться растворитель полностью.
        Примечание: настоятельно рекомендуется придерживаться передний конец трубки к стеклу во время процедуры 2.2.1.3 потому периметр верхнего конца слишком мала, чтобы удерживать капли фосфолипидов в конце наконечника только капиллярных сил.
    2. Получение раствора пузырьков
      1. Очистить пузырек, и удаления воды из флакона, а введены в процедуре 1.1.1.1.
      2. Объеме сухого 2 мл раствора фосфолипида (1 мг / мл) с применением газообразного азота осторожно и высушиванию флакон в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы исключить любой оставшийся растворитель. Выполните эту процедуру в вытяжном шкафу для безопасности.
      3. Добавить 2мл деионизированной воды во флакон, содержащий липиды сушат и инкубируют флакон в печи при 60 ° С в течение 1 часа.
      4. Встряхнуть флакон несколько раз, и обработать ультразвуком (ВЧ-частот: до 40 кГц, Мощность: 370 Вт) в течение 30 мин, чтобы получить везикулы.
      5. Выполните экструзионные и замораживания-оттаивания способы получения монодисперсных однослойных везикул. Подробное методике получения везикул описан в Mayer и соавт. 21.
        Примечание: Давление интерфейса капель управляется точно, регулируя время ожидания после формирования капли, содержащей монодисперсные однослойные везикулы. Используя метод 22 кулон падение, необходимо измерить изменение поверхностного давления в зависимости от времени, до делать эксперимент.
  3. Формирование капель, который содержит фосфолипидный монослой на криволинейной поверхности
    1. Заполните конической капилляра с 10 мкл деионизированной воды из procedurе 2.2.1. Кроме того, использование 10 мкл раствора везикул с процедурой 2.2.2.
    2. Подключите капилляр к автоматизированной микро-форсунки для обеспечения давления для формирования капли.
    3. Установите капилляр, который подключен к микро-форсунки для микроманипулятор точно контролировать положение капилляра.
    4. Подготовьте светлого поля микроскопа (микроскоп 1, цель объектива: 10X NA 0.3) для визуализации боковой вид капилляра с ПЗС-камерой. Микроскоп 1, таким образом, дает возможность наблюдать точное положение капли вдоль оси и оценить размер капли.
    5. Перемещайте конец наконечника в положение, где вид сбоку верхнего конца хорошо визуализировали с помощью микроскопа 1, с использованием микроманипулятора, и применять переменное давление (~ 100 гПа) с верхнего конца капилляра, пока соответствующего размера (~ 100 мкм в диаметре) из капли образуется.
      Примечание: Рекомендуется автоматизированная микро-форсунки и микроманипулятор быть использованиед, если в порядке контроль размера капель и расположения капли необходимо. Кроме того, можно использовать ручные них.

3. флуоресценции Восстановление после дроплета Слияние

Примечание: Основные принципы этого протокола идентичны техники FRAP, для процесса слияния падение исключением. Подробные теории протоколов и связанные с ними из FRAP доступны в А. Лопес и др. 15 и Д. Аксельрод и др. 16.

  1. Мониторинг и контроль местоположения капли
    1. Подготовка инвертированного микроскопа набор (микроскоп 2, объектив: 10X Н.А. 0.3, трубки линзы: фокусное расстояние 17 см), что позволяет как флуоресцентный микроскоп с соответствующим набором фильтров для родамина-DPPEs (возбуждения при 560 нм, излучение на 583 нм) и светлое поле микроскоп. Использование ПЗС-камеры здесь для визуализации виды сверху капли с помощью флуоресцентного микроскопа мода и режим микроскоп светлого поля.
    2. Перемещение капли, покрытую фосфолипидов на плоской поверхности раздела воздух-вода вдоль оси, но не сливаются каплю же, с помощью микроманипулятора. Использование микроскопа 1 визуализировать вид сбоку капли.
    3. Расположить капли в центре сверху плоского монослоя, используя микроманипулятор. Используйте микроскоп режим светлого поля микроскопа 2 визуализировать вид сверху плоской монослоя.
  2. Слияние капель на плоской поверхности раздела воздух-вода
    1. Перемещение капельку дальше к плоской границе, пока капля не сливается на интерфейс, с помощью микроманипулятора. Если процесс объединение выполняется успешно, темный район с круглой формы, который окружен белом фоне, наблюдается с использованием режима флуоресценции микроскоп 2.
    2. Запишите серию флуоресцентных изображений в зависимости от времени после слияния капель, используя режим флуоресценции Micros2. Используйте справиться быстрее, чем скорость передачи кадров в масштабе времени диффузии монослоя здесь. В ДОФХ монослоя, это занимает несколько минут, чтобы диффундировать в 200 мкм темной области полностью.

4. Определение коэффициента диффузии по анализу изображений

Примечание: Для определения коэффициента диффузии из серии изображений, индивидуальные программы для анализа изображений построен, как описано ниже. Подробный исходный код этой программы доступна на веб-сайте Юпитера.

  1. Обнаружение круговой области, представляющей интерес
    1. Обнаружение центре области, представляющей интерес
      1. Получить серию флуоресцентных изображений, которые были записаны во время процесса восстановления, который содержит круглую темную область и белый фон, и установить первое изображение серии в качестве опорного изображения. Здесь R D представляет радиус темной области в опорном изображении.
      2. Гофр эталонного изображения с белым кругом, которыйSE интенсивность однородна по всей области. Используйте встроенный функцию с именем 'conv2' для свертки, как показано в исходном коде индивидуальную программу линии 124. Здесь, радиус белого круга немного меньше, чем R D.
      3. Найдите положение, что указывает на минимальное значение в вычислении свертки, и установить эту позицию как в центре области интереса в опорном изображении.
    2. Определение радиус области, представляющей интерес
      1. Гофр эталонного изображения с белым кругом, который содержит положение центра, определяется по методике, 4.1 и равномерной интенсивностью в течение всего региона. Здесь Р С радиус белого круга. Используйте итерации, такие как "за" или "а" с уравнением окружности, чтобы сделать белый круг, как показано в исходном коде индивидуальную программу линии 102 до 109.
      2. Гофр эталонного изображения с другим белым кругом, который имеет немногобольший радиус (5% -10%), R L, чем R S. Используйте тот же метод с процедурой 4.1.2.1, чтобы сделать круг, как показано в исходном коде индивидуальную программу линии 113 до 120.
      3. Получить разницу в стоимости между двумя свертки расчетов 4.1.2.1 и 4.1.2.2.
      4. Повторите вышеуказанные процедуры от R S = R D / 2 до R = 2R S D, увеличивая как R S и R L с уровнем пикселей. Сделать итерации, который содержит целые исходные коды из процедуры 4.1.2.1 для 4.1.2.3 повторить.
      5. Найти радиус R S, который указывает максимальную разницу в стоимости между двумя расчетов свертки. Использование функции встроены названием 'макс ", чтобы найти радиус указывает максимальную разницу в стоимости, как показано в исходном коде индивидуальную программу линии 148 до 149. Это R S таким образом, указывает радиус темной области в опорном изображении.
  2. Расчет фракционного интенсивности
    1. Установить круг, который содержит центральное положение и радиус, определяемый процедурой 4.1 в качестве области, представляющей интерес.
    2. Рассчитать среднюю интенсивность интересующей области в серии изображений флуоресценции в зависимости от времени. Гофр каждого кадра с интересующей области и разделить его на области области интереса для расчета средней интенсивности. Подробности доступны в исходном коде программы индивидуальных которая доступна на веб-сайте Юпитера.
    3. Рассчитать дробную интенсивность, определяется как ниже уравнения, где Р (Т) средняя интенсивность в круг, который является область интереса в зависимости от времени, F я это начальная интенсивность в круг, и Ф О интенсивность на белом фоне.
      F (T) = (F (T) - F I) / (F - F I) (уравнение 1).
  3. Установка Fractional интенсивность теории FRAP
    1. Установите дробную интенсивность с ниже уравнения, где τ является характерным временем диффузии и я 0, I 1 модифицированные функции Бесселя, используя достойный программу, и получить т
      figure-protocol-1 (Уравнение 2).
    2. Получить коэффициента диффузии на основе соотношения, т = 2/4 D D, где коэффициент диффузии и радиус темной области.
      Примечание: Во время процесса подбора, можно сместить профиль дробную интенсивности вдоль оси времени, когда процесс восстановления уже началась, перед записью изображений.

Результаты

Серия флуоресцентных изображений были получены со временем в процессе восстановления после слияния капельку покрытую ДОФХ монослоя на плоской ДОФХ монослоя, как указано на рисунке 1. ДОФХ монослоя на плоской границе раздела воздух-вода была с примесью небольших количеств родамин-DPPE, и это, таким образом, стало возможным визуализировать фон яркого цвета и темно-области вновь добавленного к плоской поверхности. Там, процесс восстановления наблюдался в 23 мН / м фиксированном давлении поверхности. Подгонка уравнения 1 с изменением интенсивности фракционной в зависимости от времени показан на рисунке 2. Значение этого подгонки R2 обозначает 0,999, и это подходит по-прежнему работает хорошо, даже при более низких давлениях, или поверхности высших. Коэффициент диффузии DOPC монослоя, полученного из этого подойдет был 27,54 мкм 2 / сек при 23 мН / м поверхностного давления.

Для получения дополнительной валидации FRAM, коэффициентов диффузии DOПК и дипальмитоилфосфатидилхолин (ДПФХ) монослои были измерены в соответствии с поверхностным давлением. Как показано на рисунке 3, FRAM захватывает быстрое уменьшение коэффициента диффузии монослоя DPPC на ~ 9 мН / м поверхностного давления, где LC (жидкость конденсируется) - LE (жидкость расширяется) происходит фазовый переход 10, и значения коэффициенты диффузии также хорошо согласуется с ранее измерениями Питерс и др. 19. Кроме того, экспоненциальный спад коэффициента диффузии с поверхностного давления наблюдается в ДОФХ монослоя, и эта тенденция практически совпадает с той, измеренной Карузо и др. 12.

figure-results-1
Рисунок 1. (А) Схематическое изображение FRAM (восстановление флуоресценции после слияния) метод. В губеID монослой капель покрытием объединены в плоской поверхности раздела воздух-вода, липид монослой без флуоресценции отмеченных липидов вставляется плоской флуоресцентной липидов монослое. (B), флуоресцентный микроскоп изображения с течением времени во время процесса восстановления в ДОФХ монослоя на 23 мН / м поверхностного давления (масштаб бар = 100 мкм). Темная область ДОФХ монослоя полностью покрываются процесса диффузии в течение нескольких минут. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2. Дробное интенсивность в зависимости от времени. Черные круги и серый пунктирная линия указаны значения дробных интенсивностей, полученных из анализа изображений (процедуры 4.1 и 4.2) и подгонки уравнения 1 к дробным интенсивности со временем,показано в процедуре 4.3, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3. Коэффициенты диффузии ДОФХ (треугольник) и DPPC (пусто) квадратный монослоев в зависимости от поверхностного давления. Линии с яркой серого цвета и с темно-серого цвета указывают значения коэффициента диффузии сообщалось ранее Питерс и др. и Caruso и др., соответственно. Эта цифра была изменена с Чжон др. 23. Печатается с разрешения Чжон др. Ленгмюра. 30 (48), 14369-14374. Copyright 2014 Американского химического общества. Пожалуйста, нажмите еее, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

FRAM разделяет много фундаментальных принципов с FRAP, особенно для измерения флуоресценции восстановления после отбеливания удельную, но FRAM использует процесс слияния капельку на плоской поверхности, чтобы сформировать беленой площадь, вместо применения интенсивной свет. Процесс, таким образом, объединение наиболее важным шагом в FRAM, и в особенности, форма пятна на темном плоской монослоя после объединения капли определяет точность измерения диффузии. В частности, на основе текущего метода, мы только установить круг с радиусом R в области, представляющей интерес для расчета средней интенсивности темным пятном, показанный в процедуре 4 и, если есть слишком много отклонение от круглой формы, это будет мешать точное измерение коэффициента диффузии. Таким образом, это необходимо для получения круглой формы темной области, но, некруговые формы образуются от времени по нескольким причинам. Во-первых, если существует конвективный поток в ПитомецRI тарелки, форма темной области удлиняется по направлению потока. Как уже упоминалось в процедуре 1.3, конус-формы Устройство помогает подавить конвективный поток, и это удлинение будут сведены к минимуму. Во-вторых, если верхний конец капилляра касается плоский интерфейс во время процесса слияния, темная область образована с разнообразием форм с конца капиллярного прерывает процесс слияния. По получении капли, что только висит с самого конца капилляра, это прерывание может быть предотвращено. В частности, гидрофобная обработка капилляра помогает капельку, чтобы сидеть в самом конце капилляра. Таким образом, выше неисправностей съемки и модификации позволит более точно измерить свойства диффузии.

Таким образом, этот хорошо диагностирован процесс позволяет FRAM иметь несколько значительные преимущества по сравнению FRAP. Во-первых, FRAM требует простой оборудования по сравнению с FRAP. Для FRAM, достаточно использовать простые флуоресценции микроскопиисправиться, вместо дорогого конфокальной микроскопии с помощью лазера высокой мощности, длина волны которого должен соответствовать спектру поглощения красителя. Кроме того, необходимо использовать дополнительное устройство для регулировки размера в области отбеленной в FRAP, в то время как FRAM контролирует размер области легко регулировать размер капли, или поверхностное давление на поверхности капли. Во-вторых, можно использовать различные виды красителей в FRAM. FRAP использует только молекулы красителя которых отбеливание процесс гораздо быстрее, чем процесс диффузии. Если диффузия красителей во время процесса отбелки, трудно оценить свойства диффузии точно. Фрама, однако, не требует процесса для отбеливания красителей, и это, таким образом, позволяет использовать различные типы красителей в флуоресценции. Кроме того, FRAP требует дополнительных лазеров высокой мощности и наборы фильтров, чтобы изменить вид красителя, а необходимо лишь заменить наборы фильтров в FRAM. в заключение, Так как монослоев на поверхности капелек и плоской поверхности может быть сформирован независимо, что позволяет изучение взаимной диффузии или перемешивания между двумя различными монослоев липидов путем слияния А-типа монослой на B-типа монослоя, в то время как FRAP измеряет только самодиффузии монослое.

Несмотря на эти преимущества, процесс слияния капельку на плоской поверхности воздух-вода потенциально могут ограничить эту технику из-за нескольких проблем, которые могли бы представлять интерес, таких как несоответствие поверхностного давления между двумя монослоев, на временной шкале процесса слияния и увеличение поверхностного давления плоской монослоя после слияния капель. Эти вопросы, однако, не влияет на измерение диффузии значительно по следующим причинам. Во-первых, несмотря на то, поверхностные давления на двух различных монослоев совершенно разные, процесс установления равновесия завершается в очень ранней стадии в процессе восстановления. Например, если тОн поверхностное давление монослоя на поверхности капли, выше, чем в монослое на плоской поверхности раздела воздух-вода, темная область расширяется, пока давление не уравновешивает поверхность. Так как этот процесс будет завершен в течение 10 мс, поверхностное давление будет уравновешена до того, как существенно влияет на процесс диффузии. Во-вторых, если масштаб времени процесса слияния достаточно быстро, это не ограничивает измерение диффузии вообще. К счастью, типичный процесс объединения также завершен в течение 10 мс. Наконец, даже нескольких слияние капель на плоской поверхности не увеличить давление поверхности, так как площадь поверхности желоба намного больше, чем площадь поверхности капли. В соответствии с размерами желоба и капель, описанной в протоколе, площадь на молекулу увеличивает меньше 0,015% путем слияния капли. Соответственно, увеличение поверхностного давления в связи с изменением площади на молекулу составляет менее 0,1%, что negligiblе потому, что это намного меньше, чем типичный ошибки в поверхностном давлении, как измерено Пластинка Вильгельми тензометра.

В целом, мы ввели новый метод для измерения бокового диффузионного свойство фосфолипидов монослоя путем слияния капли монослой на плоской поверхности. Этот метод требует относительно простое оборудование, а также позволяет использовать различные виды видов красителей. Фрама, таким образом, потенциально применимы для диффузии измерения любых поверхностно-активных веществ, в том числе фосфолипиды, блок-сополимеры, белки и даже наночастиц на границе раздела жидкость-жидкости. Кроме того, мы ожидаем, что FRAM обеспечивает новый способ изучения взаимной диффузии или перемешивания между двумя различными поверхностно-активных агентов.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа поддерживается КАИСТ финансируемого К-Долина RED & B Проекта 2014 и исследовательской программы фундаментальной науки в рамках Национального исследовательского фонда Кореи (NRF- 2012R1A6A3A040395, NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
AcetoneOCI corporationAcetone 3.8L Extra PurePurity: > 99.5%, Пожалуйста, ознакомьтесь с паспортами безопасности материалов (MSDS) перед использованием.
Этанолкорпорации OCIЭтанол 3,8 л Экстра ЧистаяЧистота: ≥ 94%, Пожалуйста, ознакомьтесь с паспортами безопасности материалов (MSDS) перед использованием.
Диолеоилфосфатидилхолин, DOPCAvanti Polar Lipids850375CПожалуйста, ознакомьтесь с паспортами безопасности материалов (MSDS) перед использованием. Хлороформ является канцерогеном.
ХлороформLiChrosolvChloroform ultrapure (A3633)Чистота: ≥ 99,8%, Пожалуйста, ознакомьтесь с паспортами безопасности материалов (MSDS) перед использованием. Канцерогенный
родамин DPPEAvanti Polar Lipids810158C, 810158PИзбегайте прямого воздействия света для предотвращения фотообесцвечивания
Тензиометр пластины ВильгельмияR& K Технология ультратонкой органической пленкиТензиометр Вильгельмаhttp://www.rieglerkirstein.de/index.htm
Съемник микропипетокИнструмент СаттераP-1000
МикроинъекторEppendorfFemtojet
МикроманипуляторEppendorfМикроманипулятор 5171
Микроскоп 1Объектив: OlympusОбъектив: UPlanFl 10xОбъектив: 10X NA 0.3
Микроскоп 2Объектив: Olympus, Тубусный объектив: ThorlabsОбъектив: UPlanFl 10xОбъектив: 10X NA 0.3, тубусный объектив: фокусное расстояние 17 см
ПЗС-матрица для микроскопа 1JaiCV 950 камера
ПЗС-матрица для микроскопа 2AndoriXon3 EMCCD
Фильтр Набор фильтровТехнология ChromaКаталожный набор 49004: ET545, T565, ET605Приготовьте подходящий для молекул красителя
ультразвуковой аппаратDAIHAN ScientificWiseclean WUC-D06H

Ссылки

  1. Van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
  2. Christon, R., Even, V., Daveloose, D., Léger, C. L., Viret, J. Modification of fluidity and lipid—protein relationships in pig intestinal brush-border membrane by dietary essential fatty acid deficiency. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 980 (1), 77-84 (1989).
  3. Stubbs, C. D., Smith, A. D. The modification of mammalian membrane polyunsaturated fatty acid composition in relation to membrane fluidity and function. Biochim. Biophys. Acta - Rev. Biomembr. 779 (1), 89-137 (1984).
  4. Holthuis, J. C. M., Menon, A. K. Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis. Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).
  5. Alonso, C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. Keeping lung surfactant where it belongs: protein regulation of two-dimensional viscosity. Biophys. J. 89 (1), 266-273 (2005).
  6. Kim, K., Choi, S. Q., Zell, Z. a, Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. Effect of cholesterol nanodomains on monolayer morphology and dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 110 (33), E3054-E3060 (2013).
  7. Hormel, T. T., Kurihara, S. Q., Brennan, M. K., Wozniak, M. C., Parthasarathy, R. Measuring Lipid Membrane Viscosity Using Rotational and Translational Probe Diffusion. Phys. Rev. Letters. 112 (18), 188101(2014).
  8. Ding, J., Warriner, H. E., Zasadzinski, J. a, Schwartz, D. K. Magnetic needle viscometer for Langmuir monolayers. Langmuir. 18 (13), 2800-2806 (2002).
  9. Dhar, P., Cao, Y., Fischer, T. M., Zasadzinski, J. A. Active interfacial shear microrheology of aging protein films. Phys. Rev. Letters. 104 (1), 1-4 (2010).
  10. Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface. Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).
  11. Choi, S. Q., Steltenkamp, S., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Active microrheology and simultaneous visualization of sheared phospholipid monolayers. Nature Commun. 2 (5), 312(2011).
  12. Caruso, F., et al. Determination of lateral diffusion coefficients in air-water monolayers by fluorescence quenching measurements. J. Am. Chem. Soc. 113 (16), 4838-4843 (1991).
  13. Filippov, A., Orädd, G., Lindblom, G. The effect of cholesterol on the lateral diffusion of phospholipids in oriented bilayers. Biophys. J. 84 (5), 3079-3086 (2003).
  14. Schwille, P., Korlach, J., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy with single-molecule sensitivity on cell and model membranes. Cytometry. 36 (3), 176-182 (1999).
  15. Lopez, A., Dupou, L., Altibelli, A., Trotard, J., Tocanne, J. F. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments under conditions of uniform disk illumination. Critical comparison of analytical solutions, and a new mathematical method for calculation of diffusion coefficient D. Biophys. J. 53 (6), 963-970 (1988).
  16. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
  17. Vaz, W. L., Clegg, R. M., Hallmann, D. Translational diffusion of lipids in liquid crystalline phase phosphatidylcholine multibilayers. A comparison of experiment with theory. Biochemistry. 24 (3), 781-786 (1985).
  18. Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. Lateral diffusion in phospholipid multibilayers measured by fluorescence recovery after photobleaching. Biochemistry. 16 (17), 3836-3841 (1977).
  19. Peters, R., Beck, K. Translational diffusion in phospholipid monolayers measured by fluorescence microphotolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 80 (23), 7183-7187 (1983).
  20. Kuhn, H., Mobius, D., Bucher, H. Physical Methods of Chemistry. Crawley, J. N., et al. 1, Part 3B, 651-653 (1972).
  21. Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 858 (1), 161-168 (1986).
  22. Rotenberg, Y., Boruvka, L., Neumann, A. Determination of surface tension and contact angle from the shapes of axisymmetric fluid interfaces. J. Colloid Interface Sci. 93 (5), 169-183 (1983).
  23. Jeong, D. W., Kim, K., Lee, S., Choi, M. C., Choi, S. Q. Fluorescence recovery after merging a surfactant-covered droplet: a novel technique to measure the diffusion of phospholipid monolayers at fluid/fluid interfaces. Langmuir. 30 (48), 14369-14374 (2014).

Перепечатки и разрешения

Теги

Метод FRAMизмерение поверхностного давленияслияние капельфлуоресцентная микроскопиясмешивание липидных монослоевизмерение коэффициента диффузииграница раздела воздух-вода
Флуоресценции Восстановление после Слияние капли измерить двумерной диффузии фосфолипидов монослоя
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.